细菌的培养及鉴定思路

关于细菌的培养及鉴定思路标本采集原则1.及时采集微生物标本作病原学检查2.在抗菌药物使用前采集标本3.采样时严格执行无菌操作4.标本容器须无菌，但不得有消毒剂5.采样后立即送检6.送检标本应注明来源和检验目的第2页,共107页，2024年2月25日，星期天咳痰方法病人先漱口，清洁口腔，去除表面的菌群病人深咳，收集从下呼吸道咳出的痰液无痰可用3％～5％NaCl5ml雾吸约5min导痰以清晨第二口痰为佳标本采集后放置时间不超过2小时

第3页,共107页，2024年2月25日，星期天清洁中段尿液尽量取早晨第一次尿液嘱患者留取标本的前一天晚上少饮水女性病人收集标本前用肥皂水冲洗外阴，再以灭菌清水冲洗尿道口排出几毫升后，不停止尿流，采集中段尿男性病人翻转包皮，清洗尿道口排出几毫升后，不停止尿流,采集中段尿

采集标本后立即送检！第4页,共107页，2024年2月25日，星期天标本接收原则严格实行核对制度：包括姓名、性别、年龄、门诊号/住院号、病床号、标本类型、容器、标识、检验目的等。所有拒收或退回标本均应在登记本上登

记，登记内容包括：病人姓名、病区、床号

送检医师、送检项目、拒收(退回)原因、拒收时间、经手人等第5页,共107页，2024年2月25日，星期天痰标本涂片染色低倍镜下分类分级白细胞（个）上皮细胞（个）A>25<10B>25<25C<10>25A、B两种情况的痰适合做培养，C不合格，应重新留标本第6页,共107页，2024年2月25日，星期天哥伦比亚血平板—营养要求高的细菌巧克力平板—含V、X因子，主要培养嗜血杆菌、脑膜炎球菌和淋球菌用中国蓝/麦康凯平板—G-杆菌用SS平板—沙门氏菌和志贺氏菌用M-H平板—细菌药敏用TCBS平板—弧菌科细菌用沙包氏平板—真菌培养用真菌显色平板—真菌培养用罗氏培养基—分枝杆菌用常用的培养基种类和用途第7页,共107页，2024年2月25日，星期天接种工具接种针和接种环：由三部分组成，即环（针）、金属柄和绝缘柄接种针：用于穿刺接种细菌接种环：用于固体、液体培养基的细菌接种第8页,共107页，2024年2月25日，星期天器具：接种环（上）和接种针（下）

柄约22cm2—5cm绝缘柄约7.5cm金属柄约14.5cm5—8cm安装环(针)的螺口(约8mm)第9页,共107页，2024年2月25日，星期天操作原则：无菌操作（烧灼灭菌）Asepticarea10-20cm外焰焰芯内焰第10页,共107页，2024年2月25日，星期天细菌接种的基本程序灭菌接种环沾取标本接种灭菌接种环杀灭接种环沾染的细菌，以免污染标本杀灭接种环沾染的细菌，以免污染环境第11页,共107页，2024年2月25日，星期天细菌接种法平板划线接种法：

★目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌。

★方法：★分区划线法：适用于含菌量较多的标本★连续划线法：适用于含菌量较少的标本液体培养基接种法穿刺接种法:用于观察细菌动力斜面接种法倾注培养法:用于细菌计数第12页,共107页，2024年2月25日，星期天分区划线法(3区)第一区划线灭菌接种环第二区划线灭菌接种环第三区划线灭菌接种环第13页,共107页，2024年2月25日，星期天连续划线法第14页,共107页，2024年2月25日，星期天第15页,共107页，2024年2月25日，星期天细菌培养法一般培养（需氧培养）：★培养温度：35℃（采用恒温培养箱）★培养时间：18～24h二氧化碳培养法：烛缸法、二氧化碳培养箱厌氧培养法：厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧罐、疱肉培养法、硫乙醇酸盐法等第16页,共107页，2024年2月25日，星期天细菌在固体培养基中的生长现象菌落★定义：指单个细菌在平板培养基上生长繁殖，形成单一肉眼可见的细菌集团。★菌落特征：大小、形状、边缘、颜色、表面、透明度、湿润度、黏度、溶血性★菌落类型：光滑型（S）、粗糙型（R）、黏液型（M）菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物。第17页,共107页，2024年2月25日，星期天菌落第18页,共107页，2024年2月25日，星期天菌落与菌苔第19页,共107页，2024年2月25日，星期天菌落的三个类型：

