分子生物学常用技术-课件

分子生物学常用技术

第十七章分子生物学常用技术第十七章分子生物学常用技术凝胶电泳分子杂交聚合酶链反应(PCR)技术DNA的物理图谱DNA序列测定基因芯片2PPT课件分子生物学常用技术凝胶电泳2PPT课件2精品资料精品资料3你怎么称呼老师？如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你是否会认为老师的教学方法需要改进？你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？教师的教鞭“不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我笨，没有学问无颜见爹娘……”“太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”分子生物学常用技术--ppt课件4第一节凝胶电泳

(gelelectrophoresis)电泳概念基本原理Qμ＝

6πrη

μ:迁移率

Q:电荷量r:粒子半径（分子量）η:介质粘度

5PPT课件第一节凝胶电泳

(gelelectrophoresis)5电泳的用途分离鉴定纯度测定分子量凝胶电泳的种类琼脂糖凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳

6PPT课件电泳的用途6PPT课件6一、琼脂糖凝胶电泳

(agarosegelelectrophoresis)

分离核酸原理操作要点应用范围7PPT课件一、琼脂糖凝胶电泳

(agarosegelelectro7（一）分离核酸原理

电荷效应

分子筛效应

分子构象8PPT课件（一）分离核酸原理电荷效应8PPT课件81.电荷效应核酸是两性电解质

pH=3.5,正电荷pH=8.0~8.3,负电荷，正极9PPT课件1.电荷效应核酸是两性电解质9PPT课件910PPT课件10PPT课件102.分子筛效应小分子移动快，大分子移动慢11PPT课件2.分子筛效应小分子移动快，大分子移动慢11PPT课件113.分子构象闭环超螺旋>线状DNA>开环DNA+-12PPT课件3.分子构象闭环超螺旋>线状DNA>开环DNA+-12P12（二）操作要点支持物凝胶浓度的选择

DNA分子量标准电泳缓冲液样品制备电泳条件

DNA电泳染色

DNA片段的回收13PPT课件（二）操作要点支持物13PPT课件131.支持物14PPT课件1.支持物14PPT课件14商品化的琼脂糖15PPT课件商品化的琼脂糖15PPT课件15琼脂糖种类普通低熔点高纯高筛分熔点80~90℃<70℃80~90℃80~90℃机械强度中差高高分辨率中差中高16PPT课件琼脂糖种类普通低熔点高纯高筛分熔点80~90℃<70℃80~162.凝胶浓度的选择17PPT课件2.凝胶浓度的选择17PPT课件17凝胶的制备18PPT课件凝胶的制备18PPT课件1819PPT课件19PPT课件1920PPT课件20PPT课件203.DNAmarker21PPT课件3.DNAmarker21PPT课件21DNAmarker22PPT课件DNAmarker22PPT课件22DNA长度标准曲线23PPT课件DNA长度标准曲线23PPT课件234.电泳缓冲液

Tris-乙酸(TAE)pH8.0

Tris-硼酸(TBE)pH8.0

Tris-磷酸(TPE)pH8.024PPT课件4.电泳缓冲液Tris-乙酸(TAE)pH8.024245.样品制备上样缓冲液50%甘油/蔗糖0.5%溴酚蓝/二甲苯青

25PPT课件5.样品制备上样缓冲液25PPT课件25点样26PPT课件点样26PPT课件266.电泳条件潜水电泳恒压电泳低压:1~2V/cm

中压:8~10V/cm

高压电泳：>几十V/cm温度：15~25℃27PPT课件6.电泳条件潜水电泳27PPT课件27潜水电泳28PPT课件潜水电泳28PPT课件287.电泳染色溴乙锭(ethidiumbromide,EB)

结构及染色原理染色方法加入凝胶液中

电泳结束后染色29PPT课件7.电泳染色溴乙锭(ethidiumbromide,E29EB染色原理30PPT课件EB染色原理30PPT课件3031PPT课件31PPT课件31紫外灯下显色32PPT课件紫外灯下显色32PPT课件328.DNA片段的回收低熔点琼脂糖法

透析袋电洗脱法(>5kb)DEAE-纤维素膜法(0.5~5kb)33PPT课件8.DNA片段的回收低熔点琼脂糖法33PPT课件33（三）应用范围

DNA的分离、纯化和鉴定限制性酶切图谱分析重组体的分离、鉴定杂交分析

PCR产物的分离鉴定34PPT课件（三）应用范围DNA的分离、纯化和鉴定34PPT课件34琼脂糖凝胶电泳35PPT课件琼脂糖凝胶电泳35PPT课件35二、聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE)

