《分析化学》第十二章-液相色谱法

第十二章液相色谱法第一节概述第二节柱色谱法第三节平面色谱法思考与练习2024/4/81第一节概述色谱法(chromatography)又称层析法，是一种依据物质的物理化学性质的不同(如溶解性、极性、离子交换能力、分子大小等)而进行的分离分析方法。一、色谱法的产生和发展二、色谱法的分类三、色谱法的基本原理2024/4/82一、色谱法的产生和发展俄国植物学家茨维特在1906年使用的装置，如图：起分离作用的柱子叫色谱柱，其中的一相固定不动，称为固定相；另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体(气体或液体)，称为流动相。色谱法是一种分离技术2024/4/83小结：色谱过程组分的结构和性质微小差异与固定相作用差异随流动相移动的速度不等差速迁移色谱分离。两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础；色谱过程就是组分的分子在流动相和固定相间多次“分配”产生“差速迁移”的过程。2024/4/86（二）分配系数K被分离组分以不同的程度分布在两相中，溶质既可进入固定相，也可进入流动相，这个过程叫分配分配系数:在一定的温度和压力下，某组分在两相间的分配达到平衡时浓度（或溶解度）之比。组分在流动相中的浓度cm组分在固定相中的浓度csK=K吸附色谱：吸附平衡常数分配色谱：分配系数离子交换色谱：交换系数凝胶色谱：渗透系数(吸附系数)2024/4/87（三）保留值某组分从开始洗脱到从柱中被洗脱下来所需要的时间称为保留时间(retentiontime)，通常用符号“tR”表示。某组分从开始洗脱到从柱中被洗脱下来所需要的流动相的体积称为保留体积(retentionvolume)，通常用符号“VR”表示。保留值是色谱法定性分析的基本参数。2024/4/88（四）分配系数与保留值的关系K值越大，移动速度越慢，tR越长，后出柱K值越小，移动速度越快，tR越短，先出柱混合物中各组分间的分配系数K相差越大，各组分越容易被分离2024/4/89第二节柱色谱法一、液-固吸附柱色谱法二、分配柱色谱法三、离子交换柱色谱法四、凝胶柱色谱法2024/4/810一、液-固吸附柱色谱法（一）原理利用吸附剂对不同组分的吸附能力的差异进行分离的一种色谱法。吸附作用与吸附平衡吸附平衡常数（吸附系数）组分在流动相中的浓度组分在吸附剂中的浓度=K影响K的因素:吸附剂的活性、组分和流动相的性质K的意义:组分的吸附系数K越大，表示越容易被吸附，保留时间越长，流出色谱柱就越慢。2024/4/811（二）吸附剂1.对吸附剂的基本要求是：(1).具有较大的表面积和足够的吸附能力。(2).在所用的溶剂和洗脱剂中不溶解；不与试样各组分、溶剂和洗脱剂发生化学反应。(3).颗粒较均匀，有一定的细度，在使用过程中不易破碎。(4).具有较为可逆的吸附性，既能吸附试样组分，又易于解吸。目前最常用的吸附剂是硅胶和氧化铝，其次是聚酰胺、活性炭，还有大孔吸附树脂等。2024/4/8122.常用的吸附剂硅胶：多孔性微粒，表面带有硅醇基，呈弱酸性。原理:硅醇基(吸附中心)与极性基团形成氢键(吸附性),组分与硅醇基形成氢键(被吸附)的能力不同而分离。应用:酸性和中性物质的分离，如有机酸、酚类、醛类.2024/4/813硅胶活度与含水量的关系：含水量高，活度低。活化：加热至100℃左右，除去吸附水提高活度分离效率：与其粒度及表面积等有关。常用硅胶：硅胶H，不含黏合剂硅胶G，含煅石膏硅胶GF254，含煅石膏和一种无机荧光剂，即锰激活的硅酸锌，在254nm紫外光下呈强烈黄绿色荧光背景。硅胶含水量%活性级别氧化铝含水量%0Ⅰ05Ⅱ315Ⅲ625Ⅳ1038Ⅴ152024/4/814氧化铝种类碱性氧化铝(pH9～10):适用于分离碱性或中性化合物酸性氧化铝(pH5～4.5):适用于分离酸性化合物中性氧化铝(pH7～7.5):适用于分离酸性、中性和碱性化合物活性与含水量的关系含水量高，活性级高，活度低硅胶含水量%活性级别氧化铝含水量%0Ⅰ05Ⅱ315Ⅲ625Ⅳ1038Ⅴ152024/4/815其它吸附剂聚酰胺是一类由酰胺聚合而成的高分子化合物结构特点：存在许多酰胺键，可与酚类、酸类、硝基化合物、醌类等形成氢键。活性碳：属于非极性吸附剂，吸附能力强，适合于水溶性物质的分离大孔吸附树脂：不含交换基团，具有大孔网状结构的高分子吸附剂。用于皂苷及苷类化合物的分离2024/4/816（三）流动相(洗脱剂)

