基于RAW264.7细胞的鸡骨草辛素抗炎作用研究

基于RAW264.7细胞的鸡骨草辛素抗炎作用研究【摘要】目的：基于RAW264.7细胞，研究鸡骨草辛素(BJBS)在体外的抗炎作用。方法：采用CCK8法测定BJBS对RAW264.7巨噬细胞的活力影响，利用脂多糖(LPS)刺激RAW264.7细胞，从而建立体外炎症模型，考察不同浓度BJBS对LPS诱导RAW264.7产生NO和ROS的含量水平的影响，以及ELISA法测定RAW264.7细胞分泌促炎细胞因子白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和白介素-18(IL-18)的水平。结果：BJBS显著抑制了因LPS刺激而活化的巨噬细胞的活力，同时显著降低RAW264.7巨噬细胞NO和ROS的产生，减少细胞内IL-6、TNF-α、IL-β及IL-18的释放，均呈现浓度依赖性。结论：BJBS具有抗炎活性，BJBS可通过抑制NO和ROS的产生，从而抑制细胞内氧化应激作用来抑制炎症反应，有望成为新一代高效低毒的抗炎药物。【关键词】鸡骨草辛素；RAW264.7细胞；抗炎

StudyonTheAnti-inflammatoryEffectofAbrusamideHBasedonRAW264.7Cells[Abstract]Objective:Toinvestigatetheanti-inflammatoryeffectofBJBS.Methods:Inthisstudy,lipopolysaccharide(LPS)-inducedmouseRAW264.7macrophageinvitroinflammationmodelwasusedtodeterminethecellviabilityofRAW264.7byCCK8method,thelevelsofNOandROSproducedbyLPSinducedbyLPSinducedbydifferentconcentrationsofBJBSwereinvestigated,andthepro-inflammatorycytokinesinterleukin-6(IL-6),tumornecrosisfactor-α(TNF-α),andinterleukin-1β(IL-1β)secretedbyRAW264.7cellsweremeasuredbyELISAandlevelsofinterleukin-18(IL-18).Results:BJBSsignificantlyinhibitedtheviabilityofLPS-stimulatedmacrophages,significantlyreducedtheproductionofNOandROSinRAW264.7macrophages,andreducedthereleaseofIL-6,TNF-α,IL-βandIL-18incells,allofwhichwereconcentration-dependent.Conclusion:BJBShasanti-inflammatoryactivity,andBJBScaninhibitinflammatoryresponsebyinhibitingandreducingtheproductionofNOandROS,inhibitingintracellularoxidativestress,andisexpectedtobecomeanewgenerationofhigh-efficiencyandlow-toxicityanti-inflammatorydrugs.[Keywords]AbrusamideHRAW264.7cellsAnti-inflammatory

