一种肺癌筛查的新方法

一种肺癌筛查的新方法温鑫编写肺、支气管上皮细胞稳定性检测技术〔痰液细胞游离亚铁原卟啉检测〕肺癌当今世界上严重威胁人类健康与生命的恶性肿瘤发病率在多数国家呈明显增高趋向近年来在我国许多大城市，占恶性肿瘤死亡率的第一位全世界每年有135万左右新病人每年110万人死于此病男性、女性死亡人数均位首例〔肿瘤致死〕至2025年，我国每年死于肺癌者达100万人以上中国肺癌流行病学回忆26.9%38.4%30.5%2000和2005年肺癌患者数Yangetal,2005患者数中国肺癌流行病学回忆2000和2005年肺癌发病率14.0%19.9%Per100,000Yangetal,2005* ASR:Age-standardizedincidencerate(per100,000)usingworldstandardpopulation中国肺癌流行病学回忆2000和2005年癌症发病率排名Yangetal,2005* ASR:Age-standardizedincidencerate(per100,000)用世界标准人口计算的年龄标化发病率(每10万人)中国肺癌流行病学回忆

胃积危险(75岁以下)：计算出的个人在没有其他死亡原因时在75岁以下发生癌症的净风险(以百分比表示)肺癌成为累积危险性最高的癌症Yangetal,2005NSCLC主要组织学类型的发生率*因为诊断标准的差异，总和不等于100%。GinsbergRJ,etal.Cancer:PrinciplesandPracticesofOncology.5thed.1997;858-911.30%鳞状细胞癌18%小细胞肺癌40%腺癌15%大细胞癌40302515154035351515咳嗽呼吸困难胸痛咯血肺炎体重减轻全身虚弱缺乏食欲发热贫血发生频率(%)NSCLC诊断时的体征和病症肺癌的早期筛查痰细胞学检查和胸部X片局部对照研究中提高诊断率和早期病例比例但疾病特异性死亡无差异对照组也接受了胸片检查，并非空白对照低剂量CT检出率较胸片高，多为IA期患者对生存率影响有待研究肺癌的筛查仍处于临床研究阶段

癌标志物的检测无可靠的血清癌标志物用于诊断或普查肺癌NSCLC：组织多肽抗原(TPA)、癌胚抗原(CEA)、鳞癌抗原(Scc-Ag)、CYFRA21-1有一定意义SCLC：神经特异性烯醇化酶(NSE)、蛙皮素(BN)、肌酸磷酸同功酶BB(CPK-BB)、胃泌肽(GRPC)检测外周血中肿瘤细胞异常DNA，即DNA微卫星改变及基因的异常甲基化一种肺癌筛查的新方法《肺、支气管上皮细胞稳定性检测技术〔痰液细胞游离亚铁原卟啉检测〕》

使用《肺、支气管上皮细胞稳定性检测技术》进行肺癌临床筛查，在肺、支气管上皮细胞异常增生及癌变起始阶段即可显示阳性结果，能发现早期病人，精准度高。该技术无采样创伤、无采样漏诊、无需仪器设备和专业实验室，可用于经济条件较弱的人群。该法操作简单，经费投入低，适合于大规模肺癌普查活动。《肺、支气管上皮细胞稳定性检测技术》是通过检测痰液中是否含有细胞游离亚铁原卟啉〔CellsFreeFerrousProtoporphyrinFH〕而了解肺部细胞是否癌变的一种检测技术。细胞游离亚铁原卟啉是肺癌发生过程中产生的因果性生物标志因子。FH是含亚铁原卟啉蛋白的分解产物。FH具有强氧化作用，导致细胞自稳调节功能紊乱。FH含量具有连续可测量性，且与细胞癌变程度呈密切正相关。采用直接生物学介质〔痰液〕进行靶向定位检测，即可显示肺、支气管上皮细胞恶变过程。诺贝尔奖获得者德国生物化学家奥托.海因里希.瓦博格〔OttoHeinnichWarburg〕发现肿瘤细胞的耗糖速度是正常细胞的10倍，却仅产生1/10的能量。肿瘤细胞主要通过磷酸戊糖途径产能，使即便在有氧情况下有氧氧化过程也不能对糖酵解产生抑制，这称为瓦博格氏效应〔Warburgeffect〕。以6-磷酸葡萄糖开始，在6-磷酸葡萄糖脱氢酶催化下形成6-磷酸葡萄糖酸，进而代谢生成以磷酸戊糖为中间代谢物的过程，称为磷酸戊糖途径，简称PPP途径。反响部位：胞浆重要反响产物：NADPH、5-磷酸核糖限速酶〔启动因子〕：6-磷酸葡萄糖脱氢酶

