核酶的作用方式与研究技术进展

关于核酶的作用方式与研究技术进展主要内容核酶的定义及概述核酶产生的背景核酶的种类核酶的催化机制核酶的研究方法核酶的应用前景和挑战参考文献核酶的定义及概述核酶(ribozyme)最初被定义为一类具有催化活性的RNA，即化学本质是核糖核酸(RNA)，却具有酶的催化功能。核酶的作用底物可以是不同的分子，有些作用底物就是同一RNA分子中的某些部位。核酶的功能很多，有的能够切割RNA，有的能够切割DNA，有些还具有RNA连接酶、磷酸酶等活性。总之，核酶的化学本质与由蛋白质构成的酶完全是不同的。但是，核酶与酶具有很相似的催化特性，并且与蛋白质酶相比，核酶的催化效率较低，是一种较为原始的催化酶。随着生物学的发展，核酶不仅仅只是包括RNA，如今人们还人工合成了一些DNA也具有催化活性。所以现在的核酶应该包括催化性DNA和催化性RNA两大类，即：具有催化功能的RNA称为酶性RNA，又称核酶(ribozyme，Rz)；具有催化功能的DNA称为酶性DNA，又称脱氧核酶(deoxyribozyme，DRz)，两者统称核酶(nucleozyme)。核酶产生的背景核酶的发现，不仅颠覆了酶的本质是蛋白质这一概念，还引出了“RNA世界”的假说。该假说认为RNA在生命进化的早期阶段具有非常重要的作用。20世纪80年代初，由美国科罗拉多大学托马斯·切赫（ThomasCech）等在研究四膜虫rRNA前体中发现了与蛋白质无关的拼接过程，即在鸟苷和Mg2+存在下发生的自我催化作用，可将rRNA前体中存在的链长414个核苷酸的内含子切下。这一段切下来的L19RNA具有很强的酶活性，它既能使核苷酸聚合成多核苷酸，又能将多核苷酸切成不同长度的片断，因此将这一L19RNA片断称为酶性RNA，又称核酶(ribozyme)，它集信息和催化功能于一身，由此提出了核酶的概念；时隔不久，耶鲁大学的Altman在大肠杆菌中发现了RNaseP，该加工酶RNaseP(由蛋白质和RNA组成的复合物，催化切除tRNA前体的5‘端冗长序列，故也叫tRNA5’-成熟酶)中的RNA(绝对不含蛋白质)，在特定条件下，具有与RNaseP全酶相同的催化活性，即单独RNaseP-RNA能使tRNA的5‘端成熟；Cech和Altman于1989年共同获得了诺贝尔化学奖；1995年~1996年澳大利亚Symons实验室在研究拟病毒等的复制机制时发现，通过滚环复制生成复制单体是自动进行的，因为它们具有能催化自我剪切（self-cleavage）的“锤头结构”；2000年研究证明核糖体也是核酶，具有肽基转移酶的功能。核酶的种类具有催化功能的RNA称为酶性RNA，又称核酶(ribozyme，Rz)；具有催化功能的DNA称为酶性DNA，又称脱氧核酶(deoxyribozyme，DRz)。1.核酶(ribozyme，Rz)Rz广泛存在于由低等到高等的多种生物中，参与细胞内RNA及其前体的加工和成熟过程。目前人们已发现了七大类自然存在的核酶，即第一类内含子（group1intron）、第二类内含子（group2intron)、RNaseP亚基（RNAsubunitofRNaseP）、锤头型核酶（hammerheadribozyme）、发夹型核酶（hairpinribozyme）、肝炎ƍ病毒（hepatitisdeltavirus,HDV）核酶、和VS核酶（Neurosporavarkudsatelliteribozyme）。根据分子大小，可将它们分成大分子核酶（包括第一类内含子、第二类内含子和RNaseP的RNA亚基）和小分子核酶（锤头型核酶、发夹型核酶、肝炎ƍ病毒和VS核酶）。自然界中的Rz多在分子内起作用(除RNaseP和核糖体外)，即Rz的活性区域与作用底物序列在同一条链上，其底物主要是带有磷酸二酯键的核酸（非核酸底物的Rz自然界是否存在仍无定论）。1.1大分子核酶大分子核酶又分为第1类内含子、第2类内含子和核糖核酸酶P（RNaseP）的RNA亚基等3种，它们都是由几百个核苷酸组成的结构复杂的大分子。大分子核酶可以看成是金属酶，其催化作用与金属离子尤其是二价离子密不可分，这些金属离子或者作为广义酸碱，或者作为路易斯酸碱催化内含子的剪接。第一类内含子

