生物降解试验中接种物活性定量测量方法

JJF1974—20221生物降解试验中接种物活性定量测量方法1范围本规范适用于环境风险评估中生物降解试验所使用的接种物活性的定量测量。2引用文件本规范引用了下列文件:JJG196常用玻璃量具JJF1135化学分析测量不确定度评定JJF1265生物计量术语及定义JJF1828ATP荧光检测仪校准规范HJ/T153化学品测试导则OECD301化学品测试准则(GuidelinesfortheTestingofChemicals)ASTMD4012水中微生物三磷酸腺苷(ATP)含量标准检测方法[StandardTestMethodforAdenosineTriphosphate(ATP)ContentofMicroorganismsinWater]凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本规范;凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本规范。3术语和计量单位JJF1135、HJ/T153和OECD中界定的及以下术语和定义适用于本规范。3.1生物降解试验biodegradationtest评估受试物被接种物(一般含微生物)分解为CO2、水、矿物盐和新的细胞代谢物的能力的试验。3.2接种物inoculum生物降解试验过程中用于接种的含有活性微生物的试验生物,包括地表水、生活污水处理厂二级出水、生活污水处理厂活性污泥等中的微生物群落。3.3微生物群落microbialcommunity在特定环境下生长的不同种的微生物,在生理和生存过程中具有一定的联系,通过它们之间相互作用,使群体协调发展,并且具有一定功能的微生物的组合。3.4相对光单位relativelightunit,RLU三磷酸腺苷(AdenosineTriphosphate,ATP)水解成一磷酸腺苷(AdenosineMonophosphate,AMP)和焦磷酸盐时释放化学能驱动荧光素在荧光素酶催化下氧化释放的光量子数的测量单位。注:非SI单位,但与ATP浓度成比例关系。不同的检测仪对于同样的样品可能会产生不同的RLU读数。JJF1974—202224概述生物降解性用于评估化学物质与接种物接触表现出被生物降解的潜力,是鉴定化学物质的环境危害性和持久性、进行分类和标签、评价和控制环境风险的基本指标。接种物活性是生物降解性中的主要内容。通过接种物活细胞数量的多寡反映微生物能量代谢的活性,判断其活性是否符合生物降解试验的要求,作为接种物影响生物降解结果的指标。本规范采用ATP法测量接种物中的活细胞浓度。ATP法是将接种物中的ATP经提取后,测量在氧气、ATP和镁离子同时存在下荧光素酶催化荧光素氧化产生的550nm黄绿色光强度。在一定范围内,光强度与ATP浓度成正比例关系。光强度用发光检测仪(如ATP荧光检测仪、微孔板化学发光检测仪等)测量,结果用相对光单位(RLU)表示。根据相对光单位强度可以推算出接种物中的ATP浓度(nmol/L)。通常每个微生物细胞中的ATP含量相对恒定,约(5×10-16~5×10-15)gATP/cell或(10-9~10-8)nmolATP/cell,由此可以计算得到接种物中的活细胞浓度。5测量条件5.1环境条件温度:(19~27)℃。5.2仪器5.2.1发光检测仪:检测范围不低于4个数量级,线性误差小于10%。5.2.2移液器:(1~10)μL,(10~100)μL或(20~200)μL,(100~1000)μL各1支。5.2.3电子天平:分度值为0.01mg。5.2.4高速大容量离心机:离心力不低于1100g。5.2.5水分仪:分度值为0.1mg。5.3试剂5.3.15'-三磷酸腺苷(ATP)二钠盐纯度标准物质(以下简称ATP二钠盐):扩展不确定度≤1%(k=2)。5.3.2ATP标准工作液:配制见附录A.2。5.3.3ATP检测试剂:主要包括ATP提取剂、荧光素和荧光素酶。