6-磷酸葡萄糖脱氢酶的活性与抑癌基因p53有关。p53基因因编码一种分子质量为53kDa的蛋白质而得名，是一种抑癌基因。一旦p53基因发生突变，P53蛋白失活，细胞分裂失去节制，发生癌变。

在正常情况下,p53与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶相结合,抑制它的活性，阻止磷酸戊糖途径进行,细胞中的葡萄糖主要通过三羧酸循环产生能量。

在p53发生突变或缺失的肿瘤细胞中,失去了对葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的抑制,该酶作为戊糖磷酸途径的启动因子，使葡萄糖通过戊糖磷酸途径代谢。1、耗能；2、产生大量复原型辅酶Ⅱ〔NADPH〕,进行生物合成；3、改变细胞微环境。致癌因素

阻抑蛋白p53葡萄糖-6-磷酸脱氢酶P53突变突变的p53葡萄糖-6-磷酸脱氢酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶激活启动因子葡萄糖戊糖磷酸代谢途径TACNADPH果糖-6-磷酸3-磷酸甘油醛二氧化碳抑制瓦博格氏效应细胞内氧化复原状态的变化在很大程度上受到GSH/GSSG的影响，它是机体的主要内源性氧化-复原调控因子，其-SH和-S-S-间的转换调控着许多生物大分子的活性，被称为“分子开关”。Warburg效应形成的细胞微环境紊乱低氧〔氧稳态紊乱〕酸性环境〔酸碱平衡紊乱〕复原性状态〔氧化-复原平衡紊乱〕

FH位于细胞含亚铁原卟啉蛋白的肽链靠近外表的一个疏水核内，它主要依靠Fe2+与F8His的咪唑氮配位而挂在Pr链上。但是它之所以能固定在蛋白质的固定位置上而且取向一定，主要是因为还有大约21个残基逼近FH，距离在4A°之内，这些残基中有60多处与FH比较靠近，可以发生极性与非极性的相互作用，足以保持FH在细胞蛋白中的位置。FH的极性局部丙酸基侧链伸向亲水的外表，在生理pH下解离成负离子，在α链中，有一个丙酸基与CD3His相连；在β链中，FH的两个丙酸基分别与CD3Ser和E10Lys相连。FH与肽链之间的静电引力对于维持FH在细胞含亚铁原卟啉蛋白中的位置有很大作用。谷胱甘肽过氧化物酶以复原型谷胱甘肽(GSH)作为供氢体来分解H2O2，生成氧化型谷胱甘肽(GSSG)，使细胞内GSH:GSSG的比率下降。GSH生成GSSG过程中形成肿瘤细胞的低氧状态，激活氧感受器和缺氧信号传导通路。氧感受器分子导致蛋白质的巯基由氧化型向复原型转变，促使缺氧特异性转录因子-低氧诱导因子〔hypoxia-induciblefactor；HIF〕HIF-1a的磷酸化并与HIF-1b结合而形成一个完整的HIF-1转录复合体，从而与相应靶基因上的缺氧反响元件(HRE)结合，促进基因的表达.并通过第二信使-活性氧族(ROS)与激酶系统发生联系，激活下游酶系统。细胞在代谢过程中通过Fenton反响产生产生一系列活性氧族〔reactiveoxygenspecies,ROS〕，包括：O2-、H2O2及HO2·、·OH等。ROS可双向调控细胞的凋亡和增殖，机体内的自由基通过其浓度调节着机体细胞的生死平衡，对转录因子的激活以及对细胞增殖的促进。由于瓦格博效应，在低氧诱导因子〔hypoxiainduciblefactor，HIF〕的介导下，血管内皮生长因子〔VEGF〕mRNA转录和稳定性增加，且VEGF受体表达上调，VEGF的生物学效应增强。其表达的结果是增加血管分支形成,增强血流量。HIF-1a、ROS、VEGF表达上调，使一种亲脂性物质〔Hydrophilicfattymolecules〕进入细胞含亚铁原卟啉蛋白疏水核内，它所带的负电荷中和了肽链上His、Lys所带的正电荷，使它们不再与FH丙酸基侧链保持静电吸引，从而使FH在细胞蛋白中脱落。瓦博格效应NADPH增加GSH增加激活氧感受器和缺氧信号传导通路缺氧特异性转录因子HIF-1a活性增强激活第二信使-ROS与激酶系统EPO基因表达水平升高NADPH氧化酶H2O2下降cGMP抑制激活鸟苷酸环化酶VEGF表达上调血红素氧合酶及NOS活性抑制内源性CO及NO下降FH释放

