课件速览-抗HER2单克隆抗体纯化

项目四抗HER2单克隆抗体的生产任务二抗HER2单克隆抗体纯化细胞培养组将合格的丰收液送入中间库，与纯化组完成丰收液交接工作，接下来纯化组立即严格按照丰收液处理及层析等相关操作规程，对丰收液进行澄清、浓缩处理，并开展层析等纯化工作，获得符合质量标准的高纯度抗HER2单克隆抗体原液。规范填写生产记录。任务学习路径见思维导图。任务描述抗HER2单克隆抗体纯化2任务支撑（一）丰收液澄清技术

1.自然沉降与离心技术

丰收液静止即可依靠重力发生沉降，再采用虹吸法，即可被去除颗粒物。其沉降耗时较长，一般需数小时；沉降不能彻底去除颗粒物，可用于预处理丰收液，使后续使用其他澄清技术的效果更佳。

操作者可通过离心机的高速运转，利用物体高速旋转时产生强大的离心力，使置于旋转体中的悬浮颗粒发生沉降或漂浮，从而使某些颗粒达到浓缩或与其他颗粒分离。3抗HER2单克隆抗体纯化（一）丰收液澄清技术4

微孔过滤技术是膜分离技术中开发最早，应用广泛的一种膜过滤分离技术。微孔过滤可用来从气相和液相中截留微粒、细菌、污染物等，是现代工业中确保产品质量的必要手段，能有效去除料液中的固相物质。2.微孔过滤技术（一）丰收液澄清技术5

深层过滤器利用具有一定厚度的特定介质，去除颗粒、亚微颗粒、胶质物以及可溶的物质，从而高效地去除污染物。流体必须通过弯曲的路径才能到达另一侧。在此过程中深层过滤介质通过尺寸排阻、吸附、电荷作用等多种功能，很好地实现澄清丰收液目的。与离心技术和微孔过滤技术相比更具优势。3.深层过滤技术（二）亲和层析技术6

亲和层析（亲和色谱）具有较高选择性，甚至能使分离纯化在一步中完成。亲和色谱分离蛋白的纯化基础是一个蛋白（或者一组蛋白）与特异性配基配对到色谱基质上，并且蛋白质与配基之间具有可逆的相互作用。

目标蛋白质与配基之间的生物学相互作用可以是由于静电相互作用或者疏水性的相互作用，范德华力和/或氢键结合力等产生的。可以从亲和介质中将目标分子洗脱，或者用一个特异性竞争的配基，或者用非特异性洗脱，如改变pH、离子强度或者极性。在一个单一的步骤中，使用亲和纯化能节省大量的纯化时间，使用更少的纯化步骤，达到更高的纯度。1.了解亲和层析（二）亲和层析技术7

亲和层析不仅局限于蛋白质分离，一些具有典型的相互作用的生物分子，经常被用于亲和色谱纯化，如下所述：酶与底物类似物，抑制剂，辅助因子；抗体与抗原，病毒，细胞；凝集素与多糖类，糖蛋白，细胞表面受体，细胞；核酸与互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶，核酸结合蛋白；激素，维生素与受体、载体蛋白；谷胱甘肽与谷胱甘肽转移酶或者GST融合蛋白；金属离子与聚组氨酸（His）融合蛋白，具有组氨酸的天然蛋白质，表面有半胱氨酸和/或色氨酸残基的蛋白质。2.亲和层析常见配对配基（二）亲和层析技术8

亲和层析一般由平衡、上样、清洗（洗涤）和洗脱等步骤。3.亲和层析工艺亲和层析过程示意图（二）亲和层析技术9（1）介质和平衡缓冲液的准备。新的亲和介质在使用前，溶剂应该被彻底清洗掉。以冻干粉末形式购买的市售介质，需要按说明书使用经0.45μm的滤膜过滤的高质量水和化学试剂进行溶胀。用过的亲和介质在重复使用时，应当仅应用于同一种目标蛋白的纯化，避免样品间的交叉污染。3.亲和层析工艺（2）上样。样品中的任何污染物在亲和介质中要能被去除，不残留，并且不损坏配基。每一种亲和介质，结合和洗脱缓冲液是专一性的，因为缓冲液可以影响目标分子和配基间的相互作用。在悬浮介质时，应使用温和的转动混合或者上下颠倒混合；避免使用搅拌器，否则会导致基质损坏。（二）亲和层析技术10（2）上样。