存在于各类生物的细胞器基因和核基因中，甚至在噬菌体中也有发现。其代表分子有：四膜虫mRNA前体，藻类线粒体mRNA和tRNA前体，玉米及豆类叶绿体rRNA前体，T4噬菌体胸腺嘧啶合成酶转录产物。其中纤毛原生动物四膜虫（

trahymena）的大rRNA前体的剪接机制很早就已经相当清楚，从而成为第一类内含子剪接机制的模型。固氮弧菌属中第一类内含子的共同组装过程第二类内含子

第二类内含子的代表分子是酵母线粒体细胞色素氧化酶mRNA前体，真核snRNA前体。这两类内含子的区别在于第一类内含子有一个由10-12个碱基的保守序列构成的“中心核心结构”（centralcorestructure），而第二类没有。RNaseP

RNaseP是一种由RNA和蛋白质构成的复合体，其中的RNA是真正的活性中心，蛋白质部分只是起支持结构的功能。RNaseP是一种核酸内切酶，它参与加工tRNA的初始转录产物，所有的tRNA5’末端都由该酶催化产生。1.2小分子核酶小分子核酶比较常见的有4种，锤头型、发夹型、HDV、VS核酶。目前，锤头型和发夹型核酶是研究最多的。小分子核酶有一些共同的特征，首先与前面提及的大分子核酶相比较小，其次它们都天然的与其发生作用的RNA的复制过程有关，最后在各种情况下经由它们产生的催化作用都将产生5-羟基末端和2，3-环状磷酸基末端。另外其催化机理与其分子结构密切相关，金属离子或特定碱基都可作为催化反应的关键成分。锤头状核酶

活性中心由11个保守的核苷酸和数目不等的非保守核苷酸序列组成，即：5’GAAA(N)nNUH(N)n，CUGA(N)nGA3’，它能结合含有NUH序列的底物RNA，其中N代表A、C、G，但更偏好G；H代表C、U、A，但更偏好C。在其活性中心两端含有与底物RNA结合位点NUH两侧互补的序列(FigA)。(A)Hammerheadribozyme发夹状核酶

发夹状核酶(hairpinribozyme)是一种具有自剪切催化功能的小分子核糖核酸，是人们首次在烟草环斑病毒卫星RNA(TobaccoringspotvirussatelliteRNA，sTRSV)的负链上发现的，因其活性中心的二级结构形似发夹而得名。与其它类型的核酶相比，发夹状核酶具有对金属离子和酸碱度变化依赖小等特点，因此有很高的应用价值。发夹状核酶有多个螺旋区域，同样与底物形成2个螺旋区(FigB)．(B)Hairpinribozyme2.脱氧核酶(deoxyribozyme，DRz)脱氧核酶DRz是利用体外分子进化技术获得的一种具有高效催化活性和结构识别能力的单链DNA片段。DRz的活性部位能在原子水平上区分底物，并催化类似反应。所有的DRz都是单链分子，如同单链RNA分子一样，能进行折叠、催化和展现酶活性。通过实验创造的DRZ连续被发现并且催化性能不断提高。自1994年首次发现脱氧核酶以来，迄今已发现的DRz有几十种。根据其功能可分为7大类：1．具有RNA切割活性；2．具有DNA连接酶活性；3．具有卟啉金属化酶和过氧化酶活性；4．具有DNA水解活性；5．具有DNA激酶活性；6．具有N2糖基化酶活性；7．具有DNA戴帽活性。但有类似催化活性的DRz在自然界中还没找到。在所有的DRz中，最特别的是具有RNA切割活性的DRZ，它能催化RNA特定部位的切割反应，从mRNA水平对基因灭活，从而调控蛋白质的表达，可能成为对抗病毒感染、肿瘤等疾病的新型基因治疗药物和基因功能研究、核酸突变分析等的新型核酸工具酶。目前发现多种此类DRz，最主要的2种是Santoro等从1014个随机序列中通过体外PCR筛选法获得的第10轮循环的第23个和第8轮循环的第17个克隆，分别命名为“10-23DRz”和“8-17DRz”，其中对10-23DRz家族的研究最深入。10-23型脱氧核酶的结构8-17型脱氧核酶的结构核酶的催化机制大型核酶的催化机制小型核酶的催化机制大型核酶的催化机制第一类内含子与第二类内含子通过一种两步反应来切割初始转录物，进而将外显子连接起来，产生成熟的RNA。RNaseP是产生tRNA5’端的核酶，所有的tRNA5’端都由它产生。它们的催化反应发生时都伴随有磷酸基团的变构。第一类内含子的催化机制第一类内含子的催化过程如下：第一步，鸟嘌呤单核苷酸的3’-OH进攻切割位点的5’磷酸，产生游离的5’外显子。这一步只能由鸟嘌呤核苷酸来催化，但可以是单核苷酸，也可以是二核苷酸或三核苷酸，这表明此反应不需能量的介入；第二步，游离的5’外显子的3’-OH进攻3’切割位点的磷酸，两个外显子连接起来同时游离出带有外来鸟嘌呤的内含子。这两步都是可逆的。内部引导序列（IGS）可以与底物部分配对，进而来定位切割位点。切割下来的内含子又进一步自身环化，去除一小段核苷酸，产生内含子核心L-19。第一类内含子的自剪接反应第二类内含子的催化机制第二类内含子的催化过程如下：第一步，内含子里面（与第一类内含子不同）一个保守的腺嘌呤残基的2’-OH进攻5’磷酸，产生5’游离外显子和由3’外显子与内含子构成的中间体；第二步，5’游离外显子的3’游离羟基进攻3’切割位点的磷酸，两个外显子连接起来，并切割下内含子。RNaseP的催化机制RNaseP催化所有tRNA的5’末端的形成，但是由于tRNA的5’末端没有保守序列，人们认为RNaseP是通过识别底物的三级结构来完成的。其催化反应需要二价阳离子（如Mg2+或Mn2+）和一价阳离子（如k+或NH4+）的共同参与。其中一价离子在反应中主要用来稳定结构，而二价离子不仅对于稳定结构，而且对于切割是必需的。在切割反应中，金属离子活化的氢氧根被用作亲核试剂。小型核酶的催化机制锤头型核酶的催化机理锤头型核酶对切割位点的识别遵守NHH规则（N代表任意核苷酸，H代表A，U或C）。它的催化过程需要二价金属离子（如镁离子）的参与，人们提出两种催化机理：单金属离子催化和双金属离子催化。图5锤头型核酶两种可能的催化机理（a）单金属离子催化；（b）双金属离子催化

