miR-145-5p通过靶向MLK3调控角质形成细胞增殖及银屑病皮肤炎症反应

miR-145-5p通过靶向MLK3调控角质形成细胞增殖及银屑病皮肤炎症反应研究背景银屑病是T细胞介导的慢性炎症性皮肤病,具有遗传背景,其典型临床表现为鳞屑性丘疹、斑块。近年来银屑病的免疫学机制研究发现,Treg/Th17调控失衡导致的免疫微环境紊乱是其发病的主要原因,且与环境、感染及精神因素等密切相关。迄今,银屑病发病的始动诱因以及分子机制尚未完全明确。深入探讨银屑病发病的具体分子机制以及寻找与该病相关的分子靶标,对指导临床治疗具有重要理论意义。微小核糖核酸microRNA-145-5p(miR-145-5p)在免疫相关性疾病中的调控作用受到越来越多的关注,但是其是否参与调控银屑病的炎症反应过程尚不清楚。越来越多的研究证明microRNA(miRNA)异常表达参与银屑病的发生、发展。MiR-145-5p作为miRNA家族中重要的一员,与多种免疫相关性疾病的发生发展密切相关,包括类风湿关节炎(Rheumatoidarthritis,RA)、慢性肾小球肾炎(Chronicglomerulonephritis,CGN)以及神经炎症等。近年来研究发现,miR-145-5p可通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases,MAPK)及核因子-κB(nuclearfactor-κB,NF-κB)等信号通路参与调控细胞增殖及多种炎症因子的表达,包括IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α以及CXCL16等,在免疫相关性疾病的发生、发展中发挥重要作用。然而,miR-145-5p是否参与银屑病的发病尚不明确。我们前期进行miRNA芯片结果显示miR-145-5p在银屑病皮损组织中表达显著下调,提示在银屑病中miR-145-5p表达水平降低可能参与银屑病的发生、发展。我们通过生物信息学分析方法预测出混合谱系激酶3(Mixed-LineageKinase3,MLK3)是miR-145-5p的潜在靶基因之一。MLK3首先在人类胸腺组织中发现,其广泛表达于人体各组织中,是丝苏氨酸蛋白激酶家族中的一个成员,包含激酶结构域、中央亮氨酸拉链区结构域以及Src同源3结构域。MLK3作为一种MAP3K(Mitogen-activatedproteinKinaseKinaseKinase)蛋白激酶,可以激活下游MAP2K3/4/6/7(Mitogen-activatedproteinKinaseKinase3/4/6/7,MAP2K3/4/6/7,MKK3/4/6/7)等蛋白分子,并参与调控MAPK及NF-κB等信号通路,影响细胞增殖、凋亡、分化以及免疫反应过程。MLK3在调控MAPK及NF-κκB信号通路中发挥重要作用,参与对炎症反应的调控,与多种免疫相关性疾病的的发病密切相关,然而其是否参与调控银屑病皮肤炎症反应尚不明确。研究目的:1.明确miR-145-5p及MLK3在银屑病皮损组织表达情况并验证miR-145-5p与MLK3间是否存在靶向调控关系;2.研究miR-145-5p及MLK3对角质形成细胞增殖及炎症因子分泌的影响及其分子机制;3.明确miR-145-5p对银屑病表皮增生及皮肤炎症反应的调控作用及其作用机制。第一部分差异表达miRNAs的筛选和验证及miR-145-5p靶向调控MLK3的表达方法:(11)使用miRNA芯片ExiqonmiRCURYLNAmicroRNAarray,7thgeneration(miRBasev18,condensedProbe_IDversion,Exiqon,Vedbaek,Denmark)筛查银屑病皮损及健康对照(n=4),检测差异表达的miRNAs;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)实验(n=10)对miRNA芯片筛查出下调最显著的8个miRNAs及既往研究报道的3个miRNAs的表达水平进行验证;qRT-PCR实验以5.8SrRNA作为内参,实验结果以2-△△CT表示。(2)通过荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)实验检测银屑病皮损组织中miR-145-5p的表达水平。(3)运用生物信息学预测的方法(TargetScan,miRmap,miRandaandmiRTarbase)预测出MLK3可能为miR-145-5p靶向调控的基因,并通过双荧光素酶报告基因(Luciferasereporterassay)的方法进行验证。