在样品应用过程中，控制适当流速使样品与配基能充分结合，流速这一参数可以根据目标蛋白和配基之间专一性的相互作用和它们的浓度的不同而变化。（3）洗脱。当目标物质与亲和介质的结合非常紧密时，在开始进行洗脱后，停止流动一段时间（经常在10min到2h），将会有更多的时间使目标蛋白与配基之间解吸附，然后继续进行洗脱，可能提高结合物质的回收率。

洗脱方法分为选择性洗脱和非选择性洗脱。选择性洗脱方法适用于特异性基团配基的解吸附。非选择性洗脱方法要关注维持复合物存在的静电相互作用、疏水性相互作用和氢键等，能够减弱这些力的相互作用的因子可以被用作有效的洗脱因子。3.亲和层析工艺（二）亲和层析技术11（3）洗脱。

洗脱方法主要有以下五种：

①pH洗脱。

②离子强度洗脱。

③竞争性洗脱。

④降低洗脱液的极性。

⑤促溶洗脱。3.亲和层析工艺（三）浓缩技术12

超滤是利用半透膜的微孔结构，以一定的外界压力（0.1～0.3MPa）为推动力，实现对物质选择性地分离、回收的膜分离方法。此法是利用微孔纤维素膜能通过高压将水分滤出，蛋白质远大于膜的截留孔径，不能通过膜而被截留，达到浓缩目的。

超滤浓缩有直板超滤和切向流超滤两种，直板超滤由于液流方向与超滤膜垂直，易发生滤膜堵塞；切向流超滤的液流方向与超滤膜方向平行，阻塞物会被液流及时冲走，极大延缓了滤膜阻塞，是目前工业生产中应用最广泛的浓缩方法之一。超滤蛋白时要求蛋白质分子量要大于膜截留分子量的5倍以上。1.超滤浓缩技术（三）浓缩技术131.超滤浓缩技术超滤膜包小型超滤系统（三）浓缩技术14

可用阴离子介质或阳离子介质最大限度地吸附蛋白，后用含高浓度氯化钠（一般低于1mol/L）洗脱液进行洗脱可得到高度浓缩的蛋白。此法蛋白浓缩程度受介质载量限制，浓缩后蛋白质需要进行脱盐处理。2.离子交换浓缩技术

利用透析袋浓缩蛋白质溶液，浓缩时间长，浓缩初始体积小，多用于实验室。将要浓缩的蛋白溶液放入透析袋，扎紧，把高分子（6000～12000）聚合物，如聚乙二醇、聚乙烯、吡咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可；也可将吸水剂配成30％～40％浓度的溶液，将装有蛋白液的透析袋放入即可。吸水剂用过后，可干燥重复使用。3.透析袋浓缩技术（三）浓缩技术15

冷冻干燥浓缩使蛋白质不易变性，又保持蛋白质中固有的成分，是在冰冻状态下直接升华去除水分。其具体做法是将蛋白液在低温下冰冻，然后移置干燥器内（干燥器内装有干燥剂，如CaCl2和硅胶等），密闭，迅速抽空，并维持在抽空状态。数小时后即可获得含有蛋白的干燥粉末。常采用冻干机进行冷冻干燥。4.冷冻干燥浓缩技术

选用孔径较小的凝胶，如SephadexG25或G50，将凝胶直接加入蛋白溶液中。根据干胶的吸水量和蛋白液需浓缩的倍数而称取所需的干胶量。放入冰箱内，凝胶粒子吸水后，通过离心被除去。5.凝胶浓缩技术（三）浓缩技术16

