生物催化剂的修饰与改造

关于生物催化剂的修饰与改造

第一节酶化学修饰及修饰目的一、酶化学修饰

1.限制酶大规模应用的原因：

1)细胞外稳定性差；

2)酶活性不够高；

3)具有抗原性。

第2页,共47页，2024年2月25日，星期天2.改变酶特性有两种主要的方法：

1)通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的活性。

2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的。第3页,共47页，2024年2月25日，星期天3.酶化学修饰的概念酶的化学修饰（chemicalmodification）：通过化学基团的引入或除去，使蛋白质共价结构发生改变。酶选择性化学修饰：描述肽链侧链基团被化学试剂专一性地修饰。第4页,共47页，2024年2月25日，星期天二、酶化学修饰的目的1.研究酶的结构与功能的关系。（50年代末）2.人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用范围。（70年代末之后）1）提高酶的生物活性（酶活力）。过氧化氢酶用右旋糖酐修饰后，在有机溶剂中的溶解性和酶活性也得到提高，如在三氯乙烷中酶活是天然酶的200倍，在水溶液中酶活是天然酶的15-20倍。

第5页,共47页，2024年2月25日，星期天2）增强酶的稳定性（热稳定性）。α-胰凝乳蛋白酶表面的氨基修饰成亲水性更强的-NHCH2COOH后，该酶抗不可逆热失活的稳定性在60°可提高1000倍。这种稳定的酶能经受灭菌的极端条件而不失活。

3）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）。4）产生新的催化能力。木瓜蛋白酶用黄素共价结合修饰后，蛋白酶变成氧化还原酶。第6页,共47页，2024年2月25日，星期天

第二节酶化学修饰的原理一、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性

修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。使酶的天然构象产生“刚性”结构。二、如何保护酶活性部位与抗抑制剂大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。第7页,共47页，2024年2月25日，星期天三、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：1.大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。2.酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。第8页,共47页，2024年2月25日，星期天四、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境1.酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。破坏了抗原决定簇——抗原性降低乃至消除“遮盖”了抗原决定簇——阻碍抗原、抗体结合2.大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表面形成“缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化，维持酶活性部位微环境相对稳定。第9页,共47页，2024年2月25日，星期天

第三节酶化学修饰的设计

一、充分认识酶分子的特性包括酶的——1.活性部位情况

2.稳定条件及反应最佳条件

3.侧链基团的化学性质及反应活泼性第10页,共47页，2024年2月25日，星期天二、修饰剂的选择要考虑——

1.修饰剂的分子量及链的长度（要求有较大的分子量）

2.修饰剂上反应基团的数目及位置（要求有较多的反应活性基团）

3.修饰剂上反应基团的活化方法与条件第11页,共47页，2024年2月25日，星期天三、反应条件的选择要注意——1.酶与修饰剂的分子比例

2.反应体系的溶剂性质、盐浓度、pH条件

3.反应温度及时间第12页,共47页，2024年2月25日，星期天第四节酶化学修饰的种类及应用

一、酶的表面化学修饰

（一）大分子修饰（大分子结合修饰）是目前应用最广的酶分子修饰方法。

1.定义：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。第13页,共47页，2024年2月25日，星期天2.修饰剂：聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。修饰方法：修饰前活化，然后在一定条件下与酶分子共价结合。第14页,共47页，2024年2月25日，星期天3.应用：如：PEG－超氧化物歧化酶（SOD）

PEG－人血红蛋白

PEG－天门冬酰胺酶（ASNase）降低了抗原性延长了酶在体内的半衰期又如：用Dextran修饰

-淀粉酶，－淀粉酶，胰蛋白酶、过氧化氢酶，提高了酶的热稳定性。第15页,共47页，2024年2月25日，星期天（二）小分子修饰（酶蛋白侧链基团修饰）定义：采用小分子试剂使酶分子侧链上特定的功能基团发生化学反应。侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。主要有：氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。侧链基团修饰剂：采用的各种小分子化合物。

20种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的侧链易被修饰，它们一般具有亲核性。第16页,共47页，2024年2月25日，星期天根据氨基酸侧链R基的极性，20种氨基酸可分成4类。

1.非极性R基氨基酸（共8种）：丙氨酸(Alanine,Ala,A),

亮氨酸(Leucine,Leu,L),

缬氨酸(Valine,Val,V)),

异亮氨酸(Isoleucine,Ile,I),

苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe,F),

色氨酸(Tryptophan,Trp,W),

甲硫氨酸(Methionine,Met,M),

脯氨酸(Proline,Pro,P)第17页,共47页，2024年2月25日，星期天2.无电荷的极性R基氨基酸（共7种）：丝氨酸(Serine,Ser,S),苏氨酸(Threonine,Thr,T),酪氨酸(Tyrosine,Tyr,Y),半胱氨酸(Cysteine,Cys,C),天冬酰胺(Asparagine,Asn,N),甘氨酸(Glycine,Gly,G),谷氨酰胺(Glutamine,Gln,Q)3.带正电荷的极性R基氨基酸（共3种）：赖氨酸(Lysine,Lys,K),精氨酸(Arginine,Arg,R),组氨酸(Histidine,His,H)4.带负电荷的极性R基氨基酸（共2种）：天冬氨酸(Asparticacid,Asp,D),谷氨酸(Glutamicacid,Glu,E)第18页,共47页，2024年2月25日，星期天几种重要的修饰反应：烷基化反应酰化反应氧化还原反应芳香环取代反应第19页,共47页，2024年2月25日，星期天1.化学修饰反应的类型

