微生物实验思考题及微生物实验思考题参考答案及知识要点

微生物实验思考题用油镜观察时应该注意哪些问题？在载破片和镜头之间加滴什么油？起什么作用？答：应该先用擦镜纸将镜头擦干净,以防上次实验的污染.操作时,先低倍再高倍.用完要擦掉油.加滴香柏油。作用：增加折光率,也就是增加了显微镜的分辨率.根据实验体会，谈谈应如何根据所观察微生物的大小，选择不同的物镜进行有效的观察。答：细菌用油镜,真菌用高倍镜.都是先用低倍镜找到目标后,再用高倍镜调到合适的视野和合适的清晰度.放线菌、酵母菌、多细胞真菌相对较大，用放大40倍的物镜就可以看了，细菌小，要用放大1000倍的物镜看，感觉还很小。病毒那就要用电子显微镜看了。哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？答：涂片环节、加热固定环节、脱色环节；其中最关键的环节是脱色环节。进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题？答：着色不均，染色效果不好。阴性阳性不明显分不太清楚,问题是：不便于显微镜下观察是阳性菌还是阴性菌。5、革兰氏染色时，初染前能加碘液吗?乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色?答：不可以。因为碘与染料会结合成大分子，使得染料分子不能穿过细胞的细胞壁，对实验结果造成影响。脱色后复染前，革兰氏阳性菌呈紫色，阴性菌无色。6、不经过复染这一步，能否区别革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌？答：不行。在复染之前，革兰氏阴性菌是无色透明的，在显微镜下很难观察到；或者脱色过度，也会造成阳性菌脱色，不经过复染，无法进一步区别。7、你认为制备细菌染色标本时,应该注意哪些环节?答:1制备适宜的培养基

2在超净工作台上进行,保持无菌环境

3对培养基,接种环等物品的高温高压灭菌.

4倒置培养基,防止冷凝水内流8.为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察?答:1、若未完全干燥,载玻片上的液体会污染油镜镜头。镜头非常精密,被污染后不利于下次观察；2、若未完全干燥，水滴会影响油与玻璃之间折光率，造成视野不够清晰。9.如果涂片未以热固定,将会出现什么问题?加热温度过高、时间太长，又会怎么样呢？答:如果没有加热固定的话，水分蒸发太慢或者在染色时菌体会被冲洗掉；如果加热时间过久，菌体变形或形态破坏，无法染色。10.制备培养基的一般程序是什么？答：称量——溶解—调PH值—融化琼脂—过滤分装—包扎标记——灭菌——倒平板11.做过本次实验后，你认为在制备培养基时要注意些什么问题？答：溶解配料的水要适量；PH要调到7.3左右；要小心手提式高压锅的使用；倒平板时要防止培养基被污染12.灭菌在微生物学实验操作中有何重要意义？答：防止培养基被污染；防止杂菌影响实验结果13.试述高压蒸汽灭菌的操作方法和原理。答：高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。操作方法：加水——装料、加盖——排气——升压、保压、和降压——取料14.高压蒸汽灭菌时应注意哪些事项？答：第一，无菌包不宜过大，不宜过紧，各包裹间要有间隙，使蒸汽能对流易渗透到包裹中央。第二，布类物品应放在金属类物品上，否则蒸汽遇冷凝聚成水珠，使包布受潮。阻碍蒸汽进入包裹中央，严重影响灭菌效果。第三，定期检查灭菌效果。15.试述如何在接种中，贯彻无菌操作的原则?答：保持操作台的无菌状态与在无菌室操作；操作前，要进行手的消毒；接种环要加热灭菌；接种物品要标记。16.以斜面上的菌种接种到新的斜面培养基为例说明操作方法和注意事项。答：在接种箱或者超净工作台上.将母种经过消毒处理以后,在酒精灯火焰区上方打开棉塞.用接种针挑取一小块菌丝体,接入新的试管培养基上即可.17.试设计一个实验，从土壤中分离酵母菌并进行计数。答：无标准答案。18.在酵母菌死活细胞的观察中，使用美蓝液有什么作用？答：区别死活细胞。19.为何要用乳酸-石碳酸溶液作霉菌水浸片？答：用乳酸-石炭酸的优点是可使细胞不变形，具有杀菌、防腐作用；不易干燥，能保持较长时间；能防止孢子四处飞散。20.细菌与霉菌的菌落有何区别？答：细菌菌落光滑，易于基质脱离；霉菌菌落较大、菌丝细长,菌落疏松,呈绒毛状、蜘蛛网状、棉絮状,无固定大小,多有光泽,不易挑。21.如何区分霉菌与放线菌的菌落？什么是扩展性菌落？答：霉菌的菌落形态较大,质地一般比放线菌疏松,细胞分化明显菌丝粗壮有核菌落边缘有粗丝状细胞生长快有霉味。而霉菌往往形成复杂的孢子囊孢子梗等结构。