浓缩胶是一种高分子网状结构的有机聚合物，具有很强的吸水性能。每克干胶可吸水120～150mL。它能吸收低分子量的物质，如水、葡萄糖、蔗糖、无机盐等。浓缩后，蛋白质的回收率可达80％～90％。浓缩胶应用方便，直接加入被浓缩的溶液中即可。必须注意，浓缩溶液的pH应大于被浓缩物质的等电点，否则在浓缩胶表面产生阳离子交换，影响浓缩物质的回收率。6.浓缩胶浓缩技术（三）浓缩技术17（1）三氯醋酸沉淀法。要求的仪器简单，但是常常导致蛋白质变性。（2）免疫沉淀法。要求有特异性抗体。（3）硫酸铵沉淀法。利用高浓度盐将蛋白质析出。（4）（低温）有机溶剂沉淀法。需要低温（4℃以下）下进行，因为10℃时蛋白会在有机溶剂中变性。可用乙醇，丙酮等，需要关注Mg2+离子和溶液pH。（5）聚乙二醇沉淀法（PEG）。聚乙二醇具有良好的生物相容性，只在个别浓度下才使蛋白质稍有变性。PEG溶解时散热低，形成沉淀的平衡时间短，通常达到30%时蛋白质就会达到最大量的沉淀。7.沉淀法生产前准备丰收液的处理亲和层析病毒灭活离子交换层析任务实施18疏水层析置换缓冲液清场12345678抗HER2单克隆抗体纯化

确认是否有前批清场合格证副本，确认生产环境、卫生和设备器具符合要求；填写抗HER2单克隆抗体纯化产前检查记录；领用原辅料和耗材，领用或配制生产用溶液。（一）生产前准备19（1）离心。条件为4800rpm，大于20min，4℃。（2）过滤。采用0.22μm除菌微孔滤芯，控制过滤压力小于滤芯最大允许压力的80%。（3）超滤。膜包截留孔径为50kD，进口端压力小于1.3bar，出口端压力小于0.4bar，每平方英尺膜超滤体积小于50L，浓缩倍数为6倍。（二）丰收液的处理201.层析介质

ProteinA。2.上样液预处理

浓缩后上清液用2mol/LTris母液调pH为7.0～7.5。3.层析缓冲液（1）平衡液。40mmol/LTris-HCl，pH7.2。（2）冲洗液。40mmol/LTris-HCl，0.8mol/LNaClpH7.2。（3）洗脱液。60mmol/LHAc-NaAc，pH3.5。（4）再生液。0.5mol/LNaCl，0.1mol/LNaOH。（三）亲和层析214.层析操作流程

用平衡液预平衡约4倍柱床体积，至流出pH为7.2后上样。

上样完毕后，用平衡液平衡5倍柱床体积，再用3倍柱床体积冲洗液冲洗。再用平衡液平衡3倍柱床体积。用洗脱液洗脱。洗脱时收集A280＞300mAU的样品峰。洗脱完毕用再生液冲洗3倍柱床体积，再用平衡液平衡5倍柱床体积直至流出液pH为中性为止。如长时间不用，以20%乙醇浸泡柱床。

样品上样和洗脱的线性流速控制在60cm/h，其他操作线性流速控制不低于120cm/h。5.洗脱液标准

测量收集液的OD280、OD260值，计算比值应大于1.55，外观澄清。（三）亲和层析22

调节pH至3.2，室温孵育2h。孵育结束后将pH调回7.0。其原理是利用病毒表面抗原在低pH值的条件下，电荷会发生改变，蛋白质的空间结构也会发生不可逆的改变，从而使病毒丧失侵染细胞的能力。