1)烷基化反应试剂特点：烷基上带活泼卤素，导致酶分子的亲核基团（如－NH2，-SH等）发生烷基化。可作用基团：氨基（Lys，Arg），巯基（Cys），羧基（Asp、Glu），甲硫基（Met），咪唑基（His）。修饰剂：2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。第20页,共47页，2024年2月25日，星期天烷基化反应第21页,共47页，2024年2月25日，星期天

2)酰基化反应试剂特点：含有结构，作用于侧链基团上的亲核基团，使之酰基化。可作用基团：氨基，巯基，醇羟基（Ser、Thr），酚羟基（Tyr）第22页,共47页，2024年2月25日，星期天酰基化反应

第23页,共47页，2024年2月25日，星期天3)氧化和还原反应试剂特点：具有氧化性或还原性。氧化剂：H2O2，N-溴代琥珀酰亚胺可被氧化的侧链基团：巯基，甲硫基，吲哚基（Trp）、咪唑基，酚基等。还原剂：2－巯基乙醇、DTT等。可被还原的侧链基团：二硫键。第24页,共47页，2024年2月25日，星期天连四硫酸盐氧化巯基，DTT还原逆回，用于保护巯基。第25页,共47页，2024年2月25日，星期天

4)芳香环取代反应试剂：卤（碘）化，硝化试剂。碘代：

I2＋

+HI

硝化：

(NO2)4C+

+(NO2)3CH

（四硝基甲烷）第26页,共47页，2024年2月25日，星期天2.特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰1)氨基的化学修饰：来源：Lys,Arg,His,Gln修饰反应：酰基化与烷基化酰基化修饰剂:

三硝基苯磺酸（TNBS）、丹磺酰氯（DNS）烷基化修饰剂：

2，4－二硝基氟苯（DNFB）、碘乙酸、碘乙酰胺、亚硝酸等第27页,共47页，2024年2月25日，星期天第28页,共47页，2024年2月25日，星期天2)羧基的化学修饰修饰羧基的反应专一性较差。常用水溶性碳化二亚胺修饰天冬氨酸和谷氨酸。可定量测定酶分子中羧基的数目。

+

水溶性碳化二亚胺第29页,共47页，2024年2月25日，星期天3)胍基的化学修饰来源：Arg修饰反应：本质上是羰基对氨基酰基化。修饰剂：

丁二酮二羰基化合物

1，2－环己二酮苯乙二醛第30页,共47页，2024年2月25日，星期天第31页,共47页，2024年2月25日，星期天4)巯基的化学修饰来源：Cys

修饰反应:烷基化修饰剂：碘乙酸(IAA)

碘乙酰胺(IAM)

E-SH+R-X－>E-SR+HXN-乙基马来酰亚胺（NEM）（常用的专一修饰巯基试剂）E－SH＋

第32页,共47页，2024年2月25日，星期天5)二硫键的化学修饰还原：巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）第33页,共47页，2024年2月25日，星期天氧化：过甲酸:Performicacid第34页,共47页，2024年2月25日，星期天

6)咪唑基的化学修饰

来源：His

修饰反应:酰基化与烷基化

酰基化修饰剂:

常用焦碳酸二乙酯（diethylparacarbonate）

+

+C2H5OH+CO2

烷基化修饰剂：碘乙酸+ICH2COOH

+HI第35页,共47页，2024年2月25日，星期天7）酚羟基的化学修饰来源：Tyr修饰反应：芳香环取代反应修饰剂：碘、硝化试剂（四硝基甲烷）第36页,共47页，2024年2月25日，星期天8）吲哚基的化学修饰来源：Trp

修饰反应：氧化反应修饰剂：

N-溴代琥珀酰亚胺

2-羟基-5硝基苄溴第37页,共47页，2024年2月25日，星期天氨基酸侧链基团修饰剂Lys氨基三硝基苯磺酸、丹磺酰氯；2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、亚硝酸Asp、Glu羧基水溶性碳化二亚胺Arg胍基苯乙二醛，1,2－环己二酮、丁二酮Cys巯基碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基马来酰亚胺二硫键巯基乙醇、DTTHis咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸Tyr酚羟基碘、四硝基甲烷Trp吲哚基N-溴代琥珀酰亚胺

各种氨基酸侧链的修饰剂第38页,共47页，2024年2月25日，星期天

但解释修饰效果须十分小心，因为：①任何一种修饰剂不是绝对专一的。②有些修饰剂引起蛋白质构象变化——失活，不一定是活性中心基团被共价修饰。③不同部分的相同基团，修饰效果不同，分子内部的必需基团，不易被修饰。第39页,共47页，2024年2月25日，星期天蛋白质化学修饰的局限性化学修饰的专一性是相对的；酶的构象有些改变；化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行。第40页,共47页，2024年2月25日，星期天（三）交联修饰（交联法）用双功能基团试剂(如戊二醛)，与酶分子内不同肽链部分共价交联，使酶分子空间构象更加稳定。分子间交联、分子内交联（四）固定化修饰（共价偶联法）通过酶表面的酸性或碱性残基，将酶共价连接到惰性载体上，由于酶所处的微环境发生改变，使酶的最适pH、最适温度和稳定性发生改变。第41页,共47页，2024年2月25日，星期天二、酶分子内部修饰（一）蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰）

蛋白主链修饰采用酶法（用专一性较强的蛋白酶或肽酶为修饰剂）。（与前面化学修饰区别）

第42页,共47页，2024年2月25日，星期天

酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况中的一种：1引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。2仍维