目录TOC\o"1-4"\u1前言 前言毛鸡骨草的概述毛鸡骨草，为岭南特色中药材之一，主产于广西，为豆科相思子属植物毛相思子的干燥全草；鸡骨草，主要分布在广东、广西、海南和福建等地，为豆科植物广州相思子的带根全草，是毛鸡骨草的同属基源药材，二者的化学成分和药理活性相似[1]，都具有抗炎、抗氧化、抗细菌、抗病毒和抗肿瘤等功效[2]。毛鸡骨草由于易栽培种植，且具有相当多的药理活性，有着非常巨大的研发成新药的潜力。有研究表明毛鸡骨草中含有以吐昔酸和吐星酸为母核结构的氨基酸酰胺类成分[1,3]，吐昔酸和吐昔酸衍生物具有多种药理活性，此类衍生物以其独特的结构和生物活性吸引了国内外研究人员的关注。鸡骨草辛素(AbrusamideH，BJBS)是从毛鸡骨草中提取得到的吐昔酸衍生物，见图1，目前尚未有报道对BJBS药理活性进行研究，其活性作用机制也不明确。图1鸡骨草辛素的化学结构吐昔酸及其衍生物的概述吐昔酸是一种可以从多种植物中分离出来的天然产物。研究表明，吐昔酸具有一定的抗炎作用。在动物实验中，吐昔酸及其衍生物4，4’-二羟基-α-吐昔酸均表现出良好的抗炎活性，后者抗炎活性与洛索洛芬钠相当，但弱于双氯芬酸钠[4,5]。因此，吐昔酸母核作为一个近年来逐渐被发掘的优势结构，其衍生物具有作为抗炎药物先导化合物进行下一步优化筛选的潜力。我们从毛鸡骨草中提取的天然产物鸡骨草辛素中同样具有该优势结构，基于以上研究结果表明，吐昔酸及其衍生物具有潜在的抗炎作用，可能成为治疗炎症相关疾病的新型药物候选物，故对鸡骨草辛素进行抗炎作用研究。炎症的概述炎症，是机体应对刺激的一种防御机制[6]，表现为红、肿、热、痛和功能障碍。在机体遇到生物性因子、变态反应、坏死组织、化学性因子等的致炎因子的刺激时，将会产生炎症反应。在炎症反应过程中，以中性粒细胞和巨噬细胞为主的炎症细胞，将会通过产生细胞因子等物质，限制并消除损伤因子，同时也促进受损组织的愈合。液体的渗出可以稀释毒素，免疫细胞吞噬搬运坏死组织以利于再生和修复[6]。因此，炎症是机体天然存在的机制，目的是为了保护机体。一般而论，炎症是对机体有利的。但在某些情况下，炎症又是具有潜在危害的，有研究表明多种慢性疾病与炎症反应明显相关，如冠心病[7]、阿尔兹海默症[8,9]、糖尿病肾病[10]和癌症[11]等疾病。巨噬细胞和中性粒细胞是在炎症反应中发挥重要作用的先天免疫细胞，起到防御外源性刺激的作用，广泛分布于体内。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是革兰氏阴性细菌的外膜结构成分，LPS能够使中性粒细胞[12]和巨噬细胞[13]活化，LPS诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞产生炎症是一种常用的体外炎症模型[14-17]，广泛用于抗炎药物的筛选。当LPS被免疫细胞膜上的特异性受体识别并结合时，炎症通路便会被LPS信号级联激活，使得巨噬细胞释放促炎细胞因子和炎症介质如一氧化氮(NitricOxide，NO)和活性氧(Reactiveoxygenspecies，ROS)直接或间接参与炎症反应。炎症过程中NO通过参与宿主的防御反应，调节其他炎症分子的合成等过程，当机体产生过量的NO，会进一步诱导炎症反应，并且可导致组织损伤[18]。氧化应激与炎症反应密切相关，ROS含量是否保持动态平衡影响体内氧化应激反应，ROS过多积累会引起体内氧化过激，导致正常细胞发生凋亡，这些反应均会导致组织损伤和功能丧失。因此，减少NO和ROS等炎症介质的释放是治疗炎症的关键。抗炎药的概述抗炎药是一种用于治疗炎症性疾病的药物，能改善红、肿、热、痛、机能障碍等症状。其中，治疗以炎症为基础的疾病时，常常使用非甾体抗炎药(NonsteroidalAntiinflammatoryDrugs，NSAIDs)。NSAIDs通过抑制环氧化酶(Cyclooxygenase，COX)来减轻炎症和疼痛，虽然抗炎药物对许多炎症性疾病具有显著的治疗效果，但其使用也会存在许多副作用，如胃肠道不适、心血管系统问题[19]。因此，通过对已有的抗炎药的相关基团进行修饰，并从中找到高效低毒的抗炎药，也可以通过寻找抗炎中药中起到抗炎作用的有效成分，发展新型抗炎药。在国内，中草药成为了一个热门的抗炎症领域。许多研究表明，中草药具有良好的抗炎作用，可用于治疗许多炎症性疾病，如风湿性关节炎、溃疡性结肠炎等。此外，近年来，基于抗体和细胞免疫学的新型抗炎药物也受到了越来越多的关注。生物制剂包括抗肿瘤坏死因子(TumorNecrosisFactor，TNF)抑制剂和白细胞介素(Interleukin，IL)抑制剂等，被广泛用于治疗类风湿关节炎等自身免疫性疾病，一些新型的抗炎药物如Janus激酶抑制剂(JAK抑制剂[20])也受到了越来越多的关注。RAW264.7细胞的概述RAW264.7巨噬细胞是从小鼠肿瘤中分离出来的细胞株，不是天然存在的巨噬细胞，与人类巨噬细胞在某些方面存在差异，并且该细胞无法模拟复杂的体内环境，可能会受到细胞培养条件、处理剂量和时间等因素的影响导致结果存在一定的偏差，结果仅供参考。但由于该细胞易于获取和培养，生长快速，数量可控；对多种刺激物质反应性强，可以评估不同化合物或者药物的抗炎活性；也可以通过基因编辑技术对其进行改造，增加特定受体或者信号通路的表达，便于研究相关的分子机制的这些原因，该细胞仍然被广泛应用于体外炎症模型。本实验对BJBS干预下的RAW264.7细胞进行细胞活性测定，建立以LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞体外炎症模型，检测NO、ROS和细胞因子如IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-18的含量，考察BJBS的体外抗炎作用，为阐明BJBS抗炎作用及机制和开发BJBS成新型抗炎药物提供理论支撑。