注:建议使用含有ATP提取剂的商业化ATP检测试剂盒,具体实施依据试剂生产厂家的要求实施。5.3.4高压灭菌水或无菌水:无菌、无ATP。5.3.5矿质培养基:详见附录A.1。5.4材料5.4.1无菌塑料离心管:(2~500)mL。5.4.2不透光的96孔板或其他与发光检测仪适配的器皿。JJF1974—202236测量方法6.1标准曲线的建立6.1.1配制ATP标准工作液,应设置至少5个不同的浓度,如0.1nmol/L、1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L、1000nmol/L,也可根据实际情况设置浓度范围。移液器分别移取ATP标准工作液,与荧光素-荧光素酶混合试剂混合反应。6.1.2用发光检测仪检测并记录相对光强度。每个浓度ATP标准工作液设定3个平行,以3次测量的相对光强度的平均值作为该浓度ATP标准工作液的平均相对光强度。6.1.3以平均相对光强度(y)和ATP标准工作液的浓度(x)绘制标准曲线,进行线性拟合,得到标准曲线方程式(1)。按式(2)计算线性相关系数r,取r≥0.995的浓度范围作为线性范围。若r<0.995时,则去掉最高浓度点,再增加0.5倍最高浓度点,与余下的浓度点重新绘制标准曲线,直至r≥0.995。(xi-)(yi-)(xi-)(yi-)2iy=x+2ii=1-i=1— nxxix∑(-—xixi=1r=(xi-)(yi-) (y-)2i×2 (y-)2i×2ii=1i=i=1式中:r—线性相关系数;xi—第i个测量点的ATP标准工作液浓度,nmol/L;(1)(2)—x—用于计算线性范围的测量点的ATP标准工作液浓度的平均值,nmol/L;yi—第i个测量点的平均相对光强度,RLU;—用于计算线性范围的测量点的相对光强度的平均值,RLU;n—用于计算线性范围的测量点的个数。6.2样品制备6.2.1生物降解试验中的接种物可以有多种来源,包括活性污泥、污水处理厂二级出水、地表水或这几种的混合物。当接种物为活性污泥或多种接种物的混合物时,可利用离心法(以1100g的离心力离心10min)或沉降法(自然沉淀后倒去上清液)等预处理方法去除表面杂质,用矿质培养基(5.3.5)进行清洗至少3次。用水分仪(试验条件为105℃,1h)测定干重,用培养基配制成浓度适宜的悬液作为待测样品(详见附录B.2)。当接种物为污水处理厂二级出水时,可沉淀1h或用粗滤纸过滤,取上清液或滤出液作为待测样品。当接种物为地表水时,如有必要,可通过过滤或离心将接种物浓缩作为待测样品。6.2.2还可使用商业化接种物作为生物降解试验的接种物,具体配制方法可参照商品JJF1974—20224使用说明书或其他相关作业指导书。6.2.3应在样品制备完成后保存在(2~8)℃,并在24h内完成样品ATP浓度的测量。6.3样品的活性定量6.3.1移液器量取样品溶液,加入ATP提取剂处理,释放ATP。6.3.2加入荧光素-荧光素酶混合试剂,充分混合反应。注:步骤6.3.1和6.3.2可依据试剂生产厂家规定的使用要求进行调整。6.3.3用发光检测仪测量并记录相对发光强度。6.3.4步骤6.3.1至6.3.2重复6次,将6次测量的相对发光强度的平均值作为样品的平均相对发光强度,代入式(1)中,计算得到样品ATP浓度的测量值。6.3.5按式(3)计算样品中活细胞浓度的范围。(3)Ccell=(3)式中:Ccell—活细胞浓度,L-1;x—样品ATP浓度的测量值,nmol/L;V1—样品稀释后总体积,L;V—样品体积,L;a—每个活细胞中的ATP含量的理论值,10-9nmol~10-8nmol。6.4测量重复性的计算以6.3.3中样品6次测量结果的相对标准偏差(RSD值)表示的测量重复性,按式(4)计算。 RSD=i-1y)2×100%(4)式中:RSD—测量重复性(相对标准偏差),%;yi—样品第i次测量的相对光强度,RLU;y—样品n次测量的平均相对光强度,RLU;n—测量次数。