分离原理操作要点优点应用范围36PPT课件二、聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegel36（一）分离原理电荷效应分子筛效应37PPT课件（一）分离原理电荷效应37PPT课件37PAGE支持物单体－丙烯酰胺(Acr)

交联剂－甲叉双丙烯酰胺(Bis)

催化剂－过硫酸胺(AP)

加速剂－N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)38PPT课件PAGE支持物单体－丙烯酰胺(Acr)38PPT课件38聚丙烯酰胺凝胶39PPT课件聚丙烯酰胺凝胶39PPT课件39（二）操作要点凝胶的分类凝胶浓度的选择凝胶液的配制凝胶中DNA的检测DNA片段的回收40PPT课件（二）操作要点凝胶的分类40PPT课件401.凝胶的分类非变性凝胶：dsDNA变性凝胶:ssDNA尿素甲酰胺SDS41PPT课件1.凝胶的分类非变性凝胶：dsDNA41PPT课件412.凝胶浓度的选择42PPT课件2.凝胶浓度的选择42PPT课件4243PPT课件43PPT课件433.凝胶液的配制

试剂(ml)制备浓度(%)3.55.08.0122030%Acr11.616.626.640.066.6ddH2O67.762.752.739.312.75XTBE20.020.020.020.020.010%AP0.70.70.70.70.7TEMED35ul/100ml44PPT课件3.凝胶液的配制试剂制备浓度(%)3.55.044PAGE装置45PPT课件PAGE装置45PPT课件4546PPT课件46PPT课件4647PPT课件47PPT课件4748PPT课件48PPT课件48电泳49PPT课件电泳49PPT课件494.凝胶中DNA的检测溴乙锭染色法

银盐染色法甲醛还原放射自显影法Ag+－DNA

Ag（黑褐色）

50PPT课件4.凝胶中DNA的检测溴乙锭染色法Ag+－DNAAg（505.DNA片段的回收压碎浸泡法<1kb

纯度高，回收率低51PPT课件5.DNA片段的回收压碎浸泡法51PPT课件51（三）PAGE优点机械强度好、化学稳定性高分辨率高载样量大回收的DNA纯度高

52PPT课件（三）PAGE优点机械强度好、化学稳定性高52PPT课件52（四）PAGE应用范围分离、纯化和鉴定RNA和小分子DNA

DNA序列分析

PCR产物鉴定蛋白质的检测和分析53PPT课件（四）PAGE应用范围分离、纯化和鉴定RNA和小分子DNA53第二节分子杂交

分子杂交的基本原理固相支持物探针几种常用杂交技术54PPT课件第二节分子杂交

分子杂交的基本原理54PPT课件54一、分子杂交的基本原理核酸的变性和复性55PPT课件一、分子杂交的基本原理核酸的变性和复性55PPT课件55分子杂交DNA-DNA56PPT课件分DNA-DNA56PPT课件56DNA-RNA57PPT课件DNA-RNA57PPT课件57杂交条件靶分子探针杂交袋杂交炉58PPT课件杂交条件靶分子58PPT课件58杂交种类被检核酸种类和方法原位杂交斑点杂交Southern杂交Northern杂交Western杂交反应介质液相杂交固相杂交(

)59PPT课件杂交种类被检核酸种类和方法59PPT课件59二、固相支持物固相支持物的特性结合能力强不影响杂交反应结合牢固非特异性吸附少机械性能良好

60PPT课件二、固相支持物固相支持物的特性60PPT课件60固相支持物的种类硝酸纤维素滤膜(nitrocellulosefiltermembrane)

尼龙膜(nylonmembrane)61PPT课件固相支持物的种类硝酸纤维素滤膜61PPT课件611.硝酸纤维素滤膜

特点吸附ssDNA和RNA杂交信号本底低不足不适于重复杂交滤膜较脆不适于电转移印迹法对DNA小片段(<200bp)结合能力弱62PPT课件1.硝酸纤维素滤膜特点62PPT课件622.尼龙膜特点结合能力强