试剂和仪器药品和试剂药品和试剂见表1。表1药品和试剂名称来源鸡骨草辛素(BJBS)，纯度>99%广东药科大学中药开发研究所袁旭江老师课题组提供RAW264.7小鼠巨噬细胞中国科学院(上海)细胞库二甲基亚砜(DimethylSulfoxide，DMSO)广州瑞舒生物科技有限公司醋酸地塞米松大连美仑生物科技有限公司胎牛血清(FetalBovineSerum，FBS)美国Gibco公司高糖DMEM培养基美国Gibco公司DCFH-DA活性氧检测试剂盒上海碧云天生物科技有限公司ELISA试剂盒江苏酶免生物科技有限公司青链霉素混合液(100*)北京索莱宝科技有限公司CCK8广州瑞舒生物科技有限公司一氧化氮试剂盒南京建成生物工程研究所脂多糖美国sigma公司去离子水和泰纯水器自制仪器和设备仪器和设备见表2。表2仪器和设备名称来源SynergyHTX酶标仪美国伯腾仪器有限公司H1850台式离心机湖南湘仪实验室仪器开发有限公司BSA224S-CW万分之一分析天平赛多利斯科学仪器北京有限公司HF90二氧化碳培养箱上海力申科学仪器有限公司DMi8manual倒置荧光显微镜德国Lecia公司

实验方法溶液的制备0.5%DMSO溶液的制备称取0.5gDMSO，加入去离子水，使去离子水与DMSO的重量为100g，搅拌溶解，备用。BJBS和醋酸地塞米松溶液的制备精密称取BJBS和醋酸地塞米松，用“3.1.1”项下制备的0.5%DMSO溶液溶解BJBS和醋酸地塞米松，得到BJBS溶液及醋酸地塞米松溶液。实验时用DMEM作为溶剂稀释至所需浓度，并保持DMSO的浓度为0.5%。如无特别说明，醋酸地塞米松溶液浓度均为50.00μg/ml。RAW264.7巨噬细胞的培养将RAW264.7巨噬细胞复苏后，将RAW264.7巨噬细胞在添加10%热灭活FBS，100U/mL青霉素和链霉素溶液的DMEM中培养，转移至细胞瓶中并放置在37℃，5%CO2的二氧化碳培养箱中。待RAW264.7细胞密度约在80%时，即可进行传代，一般一天传代一次。测定BJBS对RAW264.7巨噬细胞毒性用CCK-8法测定细胞活力。将RAW264.7巨噬细胞以1.0×105个/孔的密度接种于96孔板中，孵育24h。孵育完成后，取出96孔板，在每个孔内加入100μL不同浓度的BJBS溶液(80.00、160.00、320.00、640.00、960.00和1280.00μg/mL)，并建立调零组(DMEM溶液)和空白对照组(细胞悬液+DMEM溶液)，孵育24h。孵育完成后，取出96孔板，在每个孔内加入CCK8溶液10μL，孵育2h。孵育完成后，取出96孔板，放其放置于酶标仪中检测450nm处吸光度值，并通过式1计算细胞存活率。细胞存活率=测定BJBS对RAW264.7巨噬细胞活力的影响用CCK-8法测定细胞活力。将RAW264.7巨噬细胞以1.0×105个/孔的密度接种于96孔板中，孵育24h。孵育完成后，取出96孔板，在每个孔内加入100μL不同浓度的BJBS溶液(250.00、500.00、750.00、1000.00和1250.00μg/mL)，同时在调零组(DMEM溶液)和空白对照组(细胞悬液+DMEM溶液)中各加入100μLDMEM溶液，预处理4h后，用LPS(1.00μg/mL)刺激细胞，孵育24h。孵育完成后，取出96孔板，每孔加入CCK8溶液10μL，孵育2h。孵育完成后，取出96孔板，放其放置于酶标仪中检测450nm处吸光度值，并通过式1计算细胞存活率。测定RAW264.7巨噬细胞中NO含量将RAW264.7巨噬细胞以1.0×106个/孔的密度接种于12孔板中，孵育24h。用250.00、500.00和1000.00μg/mL的BJBS溶液预处理细胞1h后，用LPS(1.00μg/mL)刺激细胞。孵育6h后，用Griess试剂法检测培养上清液中亚硝酸盐浓度。精确吸取50μL各组细胞上清液至96孔板中，随后每孔分别加入50μLGriessA液和B液，置于振荡仪中100rpm振荡10min。振荡完成后，将其放置于酶标仪中检测540nm处吸光度值，检测结束后计算各组细胞上清液中NO的含量。测定RAW264.7巨噬细胞中ROS含量将RAW264.7巨噬细胞以1.0×106个/孔的密度接种于12孔板中，孵育24h。用250.00、500.00和1000.00μg/mL的BJBS溶液预处理细胞1h后，用LPS(1.00μg/mL)刺激细胞，孵育24h后，用PBS缓冲液洗涤两次，并加入10μMDCFH-DA检测试剂。保持温度于37℃并且对巨噬细胞进行避光处理，孵育30min后，用PBS缓冲液洗涤两次，再使用倒置荧光显微镜对巨噬细胞观察并拍照。测定RAW264.7巨噬细胞中IL-6、TNF-α、IL-18和IL-1β含量将RAW264.7巨噬细胞以1.0×106个/孔的密度接种于12孔板中，孵育24h。用250.00、500.00和1000.00μg/mL的BJBS溶液预处理细胞1h后，加入LPS(1.00μg/mL)刺激细胞6h。然后收集培养基，以1000rpm离心15min，收集上清液。采用ELISA试验盒检测IL-6、TNF-α、IL-18和IL-1β上清液中细胞因子的含量。统计学处理实验所得计量数据均以X±S表示。采用GraphPadPrism8软件对所得数据进行独立样本t检验，以P＜0.05为有统计学意义，P＜0.01具有显著性差异，P<0.001具有极其显著性差异。