1.对流动相的基本要求是：(1).对试样组分的溶解度要足够大。(2).不与试样组分和吸附剂发生化学反应。(3).粘度小，易流动。(4).有足够的纯度。2.溶剂的极性由弱到强的顺序：石油醚<环己烷<四氯化碳<苯<甲苯<乙醚<氯仿<乙酸乙酯<正丁醇<丙酮<乙醇<甲醇<水2024/4/817(四）被分离的物质(1)烷烃系非极性化合物,一般不被吸附或吸附不牢固.(2)不饱和烃分子中双键越多或共轭链越长,其极性越强,被吸附力亦越强.(3)当形成分子内氢键时,被吸附力减弱.(4)同系物中,分子量越大,极性越小,被吸附力越弱.(5)基本母核相同的化合物,分子中官能团极性越大或极性官能团越多,则分子的极性越大,被吸附力越强.常见官能团的极性由小到大的顺序：烷烃<烯烃<醚类<硝基化合物<酯类<酮类<醛类<硫醇<胺类<醇类<酚类<羧酸类2024/4/818(1)吸附剂的活性与被分离组分极性的关系分离极性小的组分，选择吸附性能大的吸附剂，以免组分流出太快，难以分离；分离极性大的组分，宜选用吸附性能小的吸附剂，以免吸附过牢，不易洗脱。2024/4/819(2)流动相的极性与被分离组分极性的关系分离极性较大的组分时，宜选择极性大的溶剂作洗脱剂；而分离极性小的组分时，宜选择极性较小的溶剂作洗脱剂.2024/4/820(五)选择色谱分离条件的一般原则被分离组分的极性较小，应选择吸附活性较大的吸附剂和极性较小的洗脱剂.2024/4/821（六）操作方法1.装柱2.加样3.洗脱2024/4/822二、液－液分配柱色谱法（一）分离机理利用混合物中不同组分在两相溶剂中溶解性不同(分配系数不同)，当流动相携带样品流经固定相时，各组分在两相间不断进行溶解、萃取，再溶解、再萃取。样品在色谱柱内经过无数次分配之后，而使分配系数稍有差异的组分得到分离。正相色谱：流动相的极性比固定相的极性弱反相色谱：流动相的极性比固定相的极性强2024/4/823(二)固定相载体（担体）载体的作用在分配色谱中，载体起着负载或支持固定液的作用对载体的要求：惰性、纯净、颗粒大小适宜；既能吸附固定液，又不吸附被分离的组分和流动相常用的载体：吸水硅胶、多孔硅藻土、纤维素粉、滤纸2024/4/824(二)固定相固定相是液体，涂布或吸附在载体表面。正相色谱中固定相主要有：水、稀酸、甲醇、甲酰胺等强极性溶剂；反相色谱中为石蜡油等非极性液体。2024/4/825（三）流动相对流动相的要求：流动相的极性与固定相的极性应相差很大，才能互不相溶。柱色谱中的固定相的极性都较大，因而流动相应选择极性较小的溶剂常用的流动相：正相色谱中有石油醚、醇类、酮类、酯类、卤代烷、苯或混合溶剂；反相色谱中有水、稀醇溶液等。2024/4/826(四)操作方法1.预处理将固定液与流动相混合，相互饱和，静置后分离固定液涂布在载体上2.装柱3.加样4.洗脱2024/4/827三、离子交换色谱法分离原理：固定相：离子交换树脂流动相：水、酸或碱溶液分离对象：离子型化合物利用离子交换剂与溶液中的离子发生交换作用而使离子分离的方法.当被分离的离子随着流动相流经色谱柱时，与离子交换树脂上可被交换的离子连续进行竞争交换，由于不同离子与交换树脂的竞争交换能力不同，因而在柱内的移动速度也不同，交换能力弱的离子移动速度快，保留时间短，先流出色谱柱。2024/4/828（一）离子交换树脂的分类离子交换树脂是具有网状结构的复杂的有机高分子聚合物。网状结构的骨架部分一般很稳定，不溶于酸、碱和一般溶剂。在网状结构的骨架上有许多可被交换的活性基团。根据活性基团的不同、离子交换树脂可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂两大类。2024/4/829（一）离子交换树脂的分类1.阳离子交换树脂阳离子交换树脂具有酸性基团，如应用最广泛的强酸性磺酸型聚苯乙烯树脂，它是以苯乙烯和二乙烯苯聚合，经浓硫酸磺化而制得的聚合物。这种树脂的化学性质很稳定，具有耐强酸、强碱、氧化剂和还原剂的性质，因此应用非常广泛。2024/4/830各种阳离子交换树脂含有不同的活性基团、常见的有磺酸基(-SO3H)、羧基(-COOH)和酚羟基(-OH)等。根据活性基团离解出H+能力的大小不同，阳离子交换树脂分为强酸性和弱酸性两种。例如含-SO3H的为强酸性阳离子交换树脂，常用R-SO3H表示(R表示树脂的骨架)，含-COOH和-OH的弱酸性阳离子交换树脂，分别用R-COOH和R-OH表示。阳离子交换反应-++--++-+-==+-ClHMSORClMHSOR332024/4/8312.阴离子交换树脂所连的活性基团为碱性基团如含季胺(-N(CH3)3)的树脂称为强碱性阴离子交换树脂，含伯胺基(-NH2)、仲胺基(-NHCH3)和叔胺基(-N(CH3)2)的树脂为弱碱性阴离子交换树脂。树脂水化后分别形成R-NH3OH、R-NH2CH3OH、R-NH(CH3)2OH和R-N(CH3)3OH等氢氧型阴离子交换树脂，所连的OH-可被阴离子交换和洗脱。阴离子交换反应---+==+OHXOH)CH(RN33RN(CH3)3+X-+2024/4/832树脂的再生

