色谱法的基本原理

关于色谱法的基本原理2.1色谱法概述

2.1.1色谱法的起源和发展

胡萝卜素(黄色)石油醚+植物色素石油醚CaCO3固定相叶绿素(绿色)叶黄素(黄色)第2页,共90页，2024年2月25日，星期天液液分配色谱硅胶水乙醇－氯仿(流动相)各种氨基酸硅胶为载体水为固定相第3页,共90页，2024年2月25日，星期天年代发明者发明的色谱方法或重要应用1906Tswett用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念。1931Kuhn,Lederer用氧化铝和碳酸钙分离a-、b-和g-胡萝卜素。使色谱法开始为人们所重视。1938Izmailov,Shraiber最先使用薄层色谱法。1938Taylor,Uray用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。1941Martin,Synge提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作为流动相（即气相色谱）。1944Consden等发明了纸色谱。1949Macllean在氧化铝中加入淀粉黏合剂制作薄层板使薄层色谱进入实用阶段。1952Martin,James从理论和实践方面完善了气-液分配色谱法。1956VanDeemter等提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。1957

基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。1958Golay发明毛细管柱气相色谱。1959Porath,Flodin发表凝胶过滤色谱的报告。1964Moore发明凝胶渗透色谱。1965Giddings发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。1975Small发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制型电导检测的新型离子色谱法。1981Jorgenson等创立了毛细管电泳法。第4页,共90页，2024年2月25日，星期天一、色谱法的定义2.1.2色谱法定义和分类定义：利用不同溶质（样品）与固定相和流动相之间的作用力（分配、吸附、离子交换等）的差别，当两相做相对移动时，各溶质在两相间进行多次平衡，使各溶质达到相互分离。特点：

高超的分离能力，是一种物理化学分析方法第5页,共90页，2024年2月25日，星期天具体优点：（1）分离效率高。（2）应用范围广。（3）分析速度快。（4）样品用量少。（5）灵敏度高。（6）分离和测定一次完成。（7）易于自动化，可在工业流程中使用。定性能力较差。

色谱法的缺点第6页,共90页，2024年2月25日，星期天二、色谱法的重要概念固定相流动相色谱柱

第7页,共90页，2024年2月25日，星期天1、按流动相所处的状态分类

气相色谱---用气体作流动相液相色谱---用液体作流动相气—固色谱气—液色谱液—固色谱液—液色谱三、色谱法的分类超临界流体色谱第8页,共90页，2024年2月25日，星期天2、按固定相使用的形状分类①柱色谱：固定相装在柱管内。②纸色谱③薄层色谱(纸色谱和薄层色谱又统称作平板色谱)第9页,共90页，2024年2月25日，星期天第10页,共90页，2024年2月25日，星期天第11页,共90页，2024年2月25日，星期天3、按分离过程的物理化学原理分类

①吸附色谱(L－S，G－S)②分配色谱(L－L，G－L)③离子交换色谱(L－S)④空间排阻色谱(L－S)第12页,共90页，2024年2月25日，星期天吸附色谱(L－S，G－S)第13页,共90页，2024年2月25日，星期天分配色谱(L－L，G－L)ConditionedsorbentGoodtransportbetweensampleandsorbent硅胶水第14页,共90页，2024年2月25日，星期天离子交换色谱(L－S)OHElectrostaticattractionSilicabaseCO2HCO2-OCON(CH3)2+NNH3+SO3-

第15页,共90页，2024年2月25日，星期天空间排阻色谱(L－S)第16页,共90页，2024年2月25日，星期天2.2色谱分离原理1.分配系数（K）Cs：被测组分在固定相中的浓度Cm：被测组分在流动相中的浓度2.2.1分配系数和分配比

第17页,共90页，2024年2月25日，星期天分配系数意义：①K是热力学常数，K值除了与温度、压力有关外，还与被测物、固定相和流动相的性质有关。②K值大→Cs大→tR长→移动速度慢。③若两组分的K值相等→两个组分分离开。