1.光滑型菌落（SmoothtypeColony）：又称S型2.粗糙型菌落（RoughtypeColony）：又称R型3.粘液型菌落（MucoidtypeColony）又称M型第20页,共107页，2024年2月25日，星期天2024/4/321S型菌落第21页,共107页，2024年2月25日，星期天R型菌落第22页,共107页，2024年2月25日，星期天M型菌落第23页,共107页，2024年2月25日，星期天细菌在液体培养基中的生长现象混浊沉淀：多见于链状排列的细菌菌膜：多见于厌氧菌第24页,共107页，2024年2月25日，星期天细菌在液体培养基中的生长现象：第25页,共107页，2024年2月25日，星期天细菌在半固体培养基中的生长现象有鞭毛细菌：在培养基中沿穿刺线并向外扩散生长，穿刺线边缘模糊。无鞭毛细菌：只沿穿刺线生长，穿刺线边缘清晰。第26页,共107页，2024年2月25日，星期天细菌在半固体培养基中的生长现象有动力现象无动力现象第27页,共107页，2024年2月25日，星期天斜面接种法第28页,共107页，2024年2月25日，星期天接种斜面后菌落生长示意图（菌苔）第29页,共107页，2024年2月25日，星期天革兰染色原理：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经复红等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。第30页,共107页，2024年2月25日，星期天

革兰染色步骤

涂片包括涂片、干燥、固定三步。涂片干燥固定第31页,共107页，2024年2月25日，星期天固定的目的：使细菌的细胞凝固，使菌体与玻片粘得更牢固；可改变菌体对染料的通透性；加热固定可杀死细菌，比较安全。第32页,共107页，2024年2月25日，星期天

结晶紫1’碘液1’

95%乙醇

30”复红1’

冲洗滤纸干燥

油镜观察冲洗冲洗冲洗革兰染色程序初染媒染脱色复染第33页,共107页，2024年2月25日，星期天紫色（G＋）革兰氏染色步骤示意图革兰染色甲菌乙菌初染结晶紫媒染碘液脱色乙醇复染稀释复红紫色（G＋）红色（G-）革兰染色步骤示意图第34页,共107页，2024年2月25日，星期天【结果】细菌被染成紫色者，称为革兰阳性菌；而细菌染成红色者，称为革兰阴性菌；阳性菌——紫色（G+b)

阴性菌——红色（G-b)第35页,共107页，2024年2月25日，星期天G+

球菌第36页,共107页，2024年2月25日，星期天显微镜下的杆菌G-杆菌Figure2-GramstainofGram-E.colicells第37页,共107页，2024年2月25日，星期天革兰染色注意事项标本涂片不宜太厚固定不宜过热脱色不宜过度选用培养18--24小时菌龄的细菌为宜第38页,共107页，2024年2月25日，星期天抗酸染色原理：分枝杆菌细胞壁含脂质较多,其中主要成分为分枝菌酸,此物具有抗酸性,染色时与石炭酸复红结合牢固,能抵抗酸性乙醇的脱色作用,因此抗酸菌能保持复红的颜色,达到染色目的。第39页,共107页，2024年2月25日，星期天

