新编免疫组化课件

第一局部免疫细胞化学的理论根底

免疫细胞化学是免疫学与细胞化学相结合的一个分支学科，以免疫学的抗原抗体反响为其理论根底。第一节抗原〔antigen〕一、抗原的概念是一类在适宜的条件下，能激发机体免疫系统发生免疫应答，并能与免疫应答产生的效应物质在体内和/或体外发生特异性结合反响的物质。抗原的性能：免疫原性产生免疫应答反响原性产生特异性反响二、抗原决定簇是与相应抗体或淋巴细胞抗原识别受体相结合的部位，是决定和控制抗原特异性的特殊化学基团。类型：功能性抗原决定簇隐蔽性抗原决定簇免疫优势决定簇线性或连续性决定簇构象决定簇或不连续性决定簇B细胞所识别的是半抗原决定簇；T细胞所识别的是免疫原性决定簇或连续性决定簇。三、抗原的性质与种类〔一〕抗原的性质1、抗原的异物性机体能对进入体内的异种、异体的大分子物质产生免疫应答。该物质与机体的种系关系愈远，其免疫原性愈强，机体的免疫反响也更强。自身抗原；自身抗体2、大分子胶体作为抗原，分子愈大，其免疫原性愈强3、抗原的特异性各种抗原物质各有其特异的抗原决定簇，即一种抗体只能与相应的抗原起反响而不能与其它抗原反响。〔二〕抗原的种类方法分类依据种类单独存在时是否有免疫原性半抗原和完全抗原抗原来源外源性抗原和内源性抗原抗原与宿主关系异种抗原，同种异体抗原，自身抗原B细胞产生抗体时是否需要T细胞辅助胸腺依赖抗原，胸腺非依赖抗原化学物质蛋白质，多糖，脂蛋白，脂多糖，糖蛋白，核酸等物理状态颗粒性抗原，可溶性抗原产生方式天然抗原，人工合成抗原，基因工程抗原抗原特异性程度特异性抗原，共同抗原完全抗原：同时具有免疫原性和反响原性的物质。不完全抗原或半抗原：无免疫原性。第二节抗体〔antibody〕一、抗体的概念机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答，B淋巴细胞活化、增殖、分化为浆细胞，由浆细胞合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反响的球蛋白。二、抗体的性质和种类〔一〕抗体的一般性质免疫球蛋白约等于抗体，分五类：IgG,IgM,IgA,IgD,IgE〔二〕免疫原性和分类特性免疫球蛋白都是大分子蛋白质，具有免疫原性，课作为抗原。由于存在着轻链和重链，可变区和稳定区，因此，分子结构差异较大，免疫原性比较复杂。〔三〕抗体的种类1、根据抗体的途径或来源不同分为免疫抗体；天然抗体；自身抗体2、根据抗原抗体在试管内是否出现肉眼反响分为完全抗体；不完全抗体三、抗原与抗体反响称为免疫学反响。在体内进行称为免疫反响；在体外称为血清学反响四、抗体形成的机制〔一〕免疫应答的产生1、感应阶段〔识别及加工处理抗原阶段〕2、反响阶段〔淋巴细胞增殖分化阶段〕3、效应阶段〔发生免疫反响阶段〕〔二〕影响抗体产生的因素1、抗原的质和量2、机体方面3、佐剂的增强免疫作用单克隆抗体与多克隆抗体特性的比较特性多克隆单克隆组成多种类抗体的混合物单一种类的抗体特异性低高针对多个抗原决定族针对单一的抗原决定族亲和力平均亲和力较高不定，较低交叉反响高低〔二〕抗体的配制方法1、抗体贮存2、抗体使用液的配制二、组织材料的处理尽量保存好抗原性不丧失、不扩散、不被破坏三、免疫染色1、增强特异性染色方法蛋白酶消化法；适宜的抗体稀释度；温育时间2、减少或消除非特异性染色方法3、显色反响的控制4、复染四、对照阳性对照；阴性对照五、结果的判断〔一〕阳性细胞的染色特性1、分胞浆、细胞核、细胞膜外表阳性2、灶状和弥漫性3、非特异性的认知4、切片质量不佳出现的阳性要排除〔二〕染色失败的几种原因二、荧光素1、荧光色素能够产生荧光并能作为染料的化合物称为－－－－。