第18页,共90页，2024年2月25日，星期天2.分配比（k）β：相比

第19页,共90页，2024年2月25日，星期天分配比的意义：①k随K和β的变化而变化；②k值越大→ms越多→柱的容量大

k又称作容量因子。③k是表征色谱柱对被测组分保留能力的主要参数。第20页,共90页，2024年2月25日，星期天2.2.2色谱法分离原理第21页,共90页，2024年2月25日，星期天色谱分离过程的特点：不同组分在通过色谱柱时移动速度不等。流动相BBA空气BA+BA检测和记录A+B+空气进样固定相流动相第22页,共90页，2024年2月25日，星期天10020030040050.0310.00160.0780.00470.1180.00880.1380.01490.1380.021100.1250.03110.1050.04120.0830.045130.0630.05第23页,共90页，2024年2月25日，星期天2.3色谱流出曲线

五种磺胺的色谱图第24页,共90页，2024年2月25日，星期天气相色谱分离多环芳烃色谱图第25页,共90页，2024年2月25日，星期天一、色谱流出曲线或色谱图以检测器对组分的响应信号为纵坐标，流出时间(或流出体积)为横坐标作图所得的曲线。

R——f(t,V)二、色谱流出曲线构成：由基线和色谱峰组成。基线：指仅有流动相通过而没有待测物，检测器响应信号随流出时间的变化。色谱峰：在基线上突起的部分，它是由引入流动相中被测物引起的。第26页,共90页，2024年2月25日，星期天色谱图或色谱流出曲线第27页,共90页，2024年2月25日，星期天描述色谱峰三种参数

峰高(或峰面积)——

峰的大小

区域宽度——

峰的形状

保留值(时间t、体积v)——

峰的位置2.3.1色谱峰高斯分布曲线第28页,共90页，2024年2月25日，星期天1．峰高h2．标准偏差σ，0.607h处，拐点处，峰宽正好为2σ3．峰面积AA＝1.065hY1/24．半峰宽Y1/2Y1/2=2.354σ5．峰底宽Y=4σ，拐点作切线与基线相交，相交两点间距离为峰底宽Y。Y1/2、Y统称为区域宽度第29页,共90页，2024年2月25日，星期天

通常用将各组分带出色谱柱所需的载气体积或时间表示。2.3.2保留值定义：

在一定的固定相和操作条件下，任何一种物质都有一个固定的保留值，故组分的保留值可用于该组分的定性鉴定。特点：第30页,共90页，2024年2月25日，星期天1．死时间tM说明：①实际上就是流动相通过色谱柱所需要的时间。或是组分在流动相中所消耗的时间。②tM由色谱柱中流动相体积Vm与流动相流速决定，与被测组分和固定相无关。第31页,共90页，2024年2月25日，星期天2.保留时间tR

定义：从进样开始到柱后,组分出现响应信号极大值时所需时间。说明：组分的保留时间就是组分通过色谱柱所需的时间。即组分在色谱柱内运行的时间。影响因素：①流动相——性质、在色谱柱中的体积Vm和流速②固定相——性质、在色谱柱中的体积Vs；③被测组分——性质第32页,共90页，2024年2月25日，星期天3.调整保留时间（）定义：扣除死时间后的保留时间。说明：组分在固定相中停留的时间。=

注意：第33页,共90页，2024年2月25日，星期天4.流动相的流速

定义：单位时间流动相所通过的距离----线流速，u单位时间通过流动相的体积-----体积流速，F单位时间通过流动相的量-----质量流速，Fm和摩尔流速，Fn)F、Fm和Fn常称作流量。第34页,共90页，2024年2月25日，星期天线流速l/t(m/min)体积流速v/t(ml/min)质量流速m/t(g/min)F说明：①在流路的任何一点，质量流速或摩尔流速相等。Fm=Fn②对于气相色谱，线流速和体积流速可能各处不同；对于液相色谱，线流速可能不一样，但体积流速可视为各处相同。气体状态方程不同位置处，线流速不同第35页,共90页，2024年2月25日，星期天气相色谱中柱内平均体积流速的确定c点处的平均体积流速为柱内气体的平均摩尔流速

为流量计内r处气体的摩尔流速Fc很难测，且为柱内平均值，Fr易测，求Fr与Fc的关系即可。第36页,共90页，2024年2月25日，星期天第37页,共90页，2024年2月25日，星期天第38页,共90页，2024年2月25日，星期天柱内平均压力Pcr点处载气的压力Pr

Pr=Po－Pw第39页,共90页，2024年2月25日，星期天压力校正项湿度校正项温度校正项第40页,共90页，2024年2月25日，星期天5.死体积VM定义：不被固定相保留的组分，通过色谱柱时所需流动相的体积。

