菌种的退化与保藏

关于菌种的退化与保藏第一节菌种退化及防治第二节菌种保藏第三节菌种保藏机构第2页,共34页，2024年2月25日，星期天

菌种是各个国家的重要自然资源，尤其是优良的工业生产菌种是有野生型菌种经过诱变育种、杂交育种、代谢工程等育种方法筛选得到的，其获得非常不容易，往往要花费很长的时间和大量的人力、物力。但微生物菌种在传代繁殖和保藏过程中会出现退化现象。所以，在科研和生产中应该设法减少菌种的退化和死亡。菌种保藏是一项重要的工业微生物学基础工作，其目的是保证菌种经过较长时间保藏后仍然保持较强的生活力，不被其他杂菌污染，且形态特征和生理性状尽可能不发生变异，以便今后长期使用。第3页,共34页，2024年2月25日，星期天第一节菌种的退化及防治一、菌种退化所谓菌种退化是指生产菌种和优良菌种由于传代或保藏之后，群体中的某些生理特征或形态特征逐渐减退或消失，如生产菌株生产性状的劣化、遗传标记的丢失、典型性状变得不典型等。菌种退化是一个有量变到质变的逐渐的演化过程。开始时，在微生物群体中仅出现个别负变细胞，随着连续传代，负变细胞开始增加，最后在群体中占了优势，导致产量下降和优良性状丧失。二、菌种退化的原因1.基因突变是引起菌种退化的主要原因微生物在移种传代过程中会发生自发突变，这些突变包括高产菌株的回复突变和新的负变菌株，它们都是低产菌株。开始时，这些突变菌株在群体所占的比例很小，但由于这些低产菌株的生长速率往往大于高产菌株，所以经过传代后，它们在群体中的数量逐渐增多，直至占优势，表现为退化现象。第4页,共34页，2024年2月25日，星期天