特性：必须具备吸收激发光的光能并发射荧光；具有吸收一定频率光能的生色团和能产生一定光亮子的荧光团。2、用于标记抗体的荧光素必须具备以下条件：1〕应具有与蛋白质分子形成共价键的化学基因，结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物容易排除。2〕荧光效率高，与蛋白质结合荧光效率下降不多。3〕结合抗体蛋白后对抗体的免疫学性质和生化性质无影响。4〕与蛋白质结合的方法简便而快速。5〕荧光素容易溶解，溶解后不会与其它物质发生化学反响。6〕荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色比照鲜明，能清晰判断结果。3、荧光素的类型1〕异硫氰酸荧光素〔fluorescienisothocyanate,FITC)2〕四甲基异硫氰酸罗达明〔tetraethylrhodamineisothocyanate,TRITC)3〕四乙基罗达明〔tetraethylrhodamine,RB200)4〕其它三、免疫荧光染色方法1、直接法：用特异性抗体与荧光素结合，制成特异性荧光抗体，直接用于细胞和组织抗原的检查。优点：特异性高缺点：一种荧光抗体只能检测一种抗原。2、间接法：用特异性的抗体〔1抗〕与细胞或组织标本反响，随后用缓冲液洗去未与抗原结合的抗体，再用间接荧光抗体〔2抗〕与结合再抗原上的抗体结合，形成抗原→抗体→荧光抗体的复合物。优点：荧光亮度增强，提高了敏感度四、非特异性染色的消除方法1、非特异性染色的主要因素1〕局部荧光素未与蛋白质结合，形成聚合物和衍化物而不能被透析除去。2〕抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分非特异结合。3〕组织内类属抗原的存在。4〕从组织中难以提纯抗原性物质。5〕抗体分子上标记的荧光素太多。6〕荧光素不纯，标本固定不当。7〕细胞和组织内某些物质自发荧光。8〕染色时间过长，温度过高，冲洗不够或标本枯燥。2、消除的方法1〕衬染法〔可抑制自发荧光〕2〕胰蛋白酶消化〔可抑制非特异性荧光〕3〕吸收〔用小属肝粉消除组织非特异性荧光的染色〕4〕用正常〔非免疫〕血清〔去除自发荧光和非特异性荧光〕5〕提高抗体和荧光抗体的质量五、荧光显微镜及检测方法略六、染色标本的保存原那么上应立即再荧光显微镜下观察，拍照，此时荧光最强。用缓冲甘油封片，保存在4℃中，过夜后特异性荧光强度减弱25％，保存1周后减弱60％。Nikon荧光显微镜肾活检〔直接法〕肾活检〔直接法〕肾活检〔直接法〕低倍视野肾活检〔直接法〕，表达弱肾活检〔直接法〕肾活检〔直接法〕左图：表达在细胞核〔FITC〕右图：表达在胞膜左图：DAPI染色〔染核〕右图：胃粘膜上皮细胞，胞浆胞膜阳性血管内弹力膜阳性胃腺癌二、固定原那么是保持组织形态良好和被检测抗原的前提下，应采用浓度最低的固定剂和最短的固定时间，固定时间一般为1～12h。1.常用的固定剂〔1〕甲醛缓冲液广泛应用于病理标本的固定，甲醛在很好地保护组织形态结构完整的同时也有效地保存某些抗原。由于甲醛的交联作用会影响被固定细胞膜的通透性不利于染色时抗体的渗透，因此染色前常用酶进行消化以使抗原决定簇充分暴露，固定时间不直超过24h。〔2〕4％多聚甲醛磷酸缓冲液广泛应用于光镜细胞化学研究。〔3〕戊二醛～多聚甲醛缓冲液适用于光镜、电镜免疫组织化学研究。