放线菌菌落小菌丝细而均匀菌落边缘可见细丝状细胞有泥腥味，放线菌的分生孢子形态结构简单。扩展性菌落：就是原本培养的细菌由于发生扩散,形成的一些非预期的菌落,通常这些菌落会影响正常实验观察,可以用药物抑制.22.能否用血球计数板在油镜下进行计数？为什么？答：不能。计数时滴在血球计数板上的是菌悬液，相当于在镜头和计数板直接加了一层水。水层会降低视野的亮度和显微镜的分辨率，造成菌体和网格线不清晰。23.根据自己体会，说明血球计数板计数的误差主要来自那些方面？如何减少误差？答：误差主要来自试剂误差、方法误差、仪器误差；减少误差有保持样品的纯净、细胞溶液必须震荡均匀、样品浓度要适中、血球计数板要整洁清晰。24.菌种保藏中，石蜡油的作用是什么？答：作用是密封。防止空气进入，降低菌种的生理活性。25.经常使用的细菌菌株，使用哪种保藏方法比较好？答：用甘油冷冻保藏方法保存，在液体培养基中加入百分子十五的甘油，然后低温冷冻（-7度）左右。26.食品检验为什么要测定细菌菌落总数？答：测定细菌菌落总数是检验食品纯度程度的指标。也是判断其保存能力的指标。27.实验操作如何使数据可靠?答：1、向平皿倾注液体时,平皿仅微微开启即可；2、检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min.