在育种过程中经常会出现初筛时产量很高，而复筛时产量又下降了的情况。这其实也是一种退化现象，气主要原因是由表型延迟造成的。一般突变都发生在DNA的单股链上的某个位点，经过DNA复制和细胞分裂后，一个细胞为突变细胞，另一个细胞为正常细胞。经过传代繁殖，正常细胞由于成长速率比高产菌株快，因此，在数量上占了优势，导致了产量的下降。某些丝状菌的生活史中只有菌丝体不产生孢子，其菌丝为多核细胞，如果这些菌丝体在诱变过程中仅有一个核发生高产基因突变，那么，经过几代繁殖后将会出现分离现象，导致性状退化。如果突变后产生的后代是非整倍体或部分二倍体，在繁殖过程中也会发生性状分离，出现低产细胞，导致退化。除了核基因突变外，某些控制产量的质粒脱落或核DNA与质粒DNA复制不一致（如质粒DNA的复制速度比核DNA低）也会导致菌种退化。第5页,共34页，2024年2月25日，星期天2.连续传代是加速菌种退化的直接原因微生物自发突变都是通过繁殖传代发生的，移种代数越多，发生突变的概率就越高。另外，基因突变在开始仅发生在个别细胞，如果不传代，个别低产细胞不会影响群体的表型。只有通过传代繁殖后，低产细胞才能在数量上占优势，使群体表型发生变化，即导致菌种退化。3.培养条件和保藏条件可以从多个方面影响菌种的性状1）不同的环境条件可以诱发不同功能的基因显性生物体的显性和隐性是相对的，它们可以随着环境条件的改变而变化。一个优良菌株在不良的培养条件或保藏条件下，其高产性状也会变成隐性性状，即高产特征不会表现出来。第6页,共34页，2024年2月25日，星期天2）培养基的影响培养基会影响不同类型细胞和细胞核的数量。这是由于不同培养基会影响群体细胞中高产突变细胞和低产野生型细胞是生长速度，从而使高产成本细胞和低产细胞的数量发生变化。对丝状微生物来说，不同的培养基也会使不同的类型的细胞核的数量发生变化。培养基也会影响菌种的培养特征和形态特征。同一菌种在不同培养基上会出现不同的菌落形态，例如含高氨培养基不利于放线菌产生菌丝和孢子的形成。3）培养条件的影响除了培养基外，培养条件如温度、湿度、PH值、O2等也会影响菌种的退化，尤其是高温对菌种非常不利，这可能与高温容易使某些酶失活和容易引起质粒脱落有关。4）保藏条件不良的保藏条件也会引起菌种退化。保藏条件要求绝氧、干燥、低温。第7页,共34页，2024年2月25日，星期天三、菌种退化的防治遗传是相对的，变异是绝对的，所以菌种退化是不可避免的。因此，要求积极采取措施防止菌种退化。为了防止菌种退化，需要采取以下措施1.尽量减少传代连续传代是加速菌种退化的直接原因。因此要防止菌种退化，首先要减少传代次数。要尽量避免不必要的传代，并将必要的传代降低到最低限度。2.用单核细胞和单菌落移种传代放线菌和霉菌的菌丝细胞是多核的，其中也可能异核体或部分二倍体，所以，用菌丝接种、传代易产生分离现象，会导致菌种退化。因此，要用单核的孢子进行移种，最好选用单菌落的孢子进行传代，因为单菌落是由单个孢子发育而形成的，其遗传特征一致，不会发生分离现象第8页,共34页，2024年2月25日，星期天3.经常进行菌种纯化所谓菌种纯化就是对菌种进行自然分离。首先将菌种制成单细胞或单孢子悬浮液，经稀释后将其涂布与琼脂平板上培养，待平板上单菌落培养成熟后挑取单菌落移种斜面，再经摇瓶试验后测定其生产能力，从中选出高水平的菌种。4.采用良好的培养基和培养条件培养基和培养条件可以从多方面影响菌种的性状，因此，为了防止菌种退化，要选择合适的培养基和培养条件。5.采用科学的保藏方法在菌种保藏过程中也会发生菌种退化现象，尤其是不良的保藏条件更易引起菌种退化。因此，要采取科学和有效的菌种保藏方法以防止菌种优良性状的退化。第9页,共34页，2024年2月25日，星期天四、菌种复壮菌种退化是不可避免的，如果生产菌种已经退化，那么我们要及时对已退化的菌种进行复壮，使优良性状得以恢复。从菌种退化的演化过程看，开始时所谓纯的菌株其实已包含了很少的衰退的细胞，到菌种退化时，虽然群体中大部分是衰退细胞，但仍有少数尚未衰退的细胞存在。因此，可以通过自然分离的方法将那些尚未衰退的细胞从群体中分离出来，使菌种的优良性状得以恢复。这就是所谓的菌种复壮。这种在菌种已退化的情况下通过自然分离的方法将少数尚未衰退的个体从退化的群体中分离出来以回复菌种原有优良性状的复壮，是一种消极的措施。积极的措施应该是在菌种的生产能力尚未退化前，经常进行自然分离，以保持菌种的生产性能稳定，同时也有可能使菌种的生产性能得到进一步的改进或提高。第10页,共34页，2024年2月25日，星期天