〔4〕其它如PLP液〔过碘酸~赖AA~多聚甲醛固定液〕、丙酮及醇类、锇酸等。2.固定本卷须知〔1〕固定液的选择标准：A.组织形态结构保存良好。B.最大限度保存抗原的抗原性。〔2〕组织块的大小：1.5cm×1.5cm×0.5cm为宜。〔3〕固定时间：与组织块大小成正比，与固定液浓度成反比。〔4〕温度：一般在室温下进行，电镜标本和固定时间较长时可放置在4℃冰箱。〔5〕固定后处理：充分冲洗，除去多余固定剂。三、包埋1.石蜡包埋2.冷冻包埋3.环氧树脂包理四、切片1.载玻片的处理〔1〕清洗〔2〕涂胶〔防止脱片〕。常用粘附剂：①明胶：铬矾明胶和甲醛明胶。②树脂胶：也称白胶。③多聚赖氨酸〔PLL〕。④商品化粘附剂。2.切片类型〔l〕石蜡切片厚约3～5μm，放置37℃温箱烘烤过夜，以减少脱片。〔2〕冷冻切片：2μm。〔3〕振动切片：特点是组织经固定后不需包埋，只要用胶水粘在载物台上即可切片。切片较厚，可将阳性部位作电镜包埋。神经组织应用较多。3.非特异染色的控制非特异染色或背景染色是指在免疫组化染色过程中凡不属于特异性抗原抗体反响所出现的染色。〔1〕原因分析组织方面：主要有组织的自发荧光、内源性过氧化物酶或碱性磷酸酶、内源性生物素等.试剂方面：因抗体不纯、标记的酶和荧光不纯或标记过量等。〔2〕消除方法加1抗前加正常血清10～30min，以封闭组织中带电荷的基因，防止与1抗的非特异性结合。减少非特异性染色：a.免疫酶组化染色时，在加1抗前，用0.3%的H2O2甲醇溶液将组织切片处理30min〔3%的H2O2甲醇溶液处理5～10min〕。b.免疫荧光染色时，可用0.01～0.05％伊文思蓝稀释荧光抗体。二、对照阳性对照片：用抗原为阳性的标本作对照阴性对照片：确认不含己知抗原的标本作对照三、抗体的分装、稀释、滴加及保存1.抗体的分装不能用完的抗体分装在小的EP管内，保存在-20～-40℃的低温冰箱中持用可保持数年有效。2.抗体稀释常用0.01MPBS〔磷酸缓冲溶液〕或BSA〔牛血清白蛋白〕3.滴加滴加抗体要充分覆盖组织切片，一般加30～50μL,最好在滴加前，用蜡笔或特制的组化笔在组织周围画一圈,以防溶液的扩散。4.保存未用完的抗体可在低温冰箱或冻干保存，已稀释未用完的抗体最好在一周内用完，不宜长期保存。〔2〕间接法原理：先用标记的特异性1抗与标本中相应抗原结合，再用酶标记的抗球蛋白抗体〔2抗〕孵育，然后再加酶的底物，显示抗原～抗体～抗原抗体复合物存在的部位，以对抗原进行检测。如：1抗是由兔产生的多克隆抗体,那么2抗常用羊抗兔IgG；1抗是由鼠产生的单克隆抗体,那么2抗常用羊或马抗鼠IgG。以上两种方法称为酶标抗体法〔3〕非酶标记的抗体酶法：是以酶为抗原免疫动物，产生抗酶的抗体。通过酶与抗体的特异性结合进行标记。该方法适用于石蜡包埋的组织切片。常用的有PAP、sABC、LsAB法〔附图表说明〕〔酶标识特异抗体］〔酶标识二次抗体］生物素

HRPALP第三节免疫组化的实际操作1.实验准备〔必须器材〕〔1〕实验台：光线充足，方便操作。〔2〕湿润盒：放置抗原抗体反响过程中反响，防止枯燥。〔3〕微量移液器：1～20μl,20～200μl,100～1000μl。〔4〕其它：滤纸、纱布、吸头、EP管、染缸、提篮等。2.试剂药品〔1〕缓冲液：PBS,0.01M磷酸缓冲液〔pH7.2〕TBS,0.05MTris盐酸缓冲液〔pH7.6〕〔2〕抗体稀释液:1％BSA或0.01MPBS〔3〕10％2抗免疫动物的正常血清〔4〕DBA～H2O2显色液〔5〕核复染液：苏木素或甲基绿3.sABC法的操作过程根本原理：sABC〔strepto-avidin-biotinperoxidasecomplex〕链球菌～抗生物素〔卵白蛋〕～生物素～过氧化物酶复合物生物素(biotin):是一种分子量为244da的小分子的维生素。