7质量控制(1)以平均相对光强度(y)和ATP标准溶液浓度(x)绘制标准曲线的线性相关系数r应不小于0.995;(2)单样品6次测量结果的相对标准偏差不得超过10%;(3)使用前,应保证仪器设备的计量溯源性;(4)测量过程中,应保证所有仪器设备的有效性。JJF1974—202258不确定度的评定及表述生物降解试验中ATP法进行接种物活性的定量,测量结果的不确定度来源包括样品体积(V)引入的相对标准不确定度urel(V)、ATP浓度测量(C)引入的相对标准不确定度urel(C)。测量结果的合成标准不确定度表示为:uc[y(x1,x2,…,xn)]=cu(xi)2(5)其中,y(x1,x2,…,xn)为几个参数x1,x2,…,xn的函数,ci为灵敏系数(当各不确定度分量互不相关时,灵敏系数为1)。生物降解试验中ATP法进行接种物活性的定量,各不确定度分量互不相关,因此,测量结果的相对合成标准不确定度表示为:urel=urel(V)2+urel(C)2(6)其中,urel(V)的不确定分量包括样品制备引入的相对标准不确定度和测试样品体积引入的相对标准不确定度;urel(C)的不确定分量包括标准物质引入的相对标准不确定度、标准曲线线性拟合引入的不确定度(最小二乘法拟合)以及样品测量引入相对标准不确定度。各输入量的不确定度来源及评定方法见表1,各输入量的相对标准不确定度分量的计算方法参见附录B。相对扩展不确定度表示为:Urel=urel×k(k=2)表1测量结果的不确定度来源及评定输入量的标准不确定度不确定度来源评定方法输入量的相对标准不确定度分量urel(V)测试样品体积及稀释体积B类环境温度变化B类urel(C)标准物质纯度B类标准曲线线性拟合B类测量结果重复性A类发光检测仪B类JJF1974—20226附录A试验溶液的配制A.1矿质培养基的配制生物降解测试方法中的接种物试验体系由矿质培养基配制,具体使用的试剂及配制方法示例见表A.1。表A.1矿质培养基的配制贮备液成分浓度/(g/L)贮备液(a)KH2PO48.50K2HPO421.75Na2HPO4·2H2O33.40NH4Cl0.5贮备液(b)CaCl227.50或CaCl2·2H2O36.40贮备液(c)MgSO4·7H2O22.50贮备液(d)FeCl3·6H2O0.25矿质培养基将10mL贮备液(a)加800mL无菌水,再加贮备液(b)、贮备液(c)和贮备液(d)各1mL,加无菌水定容到1L(pH在7.4±0.2)。矿质培养基现配现用,不保存。如果贮备液出现沉淀,则需重新配制A.2ATP系列标准工作液的配制A.2.1试剂与材料A.2.1.1ATP(二钠盐)纯度标准物质。A.2.1.2高压灭菌水或无菌水:无菌、无ATP。A.2.1.3离心管:2mL,无菌、无ATP。A.2.2仪器A.2.2.1电子天平:分度值为0.01mg。A.2.2.2移液器:(1~10)μL,(10~100)μL或(20~200)μL,(100~1000)μL各1支。A.2.3ATP系列标准工作液的配制A.2.3.1根据ATP(二钠盐)纯度标准物质的纯度,计算并精密称取一定量的ATP二钠盐纯度标准物质,置于2mL离心管中,加无菌水,充分溶解混匀,得到浓度为1×106nmol/L的ATP标准母液。每次临用前新鲜配制。A.2.3.2取ATP标准母液100μL,置于离心管中,加水9900μL,混匀,得到ATP标准中间液,浓度为1×104nmol/L。JJF1974—20227A.2.3.3取浓度为1×104nmol/L的ATP标准中间液100μL,置于离心管中,加水900μL,混匀,得到ATP标准工作液,浓度为1000nmol/L。A.2.3.4重复上一步稀释方法,通过10倍梯度稀释,得到系列ATP标准工作液,浓度依次为100nmol/L、10nmol/L、1nmol/L、0.1nmol/L。JJF1974—20228附录B生物降解试验中接种物活性定量测量应用实例B.1仪器与试剂B.1.1仪器:0差的扩展不确定度(k=2)为9.3%。