计算：VM

=tM

第41页,共90页，2024年2月25日，星期天6.保留体积VR

定义：从进样开始到柱后出现待测组分响应信号极大值时所通过的载气体积。计算：

VR=tR

注意：各种保留时间受流动相流速的影响，各种保留体积与流动相流速无关。第42页,共90页，2024年2月25日，星期天7.调整保留体积定义：保留体积扣除死体积后的体积计算公式：

==VR－VM

计算公式：第43页,共90页，2024年2月25日，星期天8.相对保留值r2,1

（选择性因子

α

）定义：相对保留值r2,1是指组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比公式：α越大→两组分容易分离；α=1时→两组分不能分开。说明：α只与柱温和固定相性质有关第44页,共90页，2024年2月25日，星期天9.保留值与分配比的关系被测物在色谱柱内的平均线流速ūx为流动相在色谱柱内的平均线流速ū为L为色谱柱长被测物出现在流动相中的几率为

ūx与ū的关系为第45页,共90页，2024年2月25日，星期天色谱柱长是一定的，所以

第46页,共90页，2024年2月25日，星期天色谱过程方程：表达了保留时间与分配系数或容量因子两个重要参数的关系。

①容量因子越大，溶质的保留时间也越长。

②对于混合物，分配系数不等是分离的前提。第47页,共90页，2024年2月25日，星期天例2.1已知Vs=2.0mL，Fc=50mL·min-1，tR=5min，tM=1min。求VM，VR，，k，K。

第48页,共90页，2024年2月25日，星期天第49页,共90页，2024年2月25日，星期天

色谱流出曲线可以解决的问题1．样品所含最少组分个数2．可以进行定性分析3．可以进行定量分析4．可对色谱柱效能进行评价5.色谱过程的热力学问题6.色谱过程的动力学问题总结第50页,共90页，2024年2月25日，星期天色谱理论

色谱理论需要解决的问题：影响分离及柱效的因素与提高柱效的途径，柱效与分离度的评价指标及其关系色谱分离过程的热力学和动力学问题。。第51页,共90页，2024年2月25日，星期天2.4塔板理论

第52页,共90页，2024年2月25日，星期天2.4.1塔板理论的假设1.柱分成n段，n为理论塔板数，每段高为H，H为塔板高度，柱长为L，则n=L/H2.所有组分开始都加在第零号塔板上。3.在每块塔板上被测物在两相间平衡是瞬间建立的。4.流动相是以脉冲式(塞子式)进入色谱柱进行冲洗的，每次恰好为一个塔板体积ΔV。5.在所有塔板上，同一组分的分配系数为常数，即和组分的量无关。6.沿色谱柱方向不存在塔板与塔板间被测物的纵向扩散。第53页,共90页，2024年2月25日，星期天第54页,共90页，2024年2月25日，星期天假定：K=1Vs/Vm=1k=1n=5进样量m=1mg

板体积数（ΔV）0123400.50.51ΔV0.250.250.250.252ΔV0.1250.250.1250.1250.250.1253ΔV0.06250.1880.1880.06250.06250.1880.1880.06254ΔV0.03120.1250.1880.1250.03120.03120.1250.1880.1250.0312检测器第55页,共90页，2024年2月25日，星期天这一理论得到结果1．分布有一最大，两边逐渐减小2．色谱流出曲线的形状类似于数学上的正态分布曲线正态分布方程为：第56页,共90页，2024年2月25日，星期天C：不同流出体积时的组分浓度m：进样量VR：保留体积n：塔板数V：流出体积将正态分布方程用于色谱流出曲线方程的数学表达式，也称塔板理论方程：第57页,共90页，2024年2月25日，星期天令：σ为标准偏差

令：m=1

当V＝VR时，

当则则：第58页,共90页，2024年2月25日，星期天将代入第59页,共90页，2024年2月25日，星期天由Y1/2=2.354σ

和

Y=4σ

可证明Y1/2=0.5885Y第60页,共90页，2024年2月25日，星期天为了准确评价色谱柱效能，宜采用有效塔板数neff和有效塔板高度Heff第61页,共90页，2024年2月25日，星期天理论塔板数和有效塔板数关系说明：对于n和neff以及H和Heff，用同一色谱柱时对不同物质是不一样的；同一物质，对不同柱子也不一样。第62页,共90页，2024年2月25日，星期天塔板理论的成功与不足成功：1、导出了色谱流出曲线的数学表达式；2、说明了色谱峰的形状呈正态分布；3、解释了浓度极大点；4、提出了评价柱效的参数(n)及其计算式不足：1、仅考虑了热力学因素，没有考虑动力学因素；2、不能说明影响柱效的因素及谱带扩张的原因；3、不能说明流动相流速对柱效的影响，而实验事实是流速不同时测得的n