代谢改变

HIF-1

VEGF不典型增生癌前病变原位癌浸润癌细胞增生

形态学改变低氧、还原态

ROS瓦博格效应

α链CD3His

β链CD3Ser、E10Lys酶蛋白FH

p53等基因突变

致癌因素

Hfm细胞高增生低凋亡低分化低氧代谢通路致癌因素细胞能量代谢重编程细胞内环境紊乱细胞形态紊乱细胞功能紊乱氧稳态紊乱酸碱平衡紊乱氧化-复原态平衡紊乱细胞周期功能紊乱线粒体功能紊乱囊泡运输功能紊乱表型遗传修饰机制紊乱细胞对称分裂抑制机制紊乱干细胞不对称分裂机制紊乱细胞癌变瓦博格氏效应采用一种脂溶性较强的物质，使之很容易进入细胞与细胞器中，其与FH物质的氧化-复原产物使上皮细胞内含有的内源性过氧化物酶等酶染色。作为筛查手段，观察痰液上皮细胞中FH物质对细胞内酶的染色情况，即可显示肺、支气管上皮细胞是否存有恶变及其程度。因细胞内酶的差异，同一含量FH显色可能略有不同。【判定标准】一、阴性(细胞游离亚铁原卟啉含量低于0.5ng/ml〕：不变色。二、弱阳性(细胞游离亚铁原卟啉含量0.5~5ng/ml〕：无色变为淡蓝色或黄绿色。三、阳性(细胞游离亚铁原卟啉含量5~200ng/ml〕：蓝绿色或蓝色。

四、强阳性(细胞游离亚铁原卟啉含量200ng/ml以上〕：深蓝色五、假设标本即刻显深蓝色后转为深黄色或棕红色，说明标本内内混有血液，亦应视为强阳性。即刻显深蓝色是FH的征象，转为深黄色或棕红色是血液的征象。

技术特色1、细胞游离亚铁原卟啉是一种因果性生物标志因子，是细胞稳定性失调、肿瘤发生过程细胞代谢变化的必然产物。因而用以检测肺癌敏感度高。2、本技术采用直接生物学介质进行检测，是一种靶向定位检测，因而用以检测肺癌特异度高。

3、这种代谢改变的肿瘤细胞是全息性的，是体细胞全能性不协调的表现，因而用以检测肺癌具有广谱性，适用各型肺癌的检测。

4、简约设