(4)通过qRT-PCR、免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)检测银屑病皮损区MLK3mRNA及蛋白的表达情况(n=10)。结果:(1)MiRNA芯片结果及验证:miRNA芯片筛查结果显示,银屑病皮损区差异表达的miRNAs(foldchange>2,P<0.05)共116条;通过qRT-PCR验证8个下调最显著的miRNAs及3个既往报道的miRNAs,结果显示miR-10b-5p(P<0.05)、miR-143-3p(P<0.001)、miR-145-5p(P<0.001)、miR-196b-5p(P<0.05)、miR-338-3p(P<0.05)表达在银屑病中显著下调,实验结果与芯片结果一致;miR-21-5p(P<0.001)miR-31-5p(P<0.001)miR-146a-5p(P<0.01)表达水平显著升高,与既往文献报道一致;miR-214-5p(P>0.05)、miR-3681-5p(P>0.05)、miR-4326(P>0.05)表达水平无统计学意义。(2)MiR-145-5p在银屑病皮损区表达降低:FISH检测结果显示,与正常对照相比,银屑病皮损区表皮组织miR-145-5p表达降低。(3)MiR-145-5p直接靶向调控MLK3:通过生物信息学预测的方法,运用TargetScan,miRmap,miRandaandmiRTarbase数据库预测出MLK3为miR-145-5p潜在靶基因;使用Luciferasereporterassay的方法进一步验证了miR-145-5p直接靶向调控MLK3的表达。(4)MLK3在银屑病患者皮损区高表达:qRT-PCR、免疫组化检测结果,发现与正常对照相比,银屑病皮损区MLK3在mRNA水平(P<0.01)及蛋白水平(P<0.001)表达均显著升高。结论通过miRNA芯片筛查,发现银屑病皮损中存在116个差异表达的miRNAs(foldchange>2,P<0.05);miR-145-5p在银屑病皮损组织中表达显著降低,MLK3在银屑病皮损组织中表达显著升高;miR-145-5p直接靶向调控MLK3的表达。第二部分miR-145-5p通过靶向MLK3调控角质形成细胞增殖、趋化因子分泌及相关机制的研究方法:(1)人正常角质形成细胞(normalhumanepidermalkeratinocytes,NHEKs)的分离、培养及传代。(2)MiR-145-5pmimic/Ctrl、、miR-145-5pinhibitor/Ctrl及MLK3siRNA转染。使用lipo2000转染miR-145-5pmimic/Ctrl(50nM)、miR-145-5pinhibitor/Ctrl(100nM),转染24h后使用qRT-PCR进行miR-145-5p过表达及干扰表达情况分析。转染miR-145-5pmimic/Ctrl(50nM)、miR-145-5pinhibitor/Ctrl(100nM)、siMLK3/Ctrl(60nM),然后使用qRT-PCR(转染24h)及Westernblot(转染48h)分析MLK3mRNA及蛋白表达情况。共转染miR-145-5pinhibitor/Ctrl(100nM)及siMLK3/Ctrl(60nM),分析siMLK3是否可以拮抗miR-145-5pinhibitor的生物学作用。(3)CCK-8(CCK-8proliferationassay)检测细胞增殖。使用lipo2000分别转染miR-145-5pmimic/Ctrl(50nM)、miR-145-5pinhibitor/Ctrl(100nM)及siMLK3/Ctrl(60nM),明确miR-145-5p及MLK3对NHEKs增殖的影响。共转染miR-145-5pinhibitor/Ctrl(1OOnM)及siMLK3/Ctrl(60nM),明确miR-145-5p对NHEKs增殖的影响是否通过MLK3介导。(4)液相多因子检测试剂盒(MagneticLuminex(?)Assays)检测不同处理后NHEKs趋化因子(CCL2、CCL7、CCL20、CXCL1、CXCL2、CXCL5、CXCL8及CXCL-10)分泌水平。使用lipo2000分别转染miR-145-5pmimic/Ctrl(50nM)、miR-145-5pinhibitor/Ctrl(1OOnM)及siMLK3/Ctrl(60nM),明确miR-145-5p及MLK3对NHEKs趋化因子分泌的影响。共转染miR-145-5pinhibitor/Ctrl(1OOnM)及siMLK3/Ctrl(60nM),明确miR-145-5p对NHEKs趋化因子分泌的影响是否通过MLK3介导。