阳离子交换树脂用HCl溶液处理

阴离子交换树脂用NaOH溶液处理-++--++-+-==+-ClMHSORClHMSOR33-++==+OH)CH(RNNaOHX－)CH(RN3333+Na+X-2024/4/833(二）离子交换树脂的性能1.交联度交联度：树脂中交联剂的含量。常以重量百分比表示交联度对树脂性质的影响：（1）交联度大，形成的树脂结构紧密，机械强度高；（2）交联度大，孔径就小，交换体积大的离子进入树脂受阻，因而提高了交换的选择性；（3）但交联度过大，网眼过小，会使交换速度减慢，交换容量下降。阳离子交换树脂交联度8%，阴离子交换树脂交联度4%。2024/4/8342.交换容量理论上的交换容量是指每克干树脂所含活性基团的物质的量，而实际交换容量是指在实验条件下，每克干树脂能交换离子的物质的量。单位：mmol/g显然交换容量的大小取决于网状结构内所含活性基团的数目。交换容量可通过实验测得。树脂的交换容量一般为1～10mmol/g交换容量反映了树脂交换反应的能力2024/4/835（三）离子交换柱色谱的操作方法1.树脂的预处理目的（1）除去杂质（2）进行转型商品树脂往往含有无机或有机杂质，使用前必须用酸、碱处理以除去杂质。处理方法：先将树脂在水中浸泡使其充分膨胀。市售阳离子交换树脂为Na型，一般用盐酸浸泡以除去杂质，然后用水洗至中性，这样可使Na型转化为H型。阴离子交换树脂可用氢氧化钠溶液浸泡冲洗转变为OH型。2.装柱3.交换与洗脱2024/4/836（四）离子交换法的应用1.纯水的制备天然水中常含一些无机盐类，为了除去这些无机盐类以便将水净化，可将水通过氢型强酸性阳离子交换树脂，除去各种阳离子。如以CaCl2代表水中的杂质，则交换反应为：