B.1.1.3水分仪:分度值为0.01mg。B.1.1.4高速大容量离心机:加速度不低于1100g(约11000m/s2)。B.1.2试剂B.1.2.1ATP二钠盐纯度标准物质:纯度为92%,扩展不确定度U=0.7%(k=2)。B.1.2.2ATP检测试剂盒。B.1.2.3高压灭菌水或无菌水。B.1.2.4矿质培养基:具体使用的试剂及配制方法见附录A.1。B.2样品制备B.2.1本次测量的样品为某生活污水处理厂曝气池采集的活性污泥。污水处理厂的处理工艺为厌氧好氧法(A/O)。污泥使用前保持曝气状态(尽可能减少从污水处理厂到实验室的转运未曝气状态)。B.2.2样品制备过程B.2.2.1用矿质培养基清洗污泥:每次加入矿质培养基混匀后,离心(1100g,4℃)10min。离心分离后去除上清液,该程序重复3次。B.2.2.2取(0.4~0.5)g洗过的污泥用水分仪测定干重,条件为105℃、1h。B.2.2.3根据处理后污泥干重计算配制污泥悬浮液所需取用污泥的量。取适量离心过的污泥分散于1L的矿质培养基,配制干重浓度为3g/L的活性污泥悬浮液,搅拌器搅匀后搅拌曝气待用。B.2.2.4取浓度为3g/L的活性污泥悬液100mL,加矿质培养基900mL,混匀,得到浓度为300mg/L的活性污泥悬浮液。B.2.2.5取浓度为300mg/L的活性污泥悬液100mL,加矿质培养基900mL,混匀,得到浓度为30mg/L的活性污泥悬浮液。B.3标准曲线的建立B.3.1称取ATP二钠盐纯度标准物质1.20mg,置于离心管中,加水2.00mL充分溶解混匀,得到ATP标准母液,浓度为1×106nmol/L。B.3.2按附录A.2.3.2至A.2.3.4的步骤,配制浓度分别为0.1nmol/L、1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L和1000nmol/L的ATP标准工作液。B.3.3按ATP检测试剂盒的说明书,将试剂盒中的缓冲液转移到含有荧光素酶的冻干粉中混匀溶解,得到底物溶液。JJF1974—20229B.3.4将100μL底物溶液与100μLATP标准工作液混合形成反应液,室温反应1min。B.3.5将反应液放入微孔板化学发光检测仪中,测定反应液的相对发光强度。B.3.6每个浓度的ATP标准工作液进行3次平行测量,取以3次测量的荧光示值的平均值作为该浓度ATP标准工作液的平均相对发光强度。B.3.7以平均相对光强度RLU(y)和ATP标准工作液的浓度(x)绘制标准曲线,进行线性拟合,得到标准曲线方程,计算相关系数r,见表B.1。表B.1ATP标准工作液的测量结果序号iATP标准工作液浓度xinmol/L各浓度ATP标准工作液的平均相对光强度yi/RLU标准曲线方程线性相关系数r相对光强度平均值10.117821743y=23858x-229291171217362115089150861516715003310182618181288181263179983410023642292360155235112323651125100023832476238353042382755123845885B.4活性污泥的活性定量和测量重复性计算B.4.1移取100μL30mg/L活性污泥悬液,加入100μL底物溶液,室温反应5min。B.4.2将含有反应液的96孔板放入微孔板化学发光检测仪中,测量反应液的相对光强度。B.4.3步骤B.4.1至B.4.2重复6次,将6次测量的荧光示值的平均值作为样品的平均相对发光强度,代入式(1)中,计算得到样品ATP浓度的测量值。B.4.4按式(3)计算样品中活细胞浓度Ccell(L-1)的范围。B.4.5按式(4)计算测量重复性,测量结果见表B.2。