可反复杂交

韧性强

适于电转移印迹法对DNA小片段(10bp)结合能力强不足杂交信号本底较高

63PPT课件2.尼龙膜特点63PPT课件63分子生物学考试时间：2005.1.11(晚7:00-9:00)地点9教讲演厅(150人)9-2-1(50人)9-2-2(50人)9-3-1(50人)答疑：1.10(9:00-11:30;3:00-5:30)地点：逸夫楼3楼生化实验室64PPT课件分子生物学考试时间：2005.1.11(晚7:00-9:064三、探针(probe)探针的概念探针的类型

标记物的种类标记方法65PPT课件三、探针(probe)探针的概念65PPT课件651.探针的概念特异结合和检测靶分子的活性物质抗原－抗体配体－受体同源DNA/RNA66PPT课件1.探针的概念特异结合和检测靶分子的活性物质66PPT课件662.探针的类型基因组DNA探针

cDNA探针

RNA探针寡核苷酸探针蛋白质或多肽探针67PPT课件2.探针的类型基因组DNA探针67PPT课件673.标记物的种类放射性同位素(32P,3H,35S,125I,14C)

非放射性标记物生物素地高辛荧光素酶

68PPT课件3.标记物的种类放射性同位素(32P,3H,35S,684.核酸探针的放射性标记方法

DNA缺口平移标记法随机引物标记法

DNA的5’末端标记

69PPT课件4.核酸探针的放射性标记方法

DNA缺口平移标记法6969缺口翻译特点均一标记制备dsDNA探针70PPT课件缺口翻译特点70PPT课件70随机引物标记法(randompriming)

随机引物6nt含有各种可能的排列顺序特点放射比活性>缺口翻译操作简便DNA/cDNA探针71PPT课件随机引物标记法(randompriming)随机引物717172PPT课件72PPT课件72DNA的5’末端标记(5’endlabeling)

碱性磷酸酶＋T4多核苷酸激酶标记原理制备寡核苷酸探针制备短的DNA/RNA探针

73PPT课件DNA的5’末端标记(5’endlabeling)

碱性73DNA的5’末端标记74PPT课件DNA的5’末端标记74PPT课件74四、Southern杂交Southernblotting/DNAblotting1975年，EdwenSouthern等印迹(blotting):转移

blot:aspotormark,esp.ofink

blotting75PPT课件四、Southern杂交Southernblotting751.印迹的方法

毛细管转移法

电转移法

真空转移法

76PPT课件1.印迹的方法毛细管转移法76PPT课件76毛细管转移法77PPT课件毛细管转移法77PPT课件77电转移法78PPT课件电转移法78PPT课件78真空转移法79PPT课件真空转移法79PPT课件7980PPT课件80PPT课件802.Southern杂交的步骤81PPT课件2.Southern杂交的步骤81PPT课件813.Southern杂交的应用基因的定性及定量分析基因的酶切图谱分析基因突变分析RFLP82PPT课件3.Southern杂交的应用基因的定性及定量分析82P82五、Northern杂交

RNAblotting

步骤

总RNA/mRNA→变性电泳分离→转移→杂交→放射自显影/化学显色

应用检测组织/细胞中mRNA的大小、量比较不同组织/细胞中基因的表达情况

83PPT课件五、Northern杂交RNAblotting83PP83Northern杂交84PPT课件Northern杂交84PPT课件84六、Western杂交免疫印迹(immunoblotting)

SDS→转移→蛋白－第一抗体→标记的第二抗体(探针)→检测

应用蛋白质的定性定量分析85PPT课件六、Western杂交免疫印迹(immunoblottin8586PPT课件86PPT课件86免疫印迹87PPT课件免疫印迹87PPT课件87

Southern,Northern&Western

待测物质

支持物

探针

转移方式Southern

DNANC单链核酸

毛细管/电/真空

Northern

RNANC/尼龙单链核酸

毛细管/电/真空

Western

蛋白质NC/PVDF

抗体电转移

88PPT课件Southern,Northern&Wes88七、原位杂交

(insituhybridization)定义种类细胞内原位杂交组织切片原位杂交

基本程序细胞/组织固定预杂交杂交冲洗杂交信号检测分析结果

89PPT课件七、原位杂交

(insituhybridization)89组织切片90PPT课件组织切片90PPT课件9091PPT课件91PPT课件91八、斑点杂交

(dothybridization)