抗酸染色步骤

1、涂片包括涂片、干燥、固定三步。涂片干燥固定第40页,共107页，2024年2月25日，星期天抗酸染色步骤2、染色包括初染、脱色、复染三步。

石炭酸复红维持3-5’3%盐酸酒精30’’

~1’美蓝复染1’

冲洗干燥

油镜观察冲洗冲洗初染脱色复染第41页,共107页，2024年2月25日，星期天抗酸染色结果抗酸菌呈红色，常堆积成团，排列无序，偶呈分枝状生长。背景及非抗酸性细菌呈兰色。第42页,共107页，2024年2月25日，星期天抗酸染色注意事项为防止交叉感染，标本先高压灭菌后再涂片染色染色充分脱色时间宁长勿短在涂抹痰标本时严禁对载玻片进行加热第43页,共107页，2024年2月25日，星期天临床标本培养基选择血：血培养瓶中断尿：血平板、mac平板脑脊液：血培养瓶、血平板、巧克力平板穿刺液：血培养瓶、血平板、巧克力平板、mac平板胆汁：血平板、巧克力平板、mac平板大便:.麦康凯、SS、血平板第44页,共107页，2024年2月25日，星期天临床标本培养基选择生殖道标本根据临床医生所写的检验项目接种相应的平板及操作：

淋球菌培养接种淋球菌平板;念珠菌培养接种沙保罗培养基；支原体培养则按《支原体培养的操作规程》操作；作普通培养则接种血平板和巧克力平板

第45页,共107页，2024年2月25日，星期天观察细菌在平板上的生长现象血平板：大小、形状、边缘、颜色、表面、透明度、湿润度、黏度、溶血性mac平板：大小、形状、颜色、透明度、湿润度、黏度巧克力平板：大小、形状、颜色、透明度、湿润度、黏度第46页,共107页，2024年2月25日，星期天无菌部位标本第47页,共107页，2024年2月25日，星期天2024/4/348

革兰阴性菌葡萄球菌第48页,共107页，2024年2月25日，星期天痰培养真菌、链球菌菌落形态第49页,共107页，2024年2月25日，星期天细菌的初步分类细菌的分离与纯化：自血平板挑出待检菌株的单菌落进行初步的鉴定。如果混有杂菌，应该重新转种分纯。染色与镜检：首先通过革兰氏染色确定基本的分类：（1）G+球菌（2）G-球菌（3）G-杆菌（4）G+杆菌。此外，如果镜下发现革兰氏染色阳性、椭圆形、有芽孢状的较大菌体，可能是真菌。第50页,共107页，2024年2月25日，星期天细菌的初步分类触酶试验

主要用于G+球菌的分类。葡萄球菌属（微球菌属）：触酶（+），链球菌属及肠球菌：触酶（-）氧化发酵试验（O/F试验）根据细菌在无氧环境中能否利用碳源将细菌分为非发酵菌(O/F阴性)和发酵菌（O/F阳性）氧化酶试验：肠杆菌的氧化酶（-），非发酵菌多数氧化酶（+），但嗜麦芽窄食单胞菌和不动杆菌的氧化酶（-），弧菌科氧化酶（+）第51页,共107页，2024年2月25日，星期天G-杆菌的鉴定途径G染色G-b

O/F试验和氧化酶（ox)试验

OF（-）

OF（+）

OF（+）ox（+）

ox（-）

ox（+）

非发酵型细菌肠杆菌科

弧菌科第52页,共107页，2024年2月25日，星期天G-杆菌ATB细菌鉴定系统肠杆菌科、弧菌科ID32E肠杆菌科鉴定条ATBG-5肠杆菌科药敏试条非发酵菌ID32GN非发酵菌鉴定条ATBPSE5非发酵菌药敏试条

第53页,共107页，2024年2月25日，星期天2024/4/354革兰阴性鉴定及药敏试条第54页,共107页，2024年2月25日，星期天血清学试验肠道致病菌生化特征符合的前提下必须有血清学的试验作最后确认：

1.志贺氏菌多价和单价凝集血清2.沙门氏菌多价和单价凝集血清3.致病性大肠杆菌多价和单价凝结血清4.

