小鼠实验胚胎技术-课件

小鼠实验胚胎技术与应用

眼科学实验动物中心小鼠实验胚胎技术1小鼠实验胚胎技术与应用眼科学实验动物中心小鼠实验胚胎技术1提纲一、小鼠实验胚胎技术

1、母鼠超数排卵

2、胚胎收集

3、胚胎体外培养

4、假母制备

5、胚胎体内移植

二、应用:转基因动物模型的制作

1、定义

2、制作方法和原理

小鼠实验胚胎技术2提纲一、小鼠实验胚胎技术小鼠实验胚胎技术2精品资料3精品资料3你怎么称呼老师？如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你是否会认为老师的教学方法需要改进？你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？教师的教鞭“不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我笨，没有学问无颜见爹娘……”“太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”44小鼠实验胚胎技术小鼠实验胚胎技术5小鼠实验胚胎技术小鼠实验胚胎技术5超数排卵：给予发情间期的母鼠一定量的促进卵泡成熟和卵子排放的激素，母鼠可以同时段排放比正常排卵数多一倍以上的成熟卵子。

PMSG（孕马血清促性腺激素）：促进卵泡成熟。

HCG（人绒毛膜促性腺激素）：促进卵泡成熟和卵子排放。小鼠实验胚胎技术6超数排卵：给予发情间期的母鼠一定量的促进卵泡成熟和卵子排放的假母：性成熟的母鼠在与结扎公鼠交配后，子宫内膜会处于增殖和接受胚胎着床的生理状态。一旦有胚胎进入子宫腔内，胚胎便可以在其子宫内着床发育成个体。鼠类动物、兔子有此特性，其他动物需借助激素。小鼠实验胚胎技术7假母：性成熟的母鼠在与结扎公鼠交配后，子宫内膜会处于增殖和接小鼠实验胚胎技术8小鼠实验胚胎技术8小鼠实验胚胎技术的应用

----转基因动物模型的制作小鼠实验胚胎技术9小鼠实验胚胎技术的应用

----转基因动物模型的制作转基因动物:

转基因动物(transgenicanimal)是指以实验手段导入的外源基因在其基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。小鼠实验胚胎技术10转基因动物:转基因动物(transgeni转基因动物模型:

转基因动物模型(transgenicanimalmodel)是指利用转基因动物制作手段导入的人类疾病基因在其基因组稳定整合、遗传并表达产生类似于人类疾病的一类动物。小鼠实验胚胎技术11转基因动物模型:转基因动物模型(trans小鼠实验胚胎技术12小鼠实验胚胎技术12小鼠实验胚胎技术13小鼠实验胚胎技术13小鼠实验胚胎技术14小鼠实验胚胎技术14小鼠实验胚胎技术15小鼠实验胚胎技术15小鼠实验胚胎技术16小鼠实验胚胎技术16小鼠实验胚胎技术17小鼠实验胚胎技术17小鼠实验胚胎技术18小鼠实验胚胎技术18

LIM1基因敲除无脑小鼠小鼠实验胚胎技术19LIM1基因敲除无脑小鼠小鼠实验胚胎技术19

震颤小鼠与多发性硬化小鼠实验胚胎技术20震颤小鼠与多发性硬化小鼠实验胚胎技术20震颤小鼠与多发性硬化小鼠实验胚胎技术21震颤小鼠与多发性硬化小鼠实验胚胎技术21转基因动物、基因敲除动物制作方法和原理构建的载体通过同源重组方式整合入动物个体基因组的特定位点克隆目的基因精子载体法构建载体雄原核注射法

胚胎感染法曲细精管注射法胚胎干细胞法核移植法目的基因随机整合入动物个体基因组目的基因转录、翻译产生蛋白和表现功能转基因动物靶基因不能转录、翻译，不能产生蛋白和表现功能靶基因被删除或灭活基因敲除动物小鼠实验胚胎技术22转基因动物、基因敲除动物制作方法和原理构建的载体通过同源重组精体载体法：

将外源基因附着在精子上，通过体外受精或单精子注射法将外源基因导入受精卵；在受精卵DNA复制过程中外源基因随机整合入受体基因组。小鼠实验胚胎技术23精体载体法：将外源基因附着在精子上，通过体精体载体法流程图

目的基因克隆、纯化

与精子共孵育

卵子体外受精或单精子注射受精卵DNA复制，外源基因整合双细胞期胚胎假母体内移植

产生个体外源基因阳性个体筛选阳性个体的培育和建群小鼠实验胚胎技术24精体载体法流程图

精子载体法

小鼠实验胚胎技术25精子载体法

小鼠实验胚胎技术25精体载体法特点：优点：简单

不需要构建特殊的载体单纯的外源基因DNA片段

缺点：成功率低

小鼠实验胚胎技术26精体载体法特点：优点：简单小鼠实验胚胎技术26雄原核注射法：

通过显微注射的方法将外源基因注射入受精卵的雄原核区；在受精卵DNA复制过程中外源基因随机整合入受体基因组。小鼠实验胚胎技术27雄原核注射法：通过显微注射的方法将外源基因雄原核注射法流程图

目的基因克隆、纯化

显微注射至受精卵雄原核

受精卵DNA复制，外源基因整合双细胞期胚胎假母体内移植

产生个体外源基因阳性个体筛选阳性个体的培育和建群小鼠实验胚胎技术28雄原核注射法流程图小鼠实验胚胎技术29小鼠实验胚胎技术29小鼠实验胚胎技术30小鼠实验胚胎技术30雄原核注射法特点：优点：相对简单、成功率高