92PPT课件八、斑点杂交

(dothybridization)

92P92第三节PCR技术聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)PCR的发展简史PCR的基本原理和步骤PCR的影响因素PCR的种类PCR的应用93PPT课件第三节PCR技术聚合酶链反应93PPT课件93一、PCR的发展简史1971年,Korana提出核酸体外扩增的设想1985年,Mullis等发明了PCR技术1988年,PE-Cetus公司推出了第一台PCR仪

94PPT课件一、PCR的发展简史1971年,Korana提出核酸体外扩94二、PCR的基本原理和步骤基本原理－DNA复制三个步骤变性(denaturation)退火(annealing)延伸(extension)95PPT课件二、PCR的基本原理和步骤基本原理－DNA复制95PPT课95PCR的原理96PPT课件PCR的原理96PPT课件96PCR的扩增产物cycle12345n长片段

246810短片段

002822长＋短

21222324252n97PPT课件PCR的扩增产物cycle12345n长片段24681097标准的PCR反应体系10X扩增缓冲液：10ul模板DNA:0.1~2ug

引物：各0.2~1umol/L4种dNTP:各200umol/LMg2+:1.5mmol/LTaqDNA聚合酶：2.5U总体积：100ul98PPT课件标准的PCR反应体系10X扩增缓冲液：10ul989899PPT课件99PPT课件99三、PCR的影响因素

模板引物

TaqDNA聚合酶

4种dNTP

Mg2+循环条件

100PPT课件三、PCR的影响因素

模板100PPT课件100模板

DNARNAcDNA对模板的纯度要求低101PPT课件模板DNA101PPT课件101引物长度：15～30ntG+C含量：40~60%碱基的随机分布避免引物自身和引物之间的互补引物的3’端引物的5’端引物浓度：0.2~1umol/L102PPT课件引物长度：15～30nt102PPT课件102TaqDNA聚合酶

2.5U/100ul－20℃保存最后加

103PPT课件TaqDNA聚合酶2.5U/100ul103PPT课103底物4种dNTP的浓度相等终浓度：200umol/L104PPT课件底物4种dNTP的浓度相等104PPT课件104Mg2+

浓度:1.5～2.0mmol/L过高:非特异扩增

过低:反应产物减少105PPT课件Mg2+浓度:1.5～2.0mmol/L105PPT课105循环条件变性温度和时间:90~96℃,30~60s退火温度和时间:40~60℃,30~60sTm=4(G+C)+2(A+T)

延伸温度和时间70～75℃(72℃)<1kb,1min;3～4kb,3～4min;10kb,15min循环次数:25～35

106PPT课件循环条件变性温度和时间:90~96℃,30~60s10106四、PCR的种类反转录PCR原位PCR(insituPCR)实时PCR(realtimePCR)重组PCR(recombinantPCR)锚定PCR(anchoredPCR)反向PCR(inversePCR)107PPT课件四、PCR的种类反转录PCR107PPT课件107原位PCR原位杂交＋PCR程序固定细胞/组织样品→PCR前处理→PCR扩增→原位杂交及检测

108PPT课件原位PCR原位杂交＋PCR108PPT课件108实时PCR的原理109PPT课件实时PCR的原理109PPT课件109五、PCR的应用分子生物学研究临床医学110PPT课件五、PCR的应用分子生物学研究110PPT课件110分子生物学研究基因克隆

DNA序列测定基因的体外定点突变

突变分析(PCR-SSCP)

基因定量

111PPT课件分子生物学研究基因克隆111PPT课件111临床医学病原体诊断

遗传病的基因诊断

肿瘤检测

法医学

112PPT课件临床医学病原体诊断112PPT课件112第四节DNA序列测定

Sanger双脱氧链终止法(1977)

Maxam-Gilbert化学裂解法(1977)113PPT课件第四节DNA序列测定Sanger双脱氧链终止法(197113Sanger双脱氧链终止法原理－DNA复制

反应条件模板引物

dNTP（其中一种带放射性标记）

ddNTP

DNA聚合酶114PPT课件Sanger双脱氧链终止法原理－DNA复制114PPT114DNA的复制115PPT课件DNA的复制115PPT课件1152’,3’-双脱氧核苷酸(ddNTP)116PPT课件2’,3’-双脱氧核苷酸(ddNTP)116PPT课件116117PPT课件117PPT课件117118PPT课