(或H)不同第63页,共90页，2024年2月25日，星期天2.5速率理论2.5.1气相色谱法色谱过程的动力学理论塔板高度H与载气线速度的关系第64页,共90页，2024年2月25日，星期天A

为涡流扩散项，B

为分子扩散项系数，C

为传质阻力项系数，为载气的平均线流速范弟姆特方程第65页,共90页，2024年2月25日，星期天1．涡流扩散项——AA=2λdPλ：填充不规则因子dP：填充物颗粒的平均直径第66页,共90页，2024年2月25日，星期天第67页,共90页，2024年2月25日，星期天影响：

填充物颗粒的大小、分布以及填充均匀的程度；不受影响：载气性质、线速度和组分无关。减小涡流扩散提高柱效的有效途径：使用适当小的颗粒，且颗粒均匀的填充物，并尽量填充均匀。对于空心毛细管柱，A=0。A=2λdP第68页,共90页，2024年2月25日，星期天12与颗粒的均匀程度有关及填充的均匀程度有关第69页,共90页，2024年2月25日，星期天2．分子扩散项——分子扩散项的系数B

：

B=2

Dg

：

弯曲因子Dg：组分在气相中的扩散系数(cm2·s-1)第70页,共90页，2024年2月25日，星期天第71页,共90页，2024年2月25日，星期天γ与填充物有关：对于填充柱，γ=0.5～0.7；对于毛细管柱，γ=1.0。

Dg与组分的性质、载气的性质、柱温和柱压等因素有关：

①分子量大的组分Dg小；

②Dg反比于载气分子量的平方根,故采用分子量较大的载气可使B项降低；

③Dg随柱温升高而增大，而随柱压增大而减小。B=2

Dg第72页,共90页，2024年2月25日，星期天3．传质阻力项

—

C传质：物质因浓度不均匀而发生的迁移过程称为传质传质阻力：影响此迁移过程速度的阻力称为传质阻力传质阻力种类：包括气相和液相传质阻力，而传质阻力系数也包括气相传质阻力系数Cg和液相传质阻力系数ClC=Cg+Cl

第73页,共90页，2024年2月25日，星期天气相传质过程气相传质过程是待测组分从气液界面移动到气相内部而后又移动到液相表面的过程。第74页,共90页，2024年2月25日，星期天影响：Cg与填充物粒度dp的平方成正比，与组分在载气流中的扩散系数Dg成反比。解决方法：因此采用粒度小的填充物和分子量小的气体作载气可使Cg减小,从而提高柱效。对于填充柱：气相传质阻力系数第75页,共90页，2024年2月25日，星期天液相传质过程液相传质过程是指待测组分从气液界面移动到液相内部，发生质量交换以达到分配平衡，然后又返回气液界面的传质过程。第76页,共90页，2024年2月25日，星期天影响：固定相液膜厚度（df）和组分在液相中的扩散系数（Dl

）。解决方法：减小液膜厚度df，增大组分在液相中的扩散系数Dl，均可提高柱效。液相传质阻力系数第77页,共90页，2024年2月25日，星期天速率理论方程①填料性质：填料颗粒均匀程度、填料颗粒大小②填充情况：填料在色谱柱中填充均匀程度③流动相：流动相种类和流速④固定相：固定液厚度公式说明影响n或H的因素结论：范弟姆特方程对色谱分离条件的选择具有指导意义第78页,共90页，2024年2月25日，星期天2.6分离度(Rs)2.6.1定义Rs是相邻两组分色谱峰保留值和之差与两个组分色谱峰峰底宽Y1和Y2总和的一半的比值衡量色谱图中相邻两峰分离程度意义第79页,共90页，2024年2月25日，星期天热力学因素（两峰离开距离）动力学因素（两峰宽窄）第80页,共90页，2024年2月25日，星期天不同分离度下色谱峰示意图通常用Rs=1.5作为相邻两色谱峰完全分开的指标R=0.8：两峰的