结果细胞毒性测定从图2可以看出，与空白组进行对比，各浓度的BJBS实验组中RAW264.7巨噬细胞的存活率都高于80%，与空白组相比没有显著性差异。因此，可以认为选择250.00、500.00和1000.00μg/mL的BJBS溶液对RAW264.7巨噬细胞无显著毒性。图2BJBS对RAW264.7巨噬细胞的毒性测定结果细胞活力测定从图3可以看出，与空白组进行对比，经过LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞活力显著升高，证明成功建立体外炎症模型。与LPS组相比，LPS+BJBS组明显抑制了RAW264.7巨噬细胞活力增长，而不同浓度的BJBS对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞增殖抑制能力呈现浓度依赖性抑制作用。图3BJBS对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞的活力测定结果。与对照组比较，###P＜0.001；与LPS组比较，***P＜0.001,**P＜0.01，*P＜0.05。RAW264.7细胞中NO含量结果从图4可以看出，与空白组进行对比，经过LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中NO含量显著升高，说明成功建立体外炎症模型。与LPS组相比较，LPS+醋酸地塞米松阳性对照组能显著抑制RAW264.7巨噬细胞产生NO，不同浓度的BJBS+LPS实验组也能明显抑制RAW264.7巨噬细胞产生NO，并且不同浓度的BJBS+LPS组对抑制RAW264.7巨噬细胞产生NO的能力呈浓度依赖性抑制作用。虽然BJBS和醋酸地塞米松均有抑制RAW264.7巨噬细胞产生NO的能力，但醋酸地塞米松在比BJBS浓度更低的情况下，对RAW264.7巨噬细胞产生NO的抑制能力更强。图4LPS诱导的各组RAW264.7巨噬细胞中NO的含量测定结果。与对照组比较，###P＜0.001；与LPS组比较,***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05。RAW264.7巨噬细胞中ROS含量结果从图5可以看出，与空白组进行对比，经过LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞产生的ROS显著增加，说明成功建立体外炎症模型。与LPS组相比，LPS+醋酸地塞米松阳性对照组显著抑制了RAW264.7巨噬细胞产生ROS，不同浓度的BJBS+LPS实验组也能明显抑制RAW264.7巨噬细胞产生ROS，并且不同浓度的BJBS+LPS实验组对RAW264.7巨噬细胞产生ROS的抑制能力呈浓度依赖性抑制作用。虽然BJBS和醋酸地塞米松均有抑制RAW264.7巨噬细胞产生ROS的能力，但醋酸地塞米松在比BJBS浓度更低的情况下，对RAW264.7巨噬细胞产生ROS的抑制能力更强。图5各组RAW264.7巨噬细胞中ROS的含量测定结果。与对照组比较，###P＜0.001；与LPS组比较,***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05。RAW264.7巨噬细胞中IL-6、TNF-α、IL-18和IL-1β含量结果从图6可以看出，与空白组进行对比，经过LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞上清液中IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-18含量显著升高，说明成功建立体外炎症模型。LPS+醋酸地塞米松阳性对照组的上清液中IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-18含量明显低于LPS组，具有显著性差异。不同浓度的BJBS+LPS实验组的上清液中IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-18含量低于LPS组，但IL-6和IL-18的含量在低浓度水平时，与LPS组没有显著性差异。虽然BJBS和醋酸地塞米松均有抑制RAW264.7巨噬细胞产生IL-6、TNF-α、IL-18和IL-1β的能力，但醋酸地塞米松在比BJBS浓度更低的情况下，对RAW264.7巨噬细胞产生IL-6、TNF-α、IL-18和IL-1β的抑制能力更强。图6各组RAW264.7巨噬细胞上清液中IL-6的含量测定结果。A:IL-6；B:TNF-α；C:IL-1β；D:IL-18。与对照组比较，###P＜0.001；与LPS组比较，***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05。