第二节菌种保藏

菌种是一个企业乃至一个国家的重要生物资源，尤其是优良的工业生产菌种更是一个国家的重要财富，而科学的、有效的菌种保藏方法是防止菌种退化的必要措施，因此，研究和选择良好的菌种保藏方法具有重要意义。菌种保藏要求不受杂菌污染，是退化和死亡降低到最低限度。从而保持纯种和优良性能。菌种保藏的基本原理是抑制杂菌的代谢活动，使菌种处于休眠状态、停止繁殖，以减少菌种的变异。为此，一个良好的保藏方法就要为菌种创造一个适合其长期休眠的环境条件，如干燥、低温、缺氧。缺乏营养、添加保护剂等。常用的菌种保藏方法有斜面保藏法。液体石蜡保藏法、砂土保藏法、麸皮保藏法、冷冻干燥保藏法、低温保藏法、液氮超低温保藏法等。第11页,共34页，2024年2月25日，星期天一、斜面保藏法斜面保藏法是将菌种接种于斜面培养基上培养，培养成熟后置于4℃冰箱保藏。斜面保藏法是一种短期的菌种保藏方法，广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和丝状真菌。影响斜面保藏法的因素很多，归纳起来，主要有保藏培养基和保藏条件两个方面。保藏培养基一般要求营养成分相对贫乏些，氮资源略高而碳资源较低，以减少PH值下降。放线菌和霉菌以适当控制菌体生长而有利于孢子的形成为原则；采用贫乏和丰富培养基交替培养进行菌种保藏，有利于延缓菌种衰退。保藏条件要求温度控制在4℃左右；每1～3月移接一次；传代次数不超过3～4次。第12页,共34页，2024年2月25日，星期天

斜面保藏的缺点是斜面在保藏期间菌种的生长繁殖没有完全停止，存在自发突变的可能；在斜面转接过程中，易发生退化、污染；斜面在保藏期间，培养基中的水分易蒸发，导致渗透压增大，引起菌种衰退、死亡。用斜面保藏发保藏菌种时，在斜面培养结束后，用无菌的橡皮塞代替棉塞，可以避免水分散发并且能隔氧，能适当延长菌种的保藏期。二、液体石蜡保藏法液体石蜡保藏法是直接将液体石蜡加入到生长好的菌种斜面上，然后将其放入4℃冰箱保藏，如图11-1所示。液体石蜡保藏法其实也是一种斜面保藏法，其优点是在斜面上加入了石蜡油，在保藏期间可以防止水分蒸发，并隔绝氧气，所以，能延长保藏的时间。液体石蜡保藏法的缺点是必须直立放在冰箱内，占据较大的空间。第13页,共34页，2024年2月25日，星期天液体石蜡保藏法的应用较广，特别适用于固体培养基上不能形成孢子的丝状担子菌，但不适合以石蜡为碳源或对石蜡敏感的菌种三、干燥保藏法不少微生物能产生孢子或芽孢，孢子或芽孢处于休眠状态。在干燥环境中抵抗力强不会死亡。依据这一原理，可以把孢子或芽孢接种到适宜的载体上，人为地创造一个干燥的环境来保藏菌种。可以作为菌种干燥保藏的载体有砂土、滤纸、硅胶、麸皮等。干燥保藏法是将接有孢子或芽孢的载体经真空干燥置于低温下保藏。1.砂土管保藏法此法使微生物吸附在砂土上进行保藏，砂土保藏法包括制备砂土和埋砂土两个步骤第14页,共34页，2024年2月25日，星期天1）砂土制备取黄沙，加入10%盐酸浸泡24h，倾去溶液，用自来水冲洗至中性，烘干，60目过筛，再用磁铁除去黄沙中的铁质。