2R-SO3H+Ca2+＝(R-SO3)2Ca+2H+再通过氢氧型强碱性阴离子交换树脂，除去各种阴离子。

RN(CH3)3OH+C1-＝RN(CH3)3Cl+OH-交换下来的H+和OH-结合成H2O，这样就可以得到相当纯净的所谓“去离子水”，可以代替蒸馏水使用。2024/4/837（四）离子交换法的应用2.干扰离子的分离

(1)阴阳离子的分离在分析测定过程中，其他离子的存在常有干扰。对不同电荷的离子，用离子交换分离的方法排除干扰最为方便。例如用BaSO4重量沉淀法测定黄铁矿中硫的含量时，由于大量Fe3+、Ca2+的存在，造成BaSO4沉淀的不纯，因此可先将试液通过氢型强酸性阳离子交换树脂除去干扰离子，然后再将流出液中的SO42-沉淀为BaSO4进行硫的测定，这样便可以大大提高测定的准确度。2024/4/838（四）离子交换法的应用(2)同性电荷离子的分离如果要使几种阳离子或几种阴离子分离开，可以根据各种离子对树脂的亲和力不同，将它们彼此分离。例如欲分离Li+、Na+、K+三种离子，将试液通过阳离子树脂交换柱，则三种离子均被交换在树脂上,然后用稀HCl洗脱，交换能力最小的Li+先流出柱外，其次是Na+而交换能力最大的K+最后流出来。2024/4/8393.微量组分的富集以测定矿石中的铂、钯为例来说明。由于铂、钯在矿石中的含量一般为10-5-10-6％，即使称取10克试样进行分析，也只含铂、钯0.1微克左右。因此，必须经过富集之后才能进行测定。富集的方法是：称取10-20克试样，在700℃灼烧之后用王水溶解，加浓HCl蒸发，铂、钯形成PtCl62-和PdCl42-配阴离子。稀释之后，通过强碱性阴离子交换，即可将铂富集在交换柱上。用稀HCl将树脂洗净，取出树脂移入瓷钳锅中，在700℃灰化，用王水溶解残渣，加盐酸蒸发。然后在8mol/LHCl介质中，钯(II)与双十二烷基二硫代乙二酰胺(DDO)生成黄色配合物，用石油醚-三氯甲烷混合溶剂萃取，用比色法测定钯。铂(IV)用二氯化锡还原为铂(II)，与DDO生成樱红色螯合物可进行比色法测定。2024/4/840四、凝胶柱色谱凝胶是一种由有机物制成的分子筛，为多孔性的化学惰性物质。分离机理用凝胶作固定相，利用凝胶对分子大小不同的组分有着不同的阻滞作用(或渗透作用)来进行的分离分析方法。2024/4/841分离机理在洗脱过程中，各组分在柱中的保留时间取决于分子的大小。由于小分子可以完全渗透进入凝胶内部孔穴中而被滞留，中等分子可以部分的进入较大的一些孔穴中，大分子则完全不能进入孔穴中，而只能沿凝胶颗粒之间的空隙随流动相向下流动。样品中各组分按大分子在前，中等分子在中，小分子在后的顺序依次从色谱柱中流出，从而得到分离2024/4/842固定相和流动相固定相多孔凝胶：软质、半软质和硬质流动相要求：能溶解试样、润湿凝胶，粘度要低水溶性试样选择水溶液为流动相(称为凝胶过滤色谱）；非水溶性试样选择四氢呋喃、氯仿、甲苯和二甲基甲酰胺等有机溶剂为流动相(凝胶渗透色谱）。2024/4/843第三节平面色谱法一、薄层色谱法二、纸色谱法2024/4/844一、薄层色谱法