。单金属离子催化机理如图a，在这个模型中，金属氢氧化物作为广义碱从2’OH接受质子。活化的2’氧作为亲核试剂进攻切割位点的磷酸。双金属离子机理如图b。A位点的金属离子作为路易斯酸（Lewisacid）接受2’氧的电子，使2’OH去质子更容易。B位点的金属离子也作为路易斯酸接受5’氧的电子，使O-P键极化且键合力减弱，从而使氧原子更容易游离出来。HDV核酶的催化机理现在被普遍接受的催化机理如图所示。在基态时金属离子结合于切割位点处未成桥的氧原子上，但是在自切割过程中金属离子脱离了与氧原子的直接联系，转而通过一种远距离的作用力与之作用。另外，底物的5’端序列对切割反应有一定影响。HDV核酶可能的催化机理发夹状核酶的催化机理顺式切割发夹型核酶的底物部分与核酶的其余部分是分离的，底物切割位点必须含有RYN*GUC这样一个序列，R代表嘌呤核苷酸，Y代表嘧啶核苷酸，N可以是任何核苷酸。催化发生时，发夹型核酶通过反式转酯反应于图（b）的箭头处切割底物，产生5’-OH和2’，3’-环磷酸末端。核酶的研究方法为了寻找新的和更高效的Rz和DRz，参照RNA分子进化技术提出了Rz和DRz的离体筛选方法。目前，一般认为Rz和DRz的筛选途径有2种，一种是利用天然的RNA或DNA分子在体外筛选出具酶活性的RNA或DNA分子，另一种是通过人工合成并在体外筛选出具酶活性的小片段的RNA或DNA分子。但是第一种途径，在筛选的过程中具有一定的不准确性，通常不被采用，而第二种途径的筛选过程无以上缺点，是一种被普遍采用的筛选途径。自上世纪90年代初初步建立核酶体外筛选法（通常称作SELEX法）以来，至今已利用这一方法制造出无数自然界尚未发现的核酶，以及脱氧核酶和RNA/DNA嵌合核酶。SELEX技术SELEX技术即指数富集的配基系统进化技术(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment，SELEX)。利用该技术可以从随机单链核酸序列库中筛选出特异性与靶物质高度亲和的核酸适体(Aptamer)。核酶的应用前景和挑战核酶是一类具有催化活性的小RNA分子，可以特异性地识别并结合目标基因mRNA，使该mRNA断裂失活，从而阻断或降低目标基因的表达，起到基因沉默的作用。此外，核酶不会对细胞基因组产生任何副作用，因此核酶作为一种既安全又有效的分子生物学工具受到越来越多研究者的关注。核酶的应用核酶在植物抗病毒领域的研究核酶在动物疾病治疗中的研究核酶在人类疾病治疗中的研究核酶在植物抗病毒领域的研究抗烟草花叶病毒烟草花叶病毒（TMV）是分布广泛、侵染性很强的一类植物病毒，能感染30个科中的199种植物，在我国严重危害烟草、蔬菜和花卉等植物。近年来，随着人们对核酶研究的不断深入，利用核酶进行抗病毒研究已成为新的热点。许多研究者根据烟草花叶病毒基因组的基本结构，成功设计了针对TMV不同识别位点的核酶，取得令人兴奋的成果。杨建华等（1998）将设计的特异切割烟草花叶病毒RNA的锤头型核酶Rz-2转化烟草原生质体，通过检测TMVc对烟草原生质体的侵染性发现，转基因原生质体中TMV侵染性明显低于未转基因的对照组。抗水稻条纹叶枯病毒水稻条纹叶枯病是水稻的主要病毒病害之一。我国从1964年第1次报道该病发生，至今多次暴发流行，对水稻生产构成严重威胁。引起该病的水稻条纹叶枯病毒（Ricestripevirus，RSV），为一类特殊的单链、多组分RNA病毒。