3、培养液和检液在培养皿内要摇匀；

4、培养液倾注培养皿时温度要在45摄氏度,以免烫死菌落.28.食品中检出的菌落总数是否代表该食品上的所有细菌数？为什么？答：不能代表该食品上所有细菌数。因为在实验过程中会造成细菌的损失或死亡、食品上的细菌包括了各种各样的微生物。29.为什么营养琼脂培养基在使用前要保持在（46±1）℃的温度？答：营养琼脂是用来做菌落总数项目的,如果太热就会将细菌烫死,而太冷则琼脂还没倒就凝固了（凝固点大约在40度）。30.大肠菌群检验中为什么首先要用乳糖胆盐发酵管？答：因为乳糖胆盐发酵管中的成分有溴甲酚紫，中性时呈蓝紫色，酸性时呈黄色，如果颜色不变（呈蓝紫色），说明无产酸的大肠菌群；如果颜色变黄色，说明可能出现能分解乳糖产酸的大肠菌群；胆盐可以抑制其它细菌生长繁殖；看杜氏小管中是否有气体，判断是否为分解乳糖产酸产气的大肠菌群。31.做空白对照实验的目的?答：目的是检验培养基是否受到污染，验证无菌操作。32.为什么大肠菌群的检验要经过复发酵才能证实答：初发酵是样品的发酵结果，不是大肠菌群纯菌的发酵试验，有可能受其它杂菌影响判断结果。进行证实试验避免假阳性结果。33.复发酵为什么使用乳糖发酵管但不需加胆盐?答：胆盐能抑制革兰氏阳性菌等杂菌生长.在初发酵，培养基已经加入胆盐抑制革兰氏阳性菌生长，并在EMB培养基上进行分离培养，因此复发酵培养时无需乳糖发酵管，以免大肠菌肠受到抑制。二.细菌的简单染色和革兰氏染色1.革兰氏染色中那一步是关键?为什么？你是如何操作的？革兰氏染色的关键步骤是：乙醇脱色（是脱色时间）。如果脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片的厚薄，脱色是玻片晃动的快慢及乙醇用量的多少等因素的影响，难以严格规定（脱色是应当控制速度，脱色时间一般为20—30s）。2.固定的目的之一是杀死菌体，这与自然死亡的菌体有何不同？自然死亡的菌体本身已经部分自溶，结构已经改变。固定杀死细菌时细菌结构是保持死亡时的状态的。3.不经复染这一步能否区分革兰氏阳性菌和阴性菌？能。在酒精脱色后，不被酒精脱色而保留紫色者为革兰氏阳性菌（G＋），被酒精脱色为革兰氏阴性菌。最后一步用番红染液复染，是为了让结果更清楚。4.涂片为什么要固定，固定适应注意什么问题？a杀死细菌并使菌体黏附与玻片上；b增加其对染料的亲和力。固定时应注意：手持玻片，菌膜朝上，在微火过3次（手指触摸玻片反面，不烫手为宜），固定时应尽可能维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩。三.霉菌、放线菌的形态观察1.镜检时，如何区分基内菌丝与气生菌丝？一般气生菌丝颜色较深，直生或分枝丝状，比基内菌丝粗；而基内菌丝色浅、发亮，可看到横隔膜，继而断裂成球状或杆状小体。2.显微镜下细菌放线菌酵母菌和霉菌的主要区别是什么？放线菌与细菌需要在油镜下才能观察清楚，而霉菌和酵母菌在低倍镜下即可看到。细菌：为细而短的单细胞微生物（个体微小），主要形态有：球、杆、螺旋状等。（部分杆菌还可形成芽孢）放线菌：存在分枝丝状体和菌丝体，革兰氏阳性菌，有孢子丝和孢子（球形、椭圆形、杆状、柱状）。酵母菌：单细胞，菌体呈圆球、卵形或椭圆形，少数呈柠檬形、尖形等。菌体比细菌大几倍到几十倍，部分处于出芽繁殖过程中菌体还可观察到芽体，大多数菌体上还有芽痕。霉菌：菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多，常是细菌菌体宽度的几倍到几十倍，在低倍镜下即可看到，并还可看到孢子囊梗、囊轴、孢子囊、包囊孢子等。四.玻璃器皿的洗涤、包扎与灭菌1.高压蒸汽灭菌开始时为什么要将锅内排尽？灭菌后为什么要待压力降低到“0”因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡（压力突然下降而发生复沸腾）而冲出烧瓶口或试管口，造成培养基等液体沾湿棉塞或溢出等事故。2.设计实验方案，比较干热灭菌和湿热灭菌的效果。以下试验方案有关操作均遵循无菌操作条件和等量原则。实验材料试管镊子酒精灯嗜热脂肪芽孢杆菌ATCC7053菌片纸片（与菌片同大小同材料）溴甲酚紫蛋白冻水培养基（已灭菌）等实验材料（材料有余）。对照组取9支洁净试管，分为A1B1C1三组（每3支一组），将A1组中放入菌片，B1组中放入纸片，C1组中什么也不加；不经灭菌，直接加入溴甲酚紫蛋白冻水培养基（等量）。恒为培养将上述所有试管按分组在56℃3.为什么干热灭菌比湿热灭菌所需温度高时间长？在湿热条件下，有水蒸汽的作用：a高温水蒸汽导热比干空气要快；b高温水蒸汽冷凝变水时有放热过程；c高温水蒸汽能穿透细菌的细胞膜，直接进入细胞内破坏细胞；c高温水蒸汽能水解一部分细胞结构，加速导热。（湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；湿热的穿透力比干热大；湿热的蒸汽有潜热存在，每1克水在100℃时，由气态变为液态时可放出2．