抗生物素(avidin):是一种糖蛋白，分子量为68KDa。生物素与抗生物素有很强的亲和力，两者一旦结合就很难解离。同时生物素与抗生物素都有与其它示踪剂如荧光素，胶体金和过氧化物酶等相结合的能力。所以生物素---抗生物素系统具有灵敏度高、特异性强及方便快速等显着优点。附根本操作步骤第四节本卷须知及结果判定要想得到理想的结果，组织细胞形态的保存、抗原性的保存、充分的显示是非常必要的。要满足这些条件，取材、固定、切片厚度、操作过程、抗体浓度及特异性的选择、操作前蛋白酶的消化、抗原修复及显色等各程序的操作不当均可导致不满意结果的产生。1.取材固定标本要尽可能新鲜，取材固定要及时，固定液要新鲜充足，防止组织破坏和抗原性的失活。2.切片切片不宜过厚，一般4μm左右。切片不宜过大，载玻片要涂粘附剂，以防脱片。切好的切片暂放37℃温箱保存。3.脱蜡脱蜡一定要彻底，新鲜二甲苯5min×3。4.蛋白酶消化由于组织在固定时抗原决定簇可能被固定剂所封闭，因此在抗原抗体反响前常用蛋白酶处理组织切片〔根据1抗要求〕，使抗原决定簇充分暴露出来，并使组织通透性增高，使抗体充分结合抗原，增强特异性染色。一般用0.1%胰蛋白酶或胃蛋白酶消化5～30min。5.抗原修复一般在柠檬酸钠抗原修复液内，微波炉，85～95℃，10min左右。6.抗体的选择选择抗体时要注意是用于冰冻切片还是用于石蜡切片的抗体，或是二者均可；其次要看抗体说明，是单抗还是多抗；适用于哪些组织；抗体来源于哪种动物，由此来选择2抗；还有抗体的稀度〔在实验前根据预实验选择最正确浓度］。7.特异性确实定阴性对照〔不加1抗，用PBS或TBS代替〕阳性对照〔确定阳性的组织〕或买阳性对照片显色：注意H2O2的浓度，必须在显示前参加H2O2均匀搅拌，最正确显色时间在3～5min，过短或过长都不会出现满意的效果。9.复染一般用苏木素30s～1min，过长复染将掩盖免疫组化的染色效果。10.结果判定判断是否阳性或阴性，要排除假阳性或假阴性结果。也要学会判断特异性染色和非特异性染色。呈色深浅可反映抗原存在的数量，可作为定性、定位和定量的依据。有关阳性结果的定量判断，常规的方法是根据呈色深浅和阳性细胞数量分类计算，以〔-〕,+,++,+++等分级和计数统计。以下用图片说明胃癌淋巴结转移cerbB-2癌基因表达sABC法胃癌，P53抑癌基因表达，sABC法胃癌CerbB-2的表达，sABC法胃癌cerbB-2的淋巴管侵袭，sABC法胃淋巴组织反响性增生，CD20/CD43检测sABC法胃组织中的反响性增生的淋巴组织，CD43表达，sABC法IgAN，TGFs2表达，主要在近曲肾小管内，sABC法IgAN,TGFs2的表达，sABC法IgAN，bFGF的表达，sABC法IgAN,PDGF的表达，sABC法骨骼肌营养不良，myosin蛋白表达，sABC法第五节免疫组织化学在病理诊断中的应用范围1.肿瘤诊断未分化恶性肿瘤性质判定；圆形、梭形、多形性肿瘤细胞鉴别；转移肿瘤的原发部位确实定。2.淋巴瘤的诊断鉴定反响性增生疾病与淋巴瘤；各种淋巴瘤的分型。3.内分泌肿瘤的诊断〔检测肿瘤分泌的激素)4.软组织肿瘤；神经系统肿瘤5.小活检组织病理检查〔能明确显示瘤细胞存在与否)6.微小癌、微小转移灶〔淋巴结和骨髓)7.