不需要构建特殊的载体单纯的外源基因DNA片段

成功率可达5%～25%缺点：需要昂贵的仪器设备

显微注射仪、拉针仪、煅针仪小鼠实验胚胎技术31雄原核注射法特点：优点：相对简单、成功率高小鼠实验胚胎技术3胚胎感染法：

将外源基因连接上逆转录病毒载体，再让逆转录病毒载体感染着床前后的胚胎，外源基因随机整合入受体基因组。小鼠实验胚胎技术32胚胎感染法：将外源基因连接上逆转录病毒载体胚胎感染法流程图

目的基因克隆、纯化、逆转录病毒载体的构建

体外感染着床前胚胎体内感染着床前、后胚胎（共孵育或显微注射）（输卵管或子宫内注射）

胚胎移植产生个体筛选阳性嵌合体

嵌合体之间交配外源基因阳性纯合个体产生、筛选外源基因阳性个体的培育和建群小鼠实验胚胎技术33胚胎感染法流程图目的基因克隆、小鼠实验胚胎技术34小鼠实验胚胎技术34胚胎感染法特点：优点：感染率高

缺点：相对复杂存在生物安全性问题形成嵌合体后期工作量大

小鼠实验胚胎技术35胚胎感染法特点：优点：感染率高小鼠实验胚胎技术35曲细精管注射法：

将外源基因注射入雄性动物的曲细精管内，在精原细胞分裂过程中外源基因随机整合入受体基因组，再通过精卵受精产生带有外源基因的个体。小鼠实验胚胎技术36曲细精管注射法：将外源基因注射入雄性动物的曲细精管注射法流程图

目的基因克隆、纯化

逆转录病毒载体的构建

雄性个体曲细精管注射外源基因随机整合入雄性生殖细胞雌、雄动物自然交配

产生个体外源基因阳性个体筛选

阳性个体的培育和建群小鼠实验胚胎技术37曲细精管注射法流程图小鼠实验胚胎技术38小鼠实验胚胎技术38曲细精管注射法特点：优点：相对简单不需要昂贵仪器缺点：成功率较低

小鼠实验胚胎技术39曲细精管注射法特点：优点：相对简单小鼠实验胚胎技术39胚胎干细胞法：

将外源基因转染胚胎干细胞，再通过嵌合体技术或核移植技术产生带有外源基因的胚胎干细胞来源的转基因个体。小鼠实验胚胎技术40胚胎干细胞法：将外源基因转染胚胎干细胞，再胚胎干细胞法流程图

目的基因克隆、纯化

转染胚胎干细胞及阳性细胞筛选

受体囊胚腔注射核移植至受体卵母细胞胚胎移植胚胎移植产生嵌合体产生阳性克隆个体

嵌合体之间交配外源基因纯合阳性个体筛选

阳性个体的培育和建群小鼠实验胚胎技术41胚胎干细胞法流程图小鼠实验胚胎技术42小鼠实验胚胎技术42嵌合体动物：

组成一个动物个体的细胞来源于两个或两个以上的动物品系或品种。小鼠实验胚胎技术43嵌合体动物：小鼠实验胚胎技术43嵌合体动物制作方法：一、聚合法1.胚胎-胚胎：两个8细胞期~桑椹期的胚胎去透明带后，在植物血凝素的作用下，互相粘附融合在一起重新形成一个胚胎，移植后发育成一个个体。小鼠实验胚胎技术44嵌合体动物制作方法：一、聚合法小鼠实验胚胎技术442.胚胎-胚胎干细胞：一个8细胞期~桑椹期的胚胎和多个胚胎干细胞在植物血凝素的作用下，形成一个融合胚胎，移植后发育成一个个体。聚合法的特点：不需要昂贵仪器，但成功率低。小鼠实验胚胎技术452.胚胎-胚胎干细胞：一个8细胞期~桑椹期的胚胎和多个胚胎二、显微注射法1.成体细胞：将成体细胞显微注射入囊胚期胚胎囊腔，移植后发育成一个个体。2.胚胎干细胞：将胚胎干细胞显微注射入囊胚期胚胎囊腔，移植后发育成一个个体。显微注射法的特点：需昂贵仪器，但成功率高。小鼠实验胚胎技术46二、显微注射法小鼠实验胚胎技术46*成体细胞不具有体外无限增殖能力，不适于进行遗传修饰；而胚胎干细胞刚好相反，所以普遍用于转基因动物特别是基因敲除动物的制作。小鼠实验胚胎技术47*成体细胞不具有体外无限增殖能力，不适于进行遗传修饰；而胚小鼠实验胚胎技术48小鼠实验胚胎技术48小鼠实验胚胎技术49小鼠实验胚胎技术49胚胎干细胞法特点：优点：可以进行基因定点的敲除和导入缺点：环节多、过程复杂需要昂贵仪器小鼠实验胚胎技术50胚胎干细胞法特点：优点：可以进行基因定点的敲除和导入小鼠实验核移植法：

将外源基因转染胚胎干细胞或体细胞，带有外源基因的细胞作为核供体，通过核移植技术产生带有外源基因的转基因个体。小鼠实验胚胎技术51核移植法：将外源基因转染胚胎干细胞或体细胞核移植法