耶尔森氏菌凝集血清第55页,共107页，2024年2月25日，星期天G+球菌的鉴定途径1.首先根据菌落特点和革兰氏染色判断是否为G+球菌。2.根据触酶结果判断为葡萄球菌（微球菌属）or链球菌（肠球菌）3.葡萄球菌属：触酶（+）链球菌属及肠球菌：触酶（-）第56页,共107页，2024年2月25日，星期天G+球菌的鉴定途径葡萄球菌属：触酶（+）、氧化酶（-）、

O-F试验：发酵型

微球菌属：触酶（+）、氧化酶（+）、

O-F试验：氧化型第57页,共107页，2024年2月25日，星期天金黄色葡萄球菌最重要的致病葡萄球菌血平板上菌落有明显β溶血环，颜色呈金黄色、灰白色或柠檬色分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和甘露醇血浆凝固酶和DNA酶阳性

第58页,共107页，2024年2月25日，星期天第59页,共107页，2024年2月25日，星期天2024/4/360葡萄球菌第60页,共107页，2024年2月25日，星期天ATB细菌鉴定系统葡萄球菌：ID32STAPH葡萄球菌鉴定条ATBSTAPH5葡萄球菌药敏试条第61页,共107页，2024年2月25日，星期天2024/4/362葡萄球菌鉴定、药敏试条第62页,共107页，2024年2月25日，星期天链球菌鉴定途径链球菌属:触酶（-）、七叶苷（-）、6.5%NaCl（-）

肠球菌：触酶（-）、七叶苷（+）、6.5%NaCl（+）第63页,共107页，2024年2月25日，星期天链球菌鉴定途径根据G染色和触酶结果确定为链球菌，然后再根据细菌的溶血情况和菌落特点判断鉴定途径第64页,共107页，2024年2月25日，星期天链球菌鉴定途径根据G染色和触酶结果确定为链球菌，然后再根据细菌的溶血情况和菌落特点判断鉴定途径第65页,共107页，2024年2月25日，星期天第66页,共107页，2024年2月25日，星期天链球菌鉴定途径

α溶血

Optochin

R

S

+胆汁七叶苷--

肺炎链球菌

D群链球菌

草绿色链球菌

第67页,共107页，2024年2月25日，星期天第68页,共107页，2024年2月25日，星期天链球菌鉴定途径

β溶血

杆菌肽CAMP胆汁七叶苷

S

+

+

A群链球菌

B群链球菌

D群链球菌6.5%NaCl--+

非肠球菌肠球菌第69页,共107页，2024年2月25日，星期天第70页,共107页，2024年2月25日，星期天链球菌鉴定途径

γ溶血

胆汁七叶苷

+--D群链球菌草绿色链球菌-6.5%NaCl+非肠球菌肠球菌

第71页,共107页，2024年2月25日，星期天ATB细菌鉴定系统链球菌：RapidID32STREP链球菌鉴定条ATBSTREP5链球菌药敏试条

肠球菌：RapidID32STREP链球菌鉴定条ATBEnteroc5肠球菌药敏试条第72页,共107页，2024年2月25日，星期天G-杆菌的鉴定途径G染色G-b

O/F试验和氧化酶（ox)试验

OF（-）

OF（+）

OF（+）ox（+）

ox（-）

ox（+）

非发酵型细菌肠杆菌科

弧菌科第73页,共107页，2024年2月25日，星期天ATB细菌鉴定系统肠杆菌科、弧菌科ID32E肠杆菌科鉴定条ATBG-5肠杆菌科药敏试条非发酵菌ID32GN非发酵菌鉴定条ATBPSE5非发酵菌药敏试条