另取未被污染的瘠薄的地表以下的土，用自来水浸泡冲洗至中性,烘干,碾细,过120目筛.将以上经过处理的砂和土以1:1或3:2的比例混合均匀,分装入小试管内,加上棉塞并包扎牛皮纸,与121℃间歇灭菌三次，每次灭菌时间为1h。第15页,共34页，2024年2月25日，星期天2）埋砂土埋砂土的方法可以分为湿埋法、干埋法。湿埋法是取培养好的新鲜斜面，加入适量无菌水，轻轻刮下孢子，制成孢子悬浮液，再向每支砂土管中加入0.2mL孢子悬浮液，搅拌均匀，然后抽真空干燥4h左右，最后把制备好的砂土管放入干燥器内，置于冰箱低温保存。干埋法是直接从培养好的新鲜斜面上刮下孢子，加入到每支砂土管中，混匀，然后抽真空干燥42h左右，把制备好的砂土管放入干燥器内，置于冰箱低温保存。砂土管保藏法的优点是操作简便，使用方便，可反复多次使用，其缺点是微生物的新陈代谢没有完全停止，易引起菌种退化变异。砂土管保藏法适合于产分生孢子的霉菌、放线菌以及产芽孢的细菌，但不适于担子菌类、只靠菌丝繁殖的真菌、无芽孢的细菌、酵母等。第16页,共34页，2024年2月25日，星期天2.麸皮保藏法将麸皮与水或其他培养基成分以一定的比例拌匀，水或培养液与麸皮的比例为1：（0.8～1.5），具体按照不同菌种对水分的要求不同而定。再将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中，并进行高温灭菌，装入的麸皮应保持疏松。然后将菌种的孢子液接入，混匀，并在适宜的温度下培养，直至长出菌丝。最后将培养好的试管或安瓿管放在干燥器中干燥，干燥结束后置于冰箱冷藏室保藏。麸皮保藏法操作简单，菌种保藏时间长，不易退化，适合于产孢子的霉菌或放线菌。第17页,共34页，2024年2月25日，星期天四、冷冻干燥保藏法冷冻干燥保藏法是将菌液在冻结状态下升华其水分，最后获得干燥的菌体样品。该法同时具备干燥、低温和缺氧的三个菌种保藏条件，具有变异少、保存时间长、输送和储存方便等优点，是目前菌种保藏的较好方法之一，该法应用范围广，适合于大多数细菌、放线菌、病毒、噬菌体、立克次体、霉菌和酵母菌等，但不适合于霉菌的菌丝型、菇类、藻类和原虫等。冷冻干燥保藏法的操作流程见图11-2。将安瓿管洗净，再用2%的盐酸浸泡10h左右，用自来水冲洗干净，烘干，塞上棉塞，灭菌后备用。取培养成熟的新鲜斜面，加入适量已灭菌的脱脂牛奶，轻轻刮下菌体或孢子制成菌悬液，尽可能不带培养基。用灭菌过的长形滴管将菌悬液分装到安瓿管内，塞上棉塞，置于低温冰箱中预冻2h左右。第18页,共34页，2024年2月25日，星期天将安瓿管放入冷冻干燥机中抽真空4h左右。整个干燥过程，先是升华干燥，然后蒸发除去水分。干燥结束后，在真空下进行熔封（图11-3）。安瓿管密封后以高频电火花检查安瓿管的真空情况，管内呈灰蓝色逛表示已达真空。检查是电火花应射向安瓿的上半部，切勿直射样品。制成的安瓿管置于4℃冰箱或室温下保藏。第19页,共34页，2024年2月25日，星期天安瓿管菌种配制保护剂

