蛋白免疫快速诊断应用技术

关于蛋白免疫快速诊断应用技术交流提纲

前言一）、免疫检测基础知识及免疫检测技术的进展综述二）、快速免疫检测技术现状和前景展望三）、快速免疫检测技术的应用介绍四）、思考——

胸怀大志，放眼世界，立志细节第2页,共51页，2024年2月25日，星期天前言：1、个人所从事的行业和专业的限制1）医学专业、生物专业、化学专业（人）2）临床免疫类检验试剂（人用）的开发3）对客户/临床需求有所了解2、有可能找到的共同点1）所采用技术方法具有共同点2）为了共同的目标——为人类健康服务第3页,共51页，2024年2月25日，星期天一、免疫检测基础知识及免疫检测技术的进展综述

免疫学技术的范畴1、对具有免疫活性物质的定性、定量测定2、对免疫系统的组成成分的数量、状态的测定第4页,共51页，2024年2月25日，星期天一、免疫检测基础知识及免疫检测技术的进展综述

免疫学技术的应用特点1、对象——“包罗万象”2、方法——“兼容并蓄”第5页,共51页，2024年2月25日，星期天一、免疫检测技术的进展综述

抗原的概念与属性1、免疫原性——可识别、可反应性（诱导机体产生免疫应答的特性）2、免疫反应性

——选择结合性（和免疫应答产物特异性结合的特性）第6页,共51页，2024年2月25日，星期天一、免疫检测技术的进展综述

抗原抗体反应的特点1、特异性2、可逆性3、适合比例性第7页,共51页，2024年2月25日，星期天一、免疫检测技术的进展综述

免疫学检测技术评价标准1、Specificity（特异）2、Sensitivity（敏感）3、Simplicity（简便）4、Safety（安全）5、Saving（节约）第8页,共51页，2024年2月25日，星期天一、免疫检测技术的进展综述

免疫检测技术的进展1、经典的免疫分析技术凝集反应、沉淀反应、溶血反应、补体结合实验特点：成本低、技术简单、结果易于判断，但不易于实现自动化。2、现代的免疫分析技术荧光免疫标记、放射性免疫标记、酶免疫标记、镧系（稀土）元素免疫标记、胶体颗粒标记、临床化学免疫分析技术、发光免疫标记、流式免疫微球技术及生物传感器技术等。特点：灵敏、特异、快速、易于测定及实现自动化。第9页,共51页，2024年2月25日，星期天二、快速免疫检测技术的过去、现状和未来POCT概念的引入POCT——PointofCareTesting不需要固定的场地、不需要太多的时间、也不需要特定的地方、在没有实验室设备的条件下也能完成检测。检测可在患者身边或者靠近患者的地方完成。Testsdesginedtobeatornearthesitewherethepatientislocated,thatdonotrequirepermanentspace,andthatareperformedoutsidethephysicalfacilitiesoftheclinicallaboratory.(美国病理家学会CollegeofAmericanPathologists）

第10页,共51页，2024年2月25日，星期天二、快速免疫检测技术的过去、现状和未来POCT技术已使用了上千年1、约公元前1500年法老的私人医生注意到有些人的尿液吸引了很多蚂蚁，而另一些人的尿液则没有。2、后来发现这种现象与尿液中的葡萄糖浓度有关第11页,共51页，2024年2月25日，星期天二、快速免疫检测技术的过去、现状和未来美国FDA对简便实验的定义1988年美国临床实验室改良法案：临床豁免权1、全自动化仪器直接使用未处理过的标本/毛细管血（指尖血）、鼻拭子或尿液；2、对标本只需进行基本的、无技术要求的处理，包括去污；3、对试剂只需要进行基本的、无技术要求的处理，例如，将试剂A和试剂B混匀4、分析步骤不需要操作者干预5、不需要技巧或专门知识第12页,共51页，2024年2月25日，星期天二、快速免疫检测技术的过去、现状和未来美国FDA对简便实验的定义6、无需电子或机械设备保养7、所得结果不需要操作者校准、解释和计算8、结果易读，例如阳性或阴性，直接读出数值，线条很明显或无线条存在，即等级明显9、试验性能可与可溯源的参考方法相比较10、有用户可看懂的快速参考指南