JJF1974—202210表B.230mg/L活性污泥悬液的活性定量测量结果测量次数i123456第i次测量的相对光强度RLU210275206355227002234751204421217837平均相对光强度RLU216774ATP浓度的测量值nmol/L10.05活细胞浓度CcellL-11.01×109~1.01×1010测量重复性RSD%5.10B.5测量不确定度的计算生物降解试验中ATP法进行接种物活性的定量,测量结果的不确定的评定包括样品体积(V)引入的相对标准不确定urel(V)和ATP浓度测量(C)引入的相对标准不确定度urel(C)的评定,各分量的不确定度结果及评定方法(见表B.3)。B.5.1样品体积(V)引入的相对标准不确定度urel(V)B.5.1.1样品制备引入的相对标准不确定度urel(V-1)30mg/L的活性污泥悬液制备过程中使用了2次100mL的容量瓶,1000mL的容量瓶使用次数为3。两种量程的容量瓶均为A级。由100mL容量瓶定容引入的相对标准不确定度为:urel(V-1-1)=0.10/100=1×10-3由1000mL容量瓶定容引入的相对标准不确定度为:urel(V-1-2)=0.40/1000=4×10-4则样品制备引入的标准不确定度为:urel(V-1)=2×u(V-1-1)+3×u(V-1-2)=1.57×10-3B.5.1.2测试样品体积引入的相对标准不确定度urel(V-2)测试溶液使用的移液器量程为200μL,分度值为1μL。校准证书中的扩展不确定度为:U=0.06μL(k=2)由移液器引入的标准不确定度为:u(V-2)==0.03μL相对标准不确定度为:urel(V-2)=u(V-2)/200=1.50×10-4试验过程中,温度引入的不确定度可忽略不计。JJF1974—202211则由样品体积(V)引入的相对标准不确定度为:urel(V)=u(V-1)+u(V-2)=1.58×10-3B.5.2ATP浓度测量(C)引入的相对标准不确定度urel(C)B.5.2.1标准物质引入的相对标准不确定度urel(C-1)度为准物质纯度为92.0%±0.8%(k=2),由标准物质纯度引入的相对标准不确定B.5.2.2标准曲线线性拟合引入的标准不确定度urel(C-2)(最小二乘法拟合)urel(C-1)=(0.8%/2)/92.0%=B.5.2.2标准曲线线性拟合引入的标准不确定度urel(C-2)(最小二乘法拟合)(1)直线方程为y=ax+b,拟合曲线估计误差s(y)为:s(y)=i-2y)2(B.1)式中:yi—各浓度ATP标准溶液的相对光强度,RLU;y—根据标准曲线算出的理论值,RLU;n—标准溶液总共测量次数。(2)标准曲线线性拟合标准不确定度u(C-2)为:u(C-2)=++(B.2)式中:C0—待测样品浓度的平均值;p—待测样品溶液测定的次数;—C—标准溶液浓度的平均值;Cj—标准溶液的浓度值。.:得s(y)=21416,u(C-2)=0.45。urel(C-2)=0.45/10.05=0.04B.5.2.3样品测量结果引入的相对标准不确定度urel(C-3)B.5.2.3.1测量结果重复性引入的相对标准不确定度urel(C-3-1)(B.3)SD=(yi-)2(B.3)式中:SD—测量结果的标准偏差,%;yi—第i个测量的结果,RLU;-y—n次测量结果的平均值,RLU;n—测量次数,n=6。JJF1974—202212由测量重复性引入的标准不确定度为:urep相对标准不确定度为:urel(C-3-1)=根据表B.3中数据,计算得urel(C-3-1)=0.02。B.5.2.3.2检测仪器的测量不确定度urel(C-3-2)由微孔板化学发光检测仪校准证书得到扩展不确定度U=9.3%(k=2),微孔板化学发光检测仪的标准不确定度为:u==4.65%测量仪器引入的相对标准不确定度为:urel(C-3-2)==2.15×10-7因此,样品中ATP的浓度测量结果引入的相对标准不确定度为:urel(C-3)=u(C-3-1)+u(C-3-2)=0.02综上,由ATP浓度测量(C)引