刘力等（1996）根据RSV序列，在分析其分子结构及病理特性的基础上设计合成了特异切割水稻条纹叶枯病毒RNA保守区及病害特异性蛋白（Diseasespecificprotein，DSP）基因的核酶，体外切割实验表明，所设计的核酶具有特异切割RSV病毒的活性。抗马铃薯卷叶病毒马铃薯卷叶病毒（Potatoleafrollvirus，PLRV）是一种严格由蚜虫以持久方式传播的病毒，属黄化病毒组（Luteovirus），可引起马铃薯植株黄化、矮缩、卷叶、僵化等症状。PLRV是单链正链RNA，在寄主细胞内PLRV先转录成负链RNA，再以负链RNA为模板合成病毒正链RNA。1990年，LambJW等设计了2个针对PLRV正链RNA的核酶，能体外切割PLRV（英国苏格兰分离株）的CP基因和复制酶基因。核酶在动物疾病治疗中的研究核酶对动物病毒病的治疗ZOU等(2003)针对鹅副黏病毒F基因设计了锤头状核酶RzF598，并将该核酶基因连入真核表达载体pcDNA3上，然后用该重组质粒转染鸡胚成纤维细胞，以pcDNA3空质粒和无效突变体dRzF598重组质粒作对照；结果显示转染成功并表达了核酶RzF598的细胞对病毒的抵抗能力大大提高，细胞成活率高达80％以上，而对照组细胞的成活率仅5％左右。核酶对动物寄生虫病的治疗陈丽凤等(2007)为研究犬贾第虫滋养体核仁功能性蛋白KRRl对贾第虫pre-RNA合成的影响，用犬贾第虫病毒(Giardiacanisvirus，GCV)作为转染载体，将两端携带反义KRRl基因的锤头状核酶插入到载体中，构建出两种重组质粒KRzS和KRzL；然后用实时荧光定量RT-PCR法检测核酶对KRRl基因mRNA的切割活性；结果显示KRzS、KRzL转录体对KRRl基因体外转录RNA切割效率分别为74.0％和81.1％，而对照组仅为12.0％，说明贾第虫病毒介导的锤头状核酶能有效切割KRRl基因的体外转录体。核酶在人类疾病治疗中的研究核酶对艾滋病的治疗获得性免疫缺陷综合症(acquiredimmunedeficiencysyndrome，AIDS)又称艾滋病，是由人免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，HIV)引起的，HIV主要攻击T淋巴细胞，破坏机体的免疫系统，使抗病能力降低甚至丧失，最终导致死亡。HIV主要有2种类型：HIV-1和HIV-2，其中HIV-1是引起艾滋病的主要病原。因此，目前艾滋病的防治研究主要是针对HIV-1进行的。迄今为止尚无一种十分有效的方法治疗艾滋病，而核酶算是治疗艾滋病的一种理想的基因治疗药物。核酶对HIV-1的作用机制核酶可在HIV-1的识别、转录、翻译及包装等4个阶段对HIV-1进行切割：(1)切割HIV-1与宿主细胞识别结合阶段所需辅助受体mRNA(CCR5mRNA和CCR5pre-mRNA)；(2)对病毒基因组RNA进入靶细胞逆转录，转录时进行切割；(3)病毒mRNA翻译成病毒蛋白之前及翻译阶段对病毒mRNA进行切割；(4)病毒基因组RNA进入衣壳前，即包装过程中进行切割Wong-staal等(1998)利用一发卡型核酶抑制HIV-1基因表达，并率先进入一斯临床试验；用带有发夹状核酶的载体体外转染患者的T细胞，然后再将这些T细胞重新输入到患者体内，结果显示患者体内HIV-1的滴度降低。在近期的二期临床试验中，Mitsuyasu等(2009)用逆转录病毒载体将抗HIV核酶导入到造血干细胞中，然后将造血干细胞注入到74名感染HIV的患者体内，结果有38名患者携带了该种疗法所使用的完整拷贝。