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第第页乙醇酸氧化酶（glycollicoxidase,GO）试剂盒说明书乙醇酸氧化酶（glycollicoxidase,GO）试剂盒说明书微量法100T/96S注意：正式测定之前选择23个预期差异大的样本做预测定。测定意义：乙醇酸氧化酶（EC1.1.3.1）是植物光呼吸代谢中的关键酶，也是光下合成草酸的关键酶，它催化乙醇酸氧化生成乙醛酸，对研究光呼吸代谢过程及其调控具有重要意义。测定原理：乙醇酸氧化酶催化乙醇酸氧化生成乙醛酸，乙醛酸和盐酸苯肼反应生成乙醛酸苯腙，在324nm有特征吸收峰。自备实验用品及仪器：天平、低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板（UV板）。试剂组成和配制：提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。试剂一：液体15mL×1瓶，4℃保存。试剂二：粉剂×1瓶，4℃避光保存，临用前加5mL双蒸水溶解；用不完的试剂分装后20℃保存，禁止反复冻融。试剂三：液体2mL×1支，4℃保存。酶液提取：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。12000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。测定操作表：测定管样本（μL）10试剂一（μL）130试剂二（μL）40试剂三（μL）20充分混匀，立即于微量石英比色皿/96孔板中测定324nm处10s和190s吸光值A1和A2，△A=A2A1酶活性计算公式：a．用微量石英比色皿测定的计算公式如下1．按照蛋白浓度计算酶活性定义：每毫克蛋白每分钟氧化1nmol乙醇酸所需的酶量为一个酶活力单位。GO活性（nmol/min/mgprot）=×V反总÷（V样×Cpr）÷T=392×△A÷Cpr2．按照样本质量计算酶活性定义：每克组织每分钟氧化1nmol乙醇酸所需的酶量为一个酶活力单位。GO活性（nmol/min/g鲜重）=×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T=392×△A÷Wε：乙醛酸苯腙毫摩尔消光系数：17L/mmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应总体积，0.2mL；V样：反应中样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W，样本质量，g；T：反应时间，3minb.用96孔板测定的计算公式如下1．按照蛋白浓度计算酶活性定义：每毫克蛋白每分钟氧化1nmol乙醇酸所需的酶量为一个酶活力单位。GO活性（nmol/min/mgprot）=×V反总÷（V样×Cpr）÷T=784×△A÷Cpr2．按照样本质量计算酶活性定义：每克组织每分钟氧化1nmol乙醇酸所需的酶量为一个酶活力单位。GO活性（nmol/min/g鲜重）=×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T=784×△A÷Wε：乙醛酸苯腙毫摩尔消光系数：17L/mmol/cm；d：比色皿光径，0.5cm；V反总：反应总体积，0.2mL；V样：反应中

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