(thinlayerhromatography；TLC)薄层色谱法：将固定相涂布成一均匀薄层，在此薄层上进行分离样品的方法。薄板：铺好固定相的板称为薄板。

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分类吸附薄层色谱法;分配薄层色谱法;离子交换薄层色谱法;凝胶薄层色谱法薄层色谱流动相的移动是依靠毛细作用。将试样点在薄板的一端，并将该端浸在作为流动相的溶剂（展开剂）中，随着溶剂向上的移动，经过试样点时，带动试样向上运动。（一）、基本原理2024/4/8461.分离原理（吸附薄层色谱法）固定相——吸附剂流动相——液体，又称展开剂操作方式——薄层板上原理组分在薄层板上吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的过程。吸附系数不等产生差速迁移，K值大的组分随展开剂移动速度慢，在后；K值小的组分随展开剂移动速度快，在前。故薄层色谱又称敞开的柱色谱2024/4/8472.比移值和相对比移值比移值Rf原点到溶剂前沿的距离原点到斑点中心的距离=fRcbR乙=caR)甲(f=2024/4/848比移值R意义：（1)可定性分析：条件一定时，Rf是一常数，结构不同的物质，性质不同，其Rf值不同。（2)各组分的Rf值差越大，分离得越开。Rf与分配系数K的关系:K大，组分在固定相中浓度大，移动速度慢，Rf小。要求：各组分的Rf在0.2～0.8之间，两种组分的Rf差值大于0.052024/4/849Rf的影响因素Rf的影响因素（1)吸附剂的吸附性能（2)展开剂的极性（3)薄层板中吸附剂的厚度（4)展开的时间（5)色谱缸中蒸气的饱和程度

Rf的缺点：影响因素很多，很难得到重复的值2024/4/850相对比移值（Rs）Rf小于1，但Rs不一定Rs在0~∞之间若Rs=1，试样与对照品一致原点到对照品斑点中心的距离原点到样品组分斑点中心的距离=fRbaRs=2024/4/851(二)吸附剂的选择与柱色谱中的吸附剂相似，只是颗粒更细。分离效率比柱色谱高常用的吸附剂有硅胶和氧化铝，颗粒在200目(颗粒直径在10～40μm)左右2024/4/852(三)展开剂的选择薄层色谱中展开剂的选择原则与柱色谱中的洗脱剂的选择原则相似。在薄层分离中一般各斑点的在0.2～0.8之间，各组分值之间应相差0.05以上，否则易造成斑点重叠。薄层色谱法中常用的溶剂，按极性由弱到强的顺序石油醚＜环己烷＜二硫化碳＜四氯化碳＜三氯乙烷＜苯＜甲苯＜二氯甲烷＜氯仿＜乙醚＜乙酸乙酯＜丙酮＜乙醇＜甲醇＜吡啶＜水2024/4/853混合溶剂先用单一溶剂展开，若Rf值太小，则加入一定量极性强的溶剂，如乙醇、丙酮等，如果Rf值太大，则加入适量极性弱的溶剂(如环己烷、石油醚等)，以降低极性。还可加入一定比例的酸或碱,使斑点集中。若要改变比移值时，除了改变展开剂的极性外，还可通过改变吸附剂的活性来调节。2024/4/854(四)操作方法制板均匀点样距底边1.5～2cm处画一条起始线,试样点的直径一般应小于0.5mm展开(多种方式)预饱和显色定性、定量分析2024/4/855展开展开的过程就是混合物分离的过程。展开方式(1)上行法；(2)近似水平法；(3)多次展开法(4)双向展开法2024/4/856显色（斑点定位）1.直接观察:有色斑点2.有些组份在紫外光照射下产生荧光，可在紫外灯下用铅笔将组份斑点描绘出来。3.化学显色:常用的方法有喷洒显色剂、碘蒸气熏或氨水熏等2024/4/857通用型硫酸乙醇溶液:对大多数有机物能显示出不同颜色碘:对许多有机物可显色，如生物碱、氨基酸0.05%荧光黄甲醇溶液：对芳香族与杂环化合物显色专属型茚三酮是氨基酸专用显色剂三氯化铁－铁氰化钾是含酚羟基物质的显色剂溴甲酚绿是酸性化合物的显色剂显色剂类型显色方式浸渍法:适用于软板直接喷雾法:适用于硬板2024/4/858定性与定量分析定性比移值定量分析目视法斑点洗脱法薄层扫描法2024/4/859薄层色谱法的优缺点优点薄层色谱法简单、方便、及操作费用低可以在一块薄板上同时展开多个试样。采用方形薄层板还可以方便的进行二维展开，即按一般方法展开后，改变方向和展开剂再次展开，进一步改善分离效果。试样一般不需要经过预处理即可分离。缺点分离效率较低，不适用挥发性试样分离。2024/4/860（五）、应用薄层色谱法在染料、农药、医药、有