细针穿刺〔细胞学诊断)8.局部肿瘤来源分类9.乳腺癌激素受体检测〔ER，PR)10.肿瘤基因产物〔p53,cerb-B2,ALK,CDs)11.增殖细胞核抗原〔Ki-67，PCNA)判定肿瘤的预后12.病因诊断〔HBV，HCV，EBV，CMV，HIV等)〔2〕固定固定液的选择：既要保存细胞的超微结构，又要尽可能的保存抗原的活性。A.多聚甲醛加低浓度的戊二醛固定液〔PG固定液〕B.过碘酸盐～赖氨酸～多聚甲醛混合固定液〔PLP固定液〕C.苦味酸～多聚甲醛～戊二醛固定液〔PAPG固定液)固定方法与时间：A.血管灌注固定〔最好方法〕B.浸泡固定C.微波固定包埋前与包埋后的比较包埋前包埋后优点缺点修正未经锇酸固定、脱水、树脂包埋及高温聚合的过程，标记的阳性率高，提高电镜的检出率。免疫染色完毕后用戊二醛与锇酸作后固定，可使抗原抗体结合的更加牢固，并有利于膜结构的保存。标记前细胞内抗原受到标记抗体的穿透性限制（因是组织块）制作厚切片；增加细胞膜的通透性具有阳性结果重复性高、方法简便可靠的优点，可对同一组织块的连续切片作各种对照染色，能十分准确的解释染色结果，而且还能在同一张切片上进行多重免疫染色。抗原在脱水、浸透及树脂包埋过程中可能被破坏，使免疫染色的阳性率下降。细胞膜保存差（锇酸作用）固定液选择苦味酸(保护细胞膜)包埋剂协作低温树脂肝细胞内的内质网和核膜，可见G-6-P酶阳性反响产物。(×32000)肝细胞。箭头指线粒体，线粒体嵴、内膜基质侧呈现琥珀酸脱氢酶阳性反响颗粒〔×36000〕。IgAN,TGFs2的表达，免疫金银法IgAN,TGFs2的表达，免疫金银法K4M低温包埋剂和紫外线低温包埋机联合的免疫电镜法〔实验结果介绍〕一、紫外线低温包埋机〔SPI#17020〕

SPI#17020是美国特殊研制的低温包埋机，它最主要的特点是采用数字化温度控制，通常采用干冰制冷，也可以使用液氮制冷，温度可以控制在-10℃～-37℃之间。通过温度控制风扇可以使机内的温度控制在某一恒定温度，持续长达36小时，完全可以满足低温脱水、浸透和包埋所需的时间。它占地面范围小，但机内空间较大，可以同时放入72个包埋胶囊。而且机箱上方有两个封闭起来的波长为360nm的紫外灯，低温和室温下的紫外线聚合都可以在包埋机中进行。总之，紫外线低温包埋机是很理想的低温脱水、浸透、聚合的机器。

二、LowicrylsK4M低温包埋剂

LowicrylsK4M是丙烯酸盐和甲基丙烯酸盐化学物质，其特点是能在低温下保持低粘度，能很快渗入组织以及具有在波长360nm的紫外光照射下聚合的能力，它的光聚合作用与温度无关，而且LowicrylsK4M具有亲水性，因此它能较好地保持组织结构和抗原性，减少背景染色。三、方法1.包埋剂的配制商品提供的LowicrysK4M包埋剂由三个局部组成：单体，交联剂和引发剂。调整单体和交联剂的比例，增加交联剂的量，组织块的硬度增加。中等硬度的组织块，其配制比例如下：〔1〕LowicrylsK4M：单体17.30g；交联剂2.70g；引发剂0.10g。可量取后，注入棕色的玻璃容器避光，用玻璃棒轻搅3～5分钟。勿过分搅拌，以防空气的气泡进入包埋剂中。〔2〕LowicrylsK4M的贮存：应保存在暗处室温下，该物质有刺激性，在配制时应戴手套，以免触及皮肤。在通风橱内操作，以免蒸气刺激眼睛。如触及皮肤和眼睛，应立即以水冲洗局部。2.组织和细胞的取材、固定、处理〔1〕组织的取材与固定：用锐刀将新鲜组织切成1～3mm3的小块,迅速置于3%多聚甲醛-1%戊二醛固定液中,2～3h。〔2〕