(5)使用Westernblot的方法检测miR-145-5p及MLK3对NF-κB及STAT3信号通路关键蛋白分子表达情况的影响,探讨miR-145-5p及MLK3在银屑病中发挥作用的相关分子机制。结果:(1)MiR-145-5p参与调控NHEKs增殖:CCK8检测结果显示,转染miR-145-5pmimic过表达miR-145-5p,可抑制NHEKs增殖;而转染miR-145-5pinhibitor可干扰miR-145-5p表达,促进NHEKs增殖。(2)MLK3参与调控NHEKs的增殖:CCK8检测结果显示,转染MLK3siRNA干扰MLK3的表达,从而抑制NHEKs的增殖。(3)MiR-145-5p参与调控IL-17A刺激后NHEKs趋化因子的分泌:液相多因子检测结果显示,过表达NHEKs中miR-145-5p可抑制IL-17A诱导的趋化因子分泌;而干扰NHEKs中miR-145-5p的表达可增加IL-17A诱导的趋化因子分泌。(4)MLK3参与调控IL-17A刺激后NHEKs趋化因子的分泌:MagneticLuminex(?)Assays液相多因子检测结果显示,干扰NHEKs中MLK3的表达可抑制IL-17A诱导的趋化因子分泌。(5)MiR-145-5p通过靶向MLK3调控NHEKs增殖:CCK8检测结果显示,siMLK3可以拮抗miR-145-5pinhibitor诱导的NHEKs增殖,提示miR-145-5p可通过靶向MLK3调控NHEKs增殖。(6)MiR-145-5p通过靶向MLK3调控NHEKs趋化因子的分泌:miR-145-5pinhibitor可通过抑制miR-145-5p的表达促进IL-17A诱导的趋化因子分泌水平,该作用可以被siMLK3拮抗,提示miR-145-5p低表达可通过MLK3促进NHEKs趋化因子分泌。(7)MiR-145-5p通过靶向MLK3调控NHEKsNF-κB及STAT3信号通路:miR-145-5p可直接靶向调控MLK3的表达,MLK3的表达水平与p-NF-KB及p-STAT3表达正相关,提示miR-145-5p可通过靶向MLK3调控NF-κB及STAT3信号通路。结论:MiR-145-5p参与调控NHEKs的增殖以及趋化因子的分泌,作用可能通过靶向调控MLK3实现;miR-145-5p通过靶向MLK3调控NF-κB及STAT3信号通路。第三部分MiR-145-5p通过调控表皮增生及皮肤炎症参与银屑病的发病方法:(1)使用8-10周C57雌性小鼠,背部剃毛后局部涂抹IMQ(62.5mg/d)×5d诱导银屑病样小鼠模型。并使用改良PASI评分量表、苏木精-伊红染色法(HE染色)等明确银屑病样小鼠模型是否构建成功。(2)通过表皮内多点注射agomiR-145-5p/Ctrl(1nom/d×3d)及antagomiR-145-5p/Ctrl(1nom/d×3d)过表达及干扰表皮内miR-145-5p的表达水平。(3)通过荧光原位杂交(FISH)技术,分析表皮内转染agomiR-145-5p(1nom/d×3d)及antagomiR-145-5p(1nom/d×3d)后过表达及干扰miR-145-5p表达情况。(4)使用qRT-PCR、Westernblot以及免疫组化等试验技术方法检测表皮内局部转染agomiR-145-5p/Ctrl(1nom/d×3d)以及antagomiR-145-5p/Ctrl(1nom/d×3d)后,小鼠皮肤组织miR-145-5p、MLK3、CCL2、CCL20以及IL-17A的表达情况。(5)通过皮肤组织HE染色以及改良PASI评分法分析agomiR-145-5p/Ctrl(1nom/d×3d)及antagomiR-145-5p/Ctrl(1nom/d×3d)对银屑病样小鼠模型表皮增生及小鼠皮肤炎症程度的影响。(6)通过免疫组化技术分析银屑病样小鼠模型背部皮肤表皮内局部转染agomiR-145-5p/Ctrl(1nom/d×3d)及antagomiR-145-5p/Ctrl(1nom/d×3d)对小鼠背部皮肤组织MLK3蛋白表达水平的影响,对Ki-67+细胞数量的影响,以及对CD3+T细胞及IL-17+Th17细胞趋化、募集的影响。结果:(1)外用IMQ(62.5mg/d)×5d成功诱导出银屑病样小鼠模型:皮损表现为小鼠背部出现典型的鳞屑性丘疹、斑块,严重者出现浸渍、裂隙;HE染色显示出典型的银屑病病理组织学改变:角化不全,颗粒层变薄或消失,棘层增生,呈杵状,真皮乳头层毛细血管迂曲、扩张,血管周围淋巴细胞浸润。(2)agomiR-145-5p及antagomiR-145-5p