26kJ（千焦）的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。五.培养基的配置1.配制牛肉膏蛋白胨培养基，有哪些操作步骤？那几步易出错，如何防止？称取药品—加热溶化—分装—加棉塞—包扎—灭菌—搁置斜面易出错的步骤有：a称取药品称取时钥匙专用，瓶盖不要错盖，易吸水的药品要快速称取；b加热溶化加入药品后要用玻璃棒不停搅拌，以免糊底（在琼脂熔化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器，同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。）；c分装分装时培养基不能粘在三角瓶（或试管）口，以免接种时染菌；d搁置斜面斜面长度约试管长度一半为宜。2.配制培养基的一般原则是什么？a目的明确b营养协调c理化适宜d经济节约六.平板菌落计数法1.平板菌落计数法的原理是什么?它适用于那些微生物的计数？平板菌落计数法是将等测样品经适当稀释后，其中的微生物充分分散为单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成的肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。（但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2~3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。现在常使用菌落形成单位）。平板计数法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个微生物繁殖而形成的现象进行的，也就是一个菌落可代表一种微生物（并不绝对)。通常用来测定样品中所含细菌、孢子、酵母菌等单细胞微生物的数量。2.菌落样液移入培养皿后，若不尽快地倒入培养基并充分摇匀，将会出现什么结果？为什么？出现的结果是：形成菌落过于集中，不能形成均匀分布的单菌落，导致无法计数。因为：若不立即摇匀，菌体常会吸附在皿底上，不易形成均匀分布的单菌落，从而影响计数的准确性。3.要获得本次试验的成功，那几步最为关键？为什么？a稀释菌液若在稀释时移液管混用可使稀释梯度不准确，从而导致计数误差（放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液，否则稀释不精确，结果误差大。）；b稀释倒平板1若再加入菌液不立即倒入培养基，可使菌体黏附于皿底；2若不注意培养基温度，温度过高会将菌体烧死，温度过低会使培养基一倒入立即凝固，从而菌体不能均匀分布；3倒入培养基需立即摇匀，否则菌体常会吸附在皿底上，不易形成均匀分布的单菌落，从而影响计数的准确性；4选择倒平板的稀释梯度也是很重要的，一般以三个连续稀释度中的第二个稀释度倒平板后所出现的平均菌落数在50个左右为宜，否则要适当增加（或减少）稀释度加以调整。4.平板菌落计数法与显微镜直接计数法相比有何优缺点？微生物显微镜直接计数法随机性大,所以对菌体数量不能做出较为宏观,全面的反应.显微镜直接计数法一般与血球计数板配套使用.但显微镜直接计数法的优点是快速,观察到马上可以计数，而计的是相应微生物总数。平板菌落计数法最大的缺点是速度慢,需要平板上长出菌落一段时间后才能计数.但是由于平板菌落计数法通常做梯度稀释,所以计数的线性范围大.由于是菌悬液涂布,所以比较均匀,能较好的反应菌落的疏密程度.重复性,平行性很好,而计的是活菌数。是经典的计数方法.七.显微镜直接计数法1.为何用血细胞计数板可计得样品总菌值？叙述其适用范围。a计数室体积一定；b在显微镜下，不经染色不能分辨菌体的死活，使计数所得的数目为一定体积内的总菌数，从而计得样品中总菌值。适用范围：可单细胞存在的细菌酵母菌或显丝状生长的真菌，放线菌所生的孢子等。2.为什么计数室内不能有气泡？试分析产生气泡的可能原因。a气泡会占据计数室的空间，导致计数室中的菌体个数计数偏小，最后导致计数结果偏小。b计数室内的气泡，可影响菌液的随机分布，使计数产生误差。产生气泡原因：a操作不当，先放菌液再盖盖玻片；b计数室洗涤不干净；c盖玻片移动，造成空气进入而产生气泡。3.试分析影响本实验结果的误差来源及提出改进措施？1、仪器误差：所用器材均应清洁干净，并且计数板计数区不应该有擦痕。2、计数室内可能有气泡。因为酵母细胞并没有染色，看起来是透明的，有气泡很容易被计入，使数值偏高；并且，气泡会影响菌悬液的随机分布。

改进：若产生气泡，则用吸水纸吸出。3、菌体在计数板上分布不均，当用选取5格计数时，会造成很大误差。改进：应使菌液自然流入并混匀，进行观察时尽可能多数几个格子。4、配制稀释液时吸取的浓度过高或过低，导致稀释液浓度和原液不成正确比例，计算时产生误差。应将原液摇晃均匀后取中部的液体进行稀释。5、由于数菌体数目时视觉疲劳而导