第74页,共107页，2024年2月25日，星期天真菌的鉴定途径沙包氏培养基选择性培养科玛嘉念珠菌显色培养基革兰氏染色：阳性、椭圆形、有芽孢状的较大菌体通过血清芽管形成试验鉴定出白念珠菌CSF标本通过墨汁染色可以初步判断为新型隐球菌第75页,共107页，2024年2月25日，星期天第76页,共107页，2024年2月25日，星期天ATB细菌鉴定系统酵母样真菌：ID32C酵母菌鉴定条ATBFUNGUS3酵母菌药敏条第77页,共107页，2024年2月25日，星期天嗜血杆菌的鉴定途径只能在营养条件高的巧克力平板上生长，菌落为中等大小、圆形、灰白色、透明革兰染色：G-小杆菌卫星实验就可以帮助初步鉴定第78页,共107页，2024年2月25日，星期天2024/4/379嗜血杆菌第79页,共107页，2024年2月25日，星期天第80页,共107页，2024年2月25日，星期天ATB细菌鉴定系统嗜血杆菌：

APINH嗜血杆菌鉴定条

ATBHAEMO嗜血杆菌药敏试条第81页,共107页，2024年2月25日，星期天奈瑟氏菌属鉴定在血平板和巧克力平板上生长，mac上不生长血平板形成灰色、湿润、透明或半透明、不溶血的菌落巧克力平板上形成圆形、灰蓝色的似露滴状菌落革兰染色：G-双球菌，呈肾形或咖啡豆形，凹面相对氧化酶和触酶都均为阳性第82页,共107页，2024年2月25日，星期天

奈瑟氏菌属有11个种，临床就淋病奈

菌和脑膜炎奈瑟菌最为重要第83页,共107页，2024年2月25日，星期天奈瑟氏菌属鉴定流程

菌落观察：灰色、湿润、透明或半透明、不溶血

涂片染色：G-双球菌，呈肾形或咖啡豆状

氧化酶试验+触酶+

+麦芽糖--

脑膜炎奈瑟菌

淋病奈瑟菌第84页,共107页，2024年2月25日，星期天莫拉菌有4个种，仅卡他莫拉菌对人类有致病性莫拉菌属第85页,共107页，2024年2月25日，星期天卡他莫拉菌鉴定在血平板和巧克力平板上生长，mac上不生长血平板形成灰白色或红棕色、不溶血的菌落，培养48小时，菌落表面干燥，接种环可推移整个菌落且不粘环革兰染色：G-双球菌，呈咖啡豆形氧化酶和触酶都为阳性第86页,共107页，2024年2月25日，星期天卡他莫拉菌鉴定流程

菌落观察：灰白色或红棕色、光滑、不溶血、干燥

涂片染色：G-双球菌，呈肾形或咖啡豆状氧化酶试验+触酶++DNAM酶

--

卡他莫拉菌其他奈瑟氏菌

第87页,共107页，2024年2月25日，星期天奈瑟氏菌属与相似菌鉴别的关键性试验

葡萄糖麦芽糖蔗糖硝酸盐还原DNA酶淋病奈瑟菌+--

------脑膜炎奈瑟菌++------

卡他莫拉菌

------++

第88页,共107页，2024年2月25日，星期天ATB细菌鉴定系统

奈瑟氏菌属和莫拉菌鉴定和药敏试条同

嗜血杆菌

第89页,共107页，2024年2月25日，星期天需氧G+b的鉴定途径根据抗酸染色（A）将其分为：

A+：分枝杆菌、奴卡氏菌

A-：李斯特菌属，芽胞杆菌属、棒状杆菌属、乳酸杆菌属、丹毒丝菌属等第90页,共107页，2024年2月25日，星期天需氧G+b的鉴定途径属间鉴定，通过触酶和动力试验加以初步确定

触酶（+）

+

动力

-

李斯特菌属

棒状杆菌属

芽胞杆菌属

第91页,共107页，20