该方法对于无脂包膜类病毒作用微弱（仅部分非脂包膜病毒有效），但在工艺中的低pH（如pH4）处理能灭活几种脂包膜病毒。除此之外，病毒灭活效果可能受pH值、时间和温度、蛋白质浓度、溶质含量等因素影响。（四）病毒灭活231.层析介质CM-FF。2.上样液处理用2mol/LTris母液调节亲和洗脱样品至pH4.4±0.1。3.层析缓冲液（1）平衡液。20mmol/LHAc-NaAc，pH4.4。（2）预洗液。20mmol/LHAc-NaAc、120mmol/LNaCl、pH4.4。（3）洗脱液。20mmol/LHAc-NaAc、380mmol/LNaCl、pH4.4。（4）清洗液。2.0mol/LNaCl。（5）再生液。1.0mol/LNaOH。（五）离子交换层析244.层析操作流程

清洗液清洗30min，再生液冲洗0.5h，流速均为30cm/h。用无菌水冲洗层析柱，用平衡液再平衡10倍柱床体积，至流出液pH为4.4，流速为120cm/h。上样结束后用平衡液平衡5倍柱床体积，预洗液冲洗5倍柱床体积，以洗脱液洗脱。洗脱收集A280＞300mAU洗脱峰。预洗、洗脱流速为60cm/h。以再生液再生6倍柱床体积，流速30cm/h，用无菌水冲洗层析柱，至流出液pH为中性。如长时间不用，以20%乙醇浸泡柱床。5.洗脱液标准

测量收集液的OD280、OD260值，计算比值应大于1.65，外观澄清透明。（五）离子交换层析251.层析介质

Phenyl-HP。2.上样液处理

CM洗脱液加入3mol/L硫酸铵母液至硫酸铵终浓度为1.2mol/L。调节pH至4.8。3.层析缓冲液（1）平衡液。20mmol/LHAc-NaAc、1.2mol/L硫酸铵、pH4.8。（2）洗脱液。40mmol/LNa2HPO4-NaH2PO4、pH6.2。（3）再生液。1.0mol/LNaOH。（六）疏水层析264.层析操作流程再生液冲洗8倍柱床体积，流速30cm/h，用注射用水将其冲洗至中性，平衡液平衡6倍柱床体积，至流出液pH与平衡液一致。上样流速60cm/h。上样后用平衡液平衡6倍柱床体积，流速120cm/h。用洗脱液洗脱，流速60cm/h。收集A280＞300mAU的样品峰。用再生液再生6倍柱床体积，流速30cm/h，用无菌水冲洗层析柱，至流出液pH为中性，长时间不用应用20%乙醇浸泡。5.洗脱液标准测量收集液的OD280、OD260值，计算比值应大于1.70，外观澄清透明。（六）疏水层析27

将疏水层析洗脱峰收集液采用超滤方法进行缓冲液置换，超滤条件为：膜包截留孔径50kD，控制为进口端压力＜1.3bar，出口端压力＜0.4bar，用置换缓冲液等体积稀释8次，将疏水层析洗脱峰收集液浓缩至规定浓度以上，用0.22μm除菌滤器过滤后保存，保存条件为4℃。（七）置换缓冲液28

完成以上各个岗位的操作后，检查、整理各项记录。规范地存放生产用试剂，清洗器具，维护设备，处置废物和废液，清洁、消毒工作台和洁净室。最后，填写清场合格证。（八）清场29注意：请在任务实施过程中规范填写《抗HER2单克隆抗体纯化操作记录》，不可补填和篡改！知识学习反思与反馈学习成果实践操作考核与评价30拓展任务白蛋白溶液透析法浓缩31课前查阅资料，了解白蛋白及其性质。查阅设计《白蛋白溶液透析法浓缩操作记录》，在任务实施过程中同步填写。使用透析浓缩技术，将白蛋白溶液进行10倍体积浓缩。设计实操设计（一）任务描述32（二）实训材料1.材料、试剂白蛋白溶液（采用紫外法测定蛋白浓度）、聚乙二醇（PEG）6000、透析袋（500～1000）2.仪器设备分析天平（感量0.01g）、磁力搅拌器、移液枪等33（三）实训操作34步骤一配制透析液配制35％浓度的聚乙二醇（PEG）6000溶液。步骤二制备浓缩蛋白液（1）透析袋的前处理。戴好P