酸洗、水洗培养分装

烘干制备菌悬液灭菌

灭菌分装安瓿管

预冻

真空干燥

装在歧管上抽真空

火焰上熔封安瓿管口

检测真空

保藏图11-2冷冻干燥保藏法的操作流程第20页,共34页，2024年2月25日，星期天由于在冷冻干燥过程中和保藏期间细胞容易损伤和死亡，所以需要加入保护剂。通常用脱脂牛奶做保护剂，其制备方法如下：取新鲜牛奶，离心去除脂肪，再装入已灭菌过的试管或三角瓶中，进行高压灭菌（常采用115℃灭菌15min）。脱脂牛奶也可用脱脂奶粉来制备，用蒸馏水制成10%或20%浓度后，分装灭菌。在冷冻干燥的过程中微生物细胞损伤的主要原因在于冰晶形成、盐浓度变化、细胞膜通透性变化和代谢作用损伤，冷冻干燥还可造成细胞内核酸的损伤而诱导突变体的产生。保护剂的作用是使细胞在冻干过程中免于死亡或损伤，并减少保藏过程中的死亡；作为支持物，和受体在复水过程中为干物质提供一定的股价结构，防止复水时引起的死亡，并使菌体容易从休眠状态恢复为生长状态。第21页,共34页，2024年2月25日，星期天在冷冻干燥过程中预冻的目的是使水分在真空干燥是直接由冰晶升华为水蒸气。预冻一定要彻底，否则，干燥过程中有一部分冰会融化而产生泡沫或氧化等副作用，或使干燥后不能形成易溶的多孔状菌块，而变成不易溶解的干膜状菌体。预冻的温度和时间很重要，预冻温度一般应在-30℃以下，在0～-10℃范围内冻结，所形成的冰晶颗粒较大，易造成细胞损伤；在-30℃下冻结，冰晶颗粒细小，对细胞损伤小。冷冻干燥法保藏的菌种，使用时可在无菌环境下开启安瓿管进行复水培养。可用锉刀在安瓿上部挫一道痕迹，再用烧热的玻棒置痕迹处，安瓿壁即出现裂纹。也可将安瓿上部置酒精灯上烧热，用冷的无菌水或培养基滴在痕迹处使其崩裂而打开安瓿管。将无菌的培养基注入安瓿管中，溶解干燥的样品酥丸，摇匀，用无菌吸管取出悬液并移入适宜的培养基中培养。第22页,共34页，2024年2月25日，星期天冷冻干燥法保藏菌种的存活率受到多方面的影响：不同的生物承受冷冻干燥处理过程的能力不同，所以少数菌种不适合用冷冻干燥法保藏；菌种的培养条件和菌龄也是影响因素，适宜条件下培养至稳定期的细胞和成熟的孢子具有较强的耐受冷冻干燥的能力；保护剂对存活率的影响很大，保护效果与保护剂的化学结构有密切的关系，有效的保护剂应对细胞和水有很强的亲和力，脱脂牛奶作为保护剂对多种微生物均有满意的结果；冻结速度慢会损坏细胞，而冻结速度过快（几秒钟内完成冻结）也会在细胞内形成冰晶，损害细胞膜，影响存活率；干燥样品中残留少量水分（0.9%～2.5%）对生物的生存有利；冻干管应避光保藏，尤其要避免直射光；适宜的恢复培养条件可以提高存活率。

第23页,共34页，2024年2月25日，星期天五、低温保藏法死亡保藏法是将孢子或菌丝悬于保护剂（甘油或牛奶）后，直接置于低温冰箱（-25℃以下）中保存。此法简便有效，对微生物损伤较小，适用于各种类型的微生物。其缺点是由于断电或机械故障可使菌种融化而死亡。实际应用时，常将待保藏菌种培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中，并使甘油的终浓度在10%～20%，再分装于小试管中，置低温冷冻保藏。基因工程菌也常采用该法保藏。第24页,共34页，2024年2月25日，星期天六、液氮超低温保藏法液氮超低温保藏法是以甘油或二甲亚砜为保护剂，将菌种直接放入液氮瓶中超低温（-196℃）保藏。此法是防止菌种退化的最好办法，适合于各种微生物的菌种保藏。由于微生物在-130℃以下新陈代谢处于停止，在此温度下，微生物处于休眠状态，可减少死亡或变异。因此，液氮超低温保藏法的保存时间长，死亡率低，变异少，活性稳定，甚至菌种不需再次分离，即可直接用于生产。液氮超低温保藏过程是将菌种悬浮液封存于圆底安瓿管或塑料的液氮保藏管（材料应能耐受较大温差骤然变化）内，放到-150～-196℃的液氮罐或液氮冰箱内保藏。在操作过程中的以大原则是“慢冻快溶”。第25页,共34页，2024年2月25日，星期天