讨论炎症，是由于巨噬细胞和中性粒细胞等先天免疫细胞在抵御感染、创伤和自身坏死组织的影响时而出现的一种防御机制。炎症反应中，先天免疫细胞会释放细胞因子、NO和ROS等致炎因子使得炎症部位血管扩张，又因为炎症介质的作用，导致血管通透性增加，导致液体渗出，出现水肿。而由于血管扩张，也会将先天免疫细胞带到发生炎症反应的部位，先天免疫细胞重复上述过程，导致炎症反应过度，对机体造成损害。故控制NO、ROS、细胞因子的释放和抑制先天免疫细胞的迁移和聚集对控制炎症有着重大意义。在测定ROS含量时，使用PBS对细胞及孔板进行洗涤是非常重要的，通过清洗掉未能进入到细胞中的DCFH-DA能够有效避免拍照过程中出现的背景荧光，导致结果不准确。在测定细胞因子含量时，利用洗涤液将结合不理想的一抗和二抗清洗掉，能够保证在测定吸光度时，减少偶然误差，提高检测的重现性，而终止液加入时间对结果影响也非常大。加入时间过早或者过晚，都会导致标准曲线不理想，影响实验结果。本实验结果表明，BJBS能有效抑制RAW264.7巨噬细胞释放NO、ROS和细胞因子，对控制炎症起到了积极作用。进行BJBS对RAW264.7巨噬细胞的毒性测试时，能发现BJBS的毒性较低，在进行BJBS对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞的活力测定、NO产生量、ROS产生量和细胞因子产生量的抑制试验时，发现BJBS表现出了抗炎活性，即BJBS有作为新型高效低毒的抗炎药的潜力。

总结与展望本实验基于LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞对BJBS进行体外抗炎作用研究。在炎症区域中，以巨噬细胞和中性粒细胞为主的炎症细胞会分泌细胞因子和趋化因子，并由此激活蛋白激酶信号转导各种氧化应激产物。氧化应激产物的产生也会促进炎症细胞分泌更多的致炎因子，进一步增大炎症反应。实验结果表明BJBS在不显著抑制RAW264.7巨噬细胞的生长活性条件下，能够抑制RAW264.7巨噬细胞因LPS诱导而产生的细胞增殖。通过检测RAW264.7巨噬细胞中NO、ROS、IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-18的含量，发现BJBS能以浓度依赖性抑制NO和ROS的生成，也能抑制IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-18的生成。据此结果，我们推测BJBS是通过抑制NO和ROS的产生来抑制氧化应激作用，减少核转录因子-κB(NuclearFactorKappa-B，NF-κB)通路的激活，从而减少促炎症细胞因子的产生。本实验基于RAW264.7细胞对BJBS的体外抗炎作用进行了研究，阐述了BJBS产生抗炎作用的机制，但由于RAW264.7细胞是体外炎症模型，无法模拟复杂的体内环境，故在往后的研究中可以对BJBS进行体内抗炎作用的研究，即通过建立体内炎症模型[21,22]，观察动物体内中性粒细胞和巨噬细胞的迁移和聚集情况，还可以通过监测动物的NO等致炎因子的含量，从而得到BJBS在体内抗炎作用的具体数据，为将BJBS开发成一种新型高效低毒的抗炎药提供基础。综上所述，BJBS能够抑制RAW264.7巨噬细胞由于LPS诱导而产生的细胞增殖和释放致炎因子的作用，具有体外抗炎作用，因此BJBS有望成为一种新型高效低毒的抗炎药。

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