/cdrh/ovid/guidance/1171.pdf第13页,共51页，2024年2月25日，星期天二、快速免疫检测技术的过去、现状和未来POCT的术语1、护理点/床边/即时检验（PointofCareTesting)2、近患者检验(NearPatientTesting)3、医务室检验(PhysiciansOfficeTesting)4、床边检验(BesideTesting)5、实验室外检验(Extra-laboratoryTesting)6、分散检验(DecentralizedTesting)7、机构外检验(OffsiteTesting)8、辅助检验(AncillaryTesting)9、替换点检验(AlternativeSiteTesting)第14页,共51页，2024年2月25日，星期天二、快速免疫检测技术的过去、现状和未来看看发生了什么变化？不需要专业的操作者需要专业的操作者不需要专业的装置需要专业的装置第15页,共51页，2024年2月25日，星期天二、快速免疫检测技术的过去、现状和未来POCT产品都在哪里应用日间病房救护车医生研究室血库社区卫生诊所环境实验室健康义诊家庭康复机构消防队康复中心第16页,共51页，2024年2月25日，星期天二、快速免疫检测技术的过去、现状和未来为什么要推动POCT产品？护理过程最佳化病人护理产出灾难救助测试平台法规要求工业吸引力劳动力问题第17页,共51页，2024年2月25日，星期天二、快速免疫检测技术的过去、现状和未来POCT产品的优点操作人员不需要技术背景周转时间的改善提高了治疗的忠诚度检测越好，做的越频繁样品量少经济利益减少住院天数减少并发症第18页,共51页，2024年2月25日，星期天二、快速免疫检测技术的过去、现状和未来POCT产品的优点：周转时间摘自Price,BMJ2001的文章试验实验室POCT分钟（变化%）尿液分析404-36（90）妊娠785-71（94）葡萄糖106-4（60）第19页,共51页，2024年2月25日，星期天二、快速免疫检测技术的过去、现状和未来POCT产品的缺陷操作者无技术背景结果质量差，与实验室结果有一定差异不经济资料不便记录第20页,共51页，2024年2月25日，星期天二、快速免疫检测技术的过去、现状和未来当前POCT的应用（1）1、乳胶凝集试验实验时间为10-15分钟快速、基本不需要仪器试剂可以冷冻敏感性差8-10%的反应结果不好解释2、直接荧光抗体试验30-60分钟，需要多个步骤需要有昂贵的荧光显微镜及熟练的操作人员第21页,共51页，2024年2月25日，星期天二、快速免疫检测技术的过去、现状和未来当前POCT的应用（2）3、FISH(荧光原位杂交）需要一段已知的DNA序列需要一台荧光显微镜，且有熟练显微镜操作的人员步骤多，实验时间为1-2小时4、免疫层析（渗滤）试验敏感性高、特异性强总实验时间5-15分钟不需要仪器、也不需要基本的培训样品不需要特殊处理免疫层析（渗滤）产品是继尿试纸条和血糖试条之后，当前最为受欢迎的POCT产品第22页,共51页，2024年2月25日，星期天二、快速免疫检测技术的过去、现状和未来免疫渗滤试验主要由两部分组成：膜渗滤装置和标记结合物。前者为一塑料小盒，其中填满吸水性物质，面上紧贴放置一片吸附有抗体(以双抗体夹心法测抗原为例)的硝酸纤维膜，标记结合物为免疫金。A：金标记抗体B：标本中的抗原C：包被抗体D：NC膜E：吸水材料F：塑料盒第23页,共51页，2024年2月25日，星期天二、快速免疫检测技术的过去、现状和未来免疫层析试验免疫层析法中滴加在膜一端的样品溶液受膜的毛细管作用(基于层析作用的横流（lateralflow）)向另一端移动。移动过程中被分析物与固定在膜上某一区域的受体(抗原或者抗体)结合而被固相化，无关物质则越过该区域而被分离，然后通过标记物显色来判定试验结果，以胶体金为标记物的实验称为胶体金免疫层析试验。第24页,共51页，2024年2月25日，星期天二、快速免疫检测技术的过去、现状和未来POCT的未来？？？？微流体技术？纳米技术？第25页,共51页，2024年2月25日，星期天三、快速免疫层析技术的应用介绍能用来做什么传染病抗原或抗体测定肿瘤标志物测定激素测定农药残留测定抗生素测定毒素测定药物滥用（毒品）测定第26页,共51页，2024年2月25日，星期天三、快速免疫层析技术的应用介绍针对检验、我们能做什么传染病抗原或抗体测定肿瘤标志物测定？？？？激素测定农药残留测定抗生素测定毒素测定药物滥用（毒品）测定立足需求，充分考虑和整合各种优势资源！第27页,共51页，2024年2月25日，星期天三、快速免疫层析技术的应用介绍我们要怎么去做调研：我们要做采用什么平台技术平台建设：我们建立快速免疫层析技术平台项目：我们要做什么项目？准备：我们拥有了哪些资源，我们还缺少什么资源？第28页,共51页，2024年2月25日，星期天三、快速免疫层析技术的应用介绍免疫层析技术平台硬件：实验室；设备；生产车间？软件：SOP?人员：专业培训、团队建设第29页,共51页，2024年2月25日，星期天三、快速免疫层析技术的应用介绍如何去开发一个胶体金层析产品