细胞冷冻损伤注意是细胞内结冰和细胞脱水造成的物理伤害。当细胞冷冻时，细胞内外均会形成冰晶，其冻结的情况因冷冻的速度而异。冷冻速度缓慢时，只有细胞外形成冰晶，细胞内不结冰，此现象称为细胞外冻结。当冷冻速度较快时，细胞内外均形成冰晶，称为细胞内冻结。细胞缓慢冷冻时，主要发生细胞脱水现象。细胞大量脱水后电解质浓度升高，以致渗透压发生变化而导致细胞质壁分离。轻度的质壁分离损伤是可逆的，当脱水严重是，细胞内有的蛋白质、核酸等细胞成分的结冰水也被排出，发生永久性损伤，导致死亡。细胞内结冰，特别是大的冰晶，会造成细胞膜损伤而使细胞死亡。第26页,共34页，2024年2月25日，星期天

对于抗冻性强的微生物，细胞外冻结几乎不会使细胞受损伤，而对于多数细胞来说，不论细胞外或细胞内冻结均易受到损伤。为了减轻冷冻损伤程度，需要加入保护剂。液氮保藏一般选用渗透性强的保护剂。如甘油和二甲亚砜。它们能迅速透过细胞膜，吸住水分子，保护细胞不致大量失水，延迟或逆转细胞膜成分的变性并使冰点下降。通常将菌种悬浮在10%的甘油或10%二甲亚砜的保护剂中，孢子或菌体悬液的浓度应大于108个／mL。细胞的冻伤随细胞的表面积大小、细胞壁厚薄和细胞浓度而异，因而要根据所保藏的微生物种类来设计降温曲线。一般采用程序降温的方法，即由室温开始以每分钟下降1～7℃的速度降至-40℃，然后，再快速降至-150℃或-196℃。程序降温法可减轻细胞的冻伤程度。对一些细胞壁薄的微生物，特别是无细胞壁的原生质体，降温的速度影响很大。第27页,共34页，2024年2月25日，星期天微生物细胞的浓度对冷冻损伤程度也有影响。如去甲万古霉素生产用菌用液氮保藏时，孢子浓度大于107个／mL的存活率比105个／mL孢子浓度时高15倍以上。菌体的生长阶段对液氮保藏的效果也有影响。不同生理状态的微生物对冷冻损伤的抗性不同。一般来说，对数生长期的菌体对冷冻损伤的抗性低于稳定期的菌体。细胞解冻的速度对冷冻损伤的影响也很大。因为，缓慢解冻会使细胞内再生冰晶或冰晶的形态发生变化而损伤细胞，所以，一般采取快速解冻。在恢复培养时，将保藏管从液氮中取出后，立即放到37℃左右的水浴中解冻。液氮超低温保藏管应严格密封。若有液氮渗入管内，在从液氮容器中取出时，管中液氮的体积将膨胀680倍，具很强的爆炸力，必须特别小心。因为液氮容易渗透逃逸，所以，需要经常补充液氮。第28页,共34页，2024年2月25日，星期天

第三节菌种保藏机构

菌种是一个国家的重要生物资源，国际上许多国家都设立了专门的菌种保藏机构。菌种保藏机构的认为是广泛收集各种微生物菌种，并把它们妥善保藏，使之达到不死、不衰、不乱和便于交换使用的目的。国际上很多国家都设立菌种保藏机构。例如：中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM)，美国标准菌种保藏中心(ATCC)，美国的北部地区研究实验室(NRRL)，英国的国家典型菌种保藏所(NCTC)，日本的大阪发酵研究所(IFO)，东京大学应用微生物研究所(IAM)，荷兰的真菌中心收藏所(CBS)，法国的里昂巴斯德研究所(IPL)，及德国的科赫研究所(RKI)等。第29页,共34页，2024年2月25日，星期天中国微生物菌种保藏委员会成立于1979年，其认为是促进我国微生物菌种保藏的合作、协调与发展,以便更好地利用微生物资源,为我国的经济建设、科学研究和教育事业服务。该委员会下设六个菌种保藏管理中心,其负责单位、代号和菌种保藏的性质如下。①普通微生物菌种