研究结果发现，CCR5(chemokine(c-cmotif)receptor5)是HIV-1R5毒株的重要细胞复合受体之一，该受体在HIV-1感染初期起着重要的作用，但是它的缺失对宿主而言是无关紧要的，因此CCR5可作为核酶切割的理想靶点。核酶对乙型肝炎的治疗乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus)属嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)，是一种逆转录病毒；其生活史可简单概括为：HBV进入肝细胞→在宿主酶作用下以负链DNA为模板合成正链DNA→形成共价闭合环状DNA(cccDNA)→在宿主RNA聚合酶Ⅱ作用下合成mRNA(亦称前基因组RNA，pgRNA)→在HBV逆转录酶作用下合成负链DNA→在HBVDNA聚合酶作用下合成正链DNA→形成子代闭合环状DNA。由于HBV的复制必须经过RNA的过程，所以可设计特异性核酶用于切割RNA，从而阻断HBV的复制过程。Fritz等(1992)合成了针对HBVpgRNA的3个不同的核酶，来直接作用于经体外转录获得的HBV的pgRNA，结果显示这3个核酶都能准确地切割底物RNA，表明HBVRNA易被核酶切割。Wang等(2010)在含有多聚人血清白蛋白(pHSA)及不含pHSA的情况下，将携带HDV核酶的helper-free重组逆转录病毒载体转入人肝癌细胞中，结果显示在pHSA存在的情况下，此种载体的转导能力高于不含pHSA时的转导能力。而且，在含有pHSA的情况下HBsAg和HBeAg的水平明显降低。该研究说明，携带有HDV核酶的重组逆转录病毒载体在以HepG2215为转染目标时具有特异性的HBV切割活性。核酶的抗肿瘤作用多药耐药性(multidrugresistnce，MDR)是指肿瘤细胞对一种化疗药物表现出耐药性，同时对其他许多结构不同、作用靶点亦不相同的化疗药物也表现出交叉耐药的现象，是通过化疗药物治疗肿瘤急需突破的一大难题。Hiroyuki(1993)设计了一个能特异性切割MBRlmRNA序列第179位密码子的锤头状核酶，并在体外对MDRlmRNA进行切割，结果显示该锤头状核酶是一种潜在的有用工具，它可切割MDRlmRNA且使MDR恢复显性。Gao等(2007)在体外成功地使重组人核酶的pEGFP-RZ-muc仅在乳腺癌细胞中表达，而在非乳腺癌细胞中不表达；化学敏感性评估结果显示在经转染的细胞中，对阿霉素的抗药性降低了15倍，对长春花碱的抗药性降低了32倍，表明在体外培养的人乳腺癌细胞中pEGFP-RZmuc逆转MDR是有效的且具有选择性。核酶研究存在的问题1.催化活性低

由于切割位点的单一，致使核酶切割效率较低。要使核酶发挥最佳的催化活性，必须解决时间和空间问题，既要使核酶在合适的时间表达，还要使核酶及其切割底物在细胞的某一特定空间相互作用。2.稳定性差

核酶在体内最终是以RNA分子的形式起作用，因此极易遭到细胞内RNase的破坏。目前主要是通过化学修饰方法在核酶的骨架上添加基团（如甲氧基、烯丙基等）来提高其稳定性，而不影响其催化活性。3.表达量不高

核酶的切割活性依赖高浓度的表达量，当核酶表达量低时，不能达到有效的抗病效果。并且核酶的催化作用还依赖于病毒的滴度(邹建，2003)。在病毒滴度低(4.5log10TCID50)的时候其切割活性明显，病毒滴度较高(5.5log10TCID50)时，其切割活性显著降低，这可能和反义RNA浓度有一定关系。参考文献[1]PuenaFE,RomeroLC,BarrosoDA,eta1.ribozymes：recentad