——以尿妊娠试纸（HCG)为例第30页,共51页，2024年2月25日，星期天三、快速免疫层析技术的应用介绍尿妊娠试纸（HCG)的反应原理图双抗体夹心法第31页,共51页，2024年2月25日，星期天三、快速免疫层析技术的应用介绍尿妊娠试纸（HCG)的产品研发准备1、生物材料的准备：配对的单克隆抗体（特异性针对HCG-α,β亚基)二抗2、主要生产材料硝酸纤维素膜（特定孔径、流速）样品垫结合垫吸收垫（吸水纸）、片材（PVC衬板）等第32页,共51页，2024年2月25日，星期天三、快速免疫层析技术的应用介绍尿妊娠试纸（HCG)的研发准备3、主要设备点膜仪喷金仪干燥设备粘帖装置切刀第33页,共51页，2024年2月25日，星期天三、快速免疫层析技术的应用介绍尿妊娠试纸（HCG)部分材料的工艺和质量控制1、特异性的单克隆抗体亲和力特异性稳定性第34页,共51页，2024年2月25日，星期天三、快速免疫层析技术的应用介绍尿妊娠试纸（HCG)部分材料的工艺和质量控制2、标记物与蛋白偶联颗粒大小颗粒的均一性颗粒的形状标记物与蛋白的最佳比例标记影响影响因素考虑第35页,共51页，2024年2月25日，星期天三、快速免疫层析技术的应用介绍尿妊娠试纸（HCG)部分材料的工艺和质量控制蛋白与胶体金的偶联：最佳pH测定：取若干1.5ml的试管，分别加入1ml胶体金用K2CO3将pH分别调为3，4，5，6，7，8，9，10；加入过量待标记蛋白；取96孔培养板，按pH从高到低分别将上述胶体金分别取100μl加入孔中，重复三次；每孔分别加入20μl浓度为10%的NaCl溶液，混合，室温下放置10min；观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低pH第36页,共51页，2024年2月25日，星期天三、快速免疫层析技术的应用介绍尿妊娠试纸（HCG)部分材料的工艺和质量控制蛋白与标记物的偶联：最佳偶联比例确定：以目测法确定胶体金与待标记蛋白质用量比例，将标记的蛋白质逐级稀释后（由5μg～45μg另设对照管），各取等体积顺序加入一系列装有1ml胶体金的试管中，5min后，在上述各管内分别加入0.1ml10%氯化钠。第37页,共51页，2024年2月25日，星期天三、快速免疫层析技术的应用介绍尿妊娠试纸（HCG)部分材料的工艺和质量控制3、样品垫

玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸、无纺布等多种材质，多种规格，批间稳定。样品垫的作用：减缓样品渗透速度，有利于样品在结合垫上均匀分布；去除样品中杂质颗粒；调节样品等。样本垫可使用化学物质进行浸渍处理，从而减少样本差异，提高试验的灵敏度。通常可以将洗涤剂、粘性增强剂、阻滞剂及盐渗入样本垫然后加以干燥，该工艺可避免使用复杂辨识剂/追迹缓冲液的麻烦，使检测一步完成。第38页,共51页，2024年2月25日，星期天三、快速免疫层析技术的应用介绍尿妊娠试纸（HCG)部分材料的工艺和质量控制4、结合垫玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸、无纺布等多种材质，多种规格，批间稳定。结合垫的作用主要为：

-吸附一定量的标结合物颗粒；

-吸附并持续不断的将样品转移到NC膜上；

-保持标结合物颗粒的稳定性；

-保证标结合物颗粒定量完全释放等。第39页,共51页，2024年2月25日，星期天三、快速免疫层析技术的应用介绍尿妊娠试纸（HCG)部分材料的工艺和质量控制5、硝酸纤维素膜(Nitrocellulose)：推荐使用Millipore，S&S等国外公司的硝酸纤维素膜。

NC膜的作用：-在检测线和对照线条带区域固定抗体；-样品在NC膜上流动并与试剂混合发生免疫反应；

-反应在NC膜上显色，读检测结果

NC膜的重要参数：孔径、对称性、层析速度、蛋白结合力、强度、表面质量、厚度、批间均一性等。第40页,共51页，2024年2月25日，星期天三、快速免疫层析技术的应用介绍尿妊娠试纸（HCG)部分材料的工艺和质量控制5、硝酸纤维膜硝酸纤维膜的分类标准(μm和s)μm:指的是膜孔径，此说法实际上是沿用了一直以来的一个形象称呼。

s:以秒为单位的定义为，每4cm膜，水的层析时间是**s.

换算情况大致为：8μm=135s；6μm=180s不同秒数的膜对反应的影响通过速度越快和包被在T线的物质反应时间也就越短，读数快，那么灵敏度也就越低。反之，反应时间长，读数慢，也就灵敏度高。同时还有一个问题是，反应时间越长，发生非特异性结合的可能性就越大，所以过长时间的反应不一定就能够真正的提升灵敏度。

135s一般用在双抗体夹心法，180s一般用在竞争法.

第41页,共51页，2024年2月25日，星期天三、快速免疫层析技术的应用介绍尿妊娠试纸（HCG)部分材料的工艺和质量控制5、硝酸纤维膜如何选择物理性能膜的物理性能主要是2个参数，膜厚度和宽度厚度不均匀影响生物原料在膜上的扩散性能，点出来的C/T线宽窄不一，另外也影响爬速；宽度(检测区的长度)和爬速及灵敏度的关系跑水性能注入足够溶液到槽内，将不同批次膜每隔1cm做一次标记（总长大于4cm）并放到倾斜支架，整个支架下端放入溶液槽，膜开始吸液，计时。记录每个标记处的通过时刻，并与对照组比较。跑板时，理论上溶液呈水平线形式上吸，观测是否有波浪倾斜或包围润湿等反常现象。点样测试

C/T线出线时间和灵敏度

第42页,共51页，2024年2月25日，星期天三、快速免疫层析技术的应用介绍尿妊娠试纸（HCG)部分材料的工艺和质量控制6、吸收垫