食品中微生物数量的检测技术与指示菌类

关于食品中微生物数量的检测技术与指示菌类一、食品中的菌数检测技术及其新进展二、指示菌类三、其他菌类数量的检测方法第2页,共69页，2024年2月25日，星期天第一节食品中的菌数检测方法及其新进展一、显微镜直接计数法二、平皿菌落总数测定法三、最近似数测定法四、还原试验法五、其它方法第3页,共69页，2024年2月25日，星期天《中华人民共和国食品卫生法》第四条指出：“食品应当无毒、无害，符合应当有的营养要求，具有相应的色、香、味等感官性状”。这一条就明确地规定了食品的卫生要求。食品的卫生要求第4页,共69页，2024年2月25日，星期天检测食品中微生物数量的卫生学意义：可作为食品被微生物污染程度的标志（或食品清洁状态的标志）。预测食品贮存期限（保质期）。食品中细菌总数还能反映食品的新鲜程度、是否发生变质。第5页,共69页，2024年2月25日，星期天理想情况：

理想的检测方法是对所有食品都适用，并在短时间内获得准确结果。实际上：至今还没有一种通用的方法能准确测出食品中的实际活菌数，都有一定的误差、适用范围和优缺点。第6页,共69页，2024年2月25日，星期天一、显微镜直接计数法（DMC）1、直接涂片计数法（1）操作方法

将0.01mL经适当稀释的样品均匀涂布于载玻片上的1cm2面积的方格内，经干燥、固定、革兰氏染色后，用显微镜观察计数。在计数前先用物镜测微尺测出油镜视野的直径，再观察计算10~15个视野的细菌总数，求出平均数。r——显微镜油镜视野的半径（mm）B——稀释倍数第7页,共69页，2024年2月25日，星期天涂片：接种环，挑取菌落，生理盐水一滴，涂匀热固定：通过火焰若干次初染：结晶紫一滴，1min，水洗媒染：碘液一滴，1min，水洗脱色：95%乙醇，约30s复染：复红一滴，30s第8页,共69页，2024年2月25日，星期天第9页,共69页，2024年2月25日，星期天第10页,共69页，2024年2月25日，星期天第11页,共69页，2024年2月25日，星期天第12页,共69页，2024年2月25日，星期天第13页,共69页，2024年2月25日，星期天第14页,共69页，2024年2月25日，星期天（2）特点操作简便、快捷不能区分活菌与死菌，计数结果偏高，只适用于菌数较高的样品只适用于计数单细胞的微生物第15页,共69页，2024年2月25日，星期天2、血球计数板计数法将适当稀释的样品注入血球板的计数室中。由于计数室的容积是已知的（0.1mm3），计算一定微小体积内的菌数，即可计算出每克或每毫升样品中的菌数。第16页,共69页，2024年2月25日，星期天菌体细胞数（cfu/ml）=小格内平均菌体细胞数×400×104×稀释倍数第17页,共69页，2024年2月25日，星期天特点操作简便、快速，可在十分钟内得到结果。待测标本未经火焰固定杀死细胞，故所测结果为活菌数。此法适用于计数单细胞的酵母菌。第18页,共69页，2024年2月25日，星期天二、平皿菌落总数测定法（SPC）平皿菌落总数测定法是最常用的一种活菌计数法，也是我国卫生标准规定的公认可行的方法，因此又称标准平皿活菌计数法。第19页,共69页，2024年2月25日，星期天菌落总数：食品检样经过处理，在一定条件下（如培基基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。只包括一群在平板技术琼脂上生长发育的嗜中温需氧或兼性厌氧菌的菌落总数。菌落总数不等于细菌总数。CFU：菌落形成单位第20页,共69页，2024年2月25日，星期天国标（GB）规定：在需氧条件下：细菌：PCA36±1℃48h霉菌、酵母：PDA或孟加拉红培养基

28±1℃5d

第21页,共69页，2024年2月25日，星期天酵母菌、霉菌在孟加拉红培养基上典型特征第22页,共69页，2024年2月25日，星期天菌落总数的测定

－－平板菌落计数法程序菌落计数选择2～3个适当稀释度悬液各1ml，加入无菌空培养皿内，每个稀释度做2～3个培养皿用生理盐水进行无菌稀释，做成几个适当稀释倍数的悬液每个培养皿中倾注约15ml熔化并冷却到46℃左右的平板计数琼脂培养基，冷却后，于37℃培养48h被检样品报告结果第23页,共69页，2024年2月25日，星期天（一）样品采集1、采样原则：

确定性、随机性、代表性、无菌操作、原始性2、采样方法：无菌操作，分类操作有包装食品应采用完整的未开封的样品粉末状样品边混合边取样液体样品振摇均匀取样冷冻样品保持冷冻状态非冷冻样品保存在0~5℃第24页,共69页，2024年2月25日，星期天3、采样数量和部位：（1）即食类预包装食品：取相同批次最小零售原包装（2）非即食类预包装食品：<500g或500mL取相同批次最小零售原包装>500mL液态食品混匀后，从相同批次的不同容器中取≥5倍检验单位样品>500g固体食品从同一包装的不同部位分别取样（3）散装或现场制作食品根据食品不同类别和性质，取≥5倍检验单位样品第25页,共69页，2024年2月25日，星期天4、采样标记：及时、准确、清晰填写采样单（包括采样人、采样地点、时间、样品名称、来源、批号、数量、保存条件等信息）。5、采样的贮存和运输：应在接近原温条件下尽快送检，并保持样品完整。如不能及时运送，应在接近原温条件下贮存。第26页,共69页，2024年2月25日，星期天代表单位（章）代表单位（章）签字签字日期年月日日期年月日×××××采样单第27页,共69页，2024年2月25日，星期天（二）送检认真核对登记样品信息应按要求尽快检验。如不能及时检验，应采取必要措施保持样品原有状态冷冻食品45℃以下不超过15分钟，或2~5℃不超过18h解冻后检验不得加入防腐剂保存第28页,共69页，2024年2月25日，星期天（三）样品的处理和稀释1）取样无菌操作25g（mL）放入225mL无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液中（1:10稀释液）2）均匀混合无菌均质杯8000~10000r/min均质1~2min，或用拍击式均质器拍打1~2min第29页,共69页，2024年2月25日，星期天第30页,共69页，2024年2月25日，星期天3）稀释第31页,共69页，2024年2月25日，星期天4）倾注平板稀释液移入平皿后，将46℃

左右的平板计数琼脂培养基注入平皿约15ml，转动平皿。第32页,共69页，2024年2月25日，星期天第33页,共69页，2024年2月25日，星期天第34页,共69页，2024年2月25日，星期天5）倒置培养琼脂凝固后，翻转平板细菌：一般食品36±1℃48h水产品30±1℃72h霉菌：28±1℃5d第35页,共69页，2024年2月25日，星期天（四）菌落计数法肉眼观察（直接、放大镜）利用自动影像分析菌落计数仪第36页,共69页，2024年2月25日，星期天10-1均数10-2均数描述最终结果25536均在30~300间则按计数公式2.6×103多不可计345各平板均>300，取稀释度最高者报告，余计为多不可数3.5×104122均小于30则取稀释度最低者报告1.2×10233029所有平板均不在30~300CFU且一部分<30或>300者以最接近30或300者报告2.9×10300所有平板均无菌落则记为<

1乘以最低稀释倍数报告<1×10即<

10结果表述第37页,共69页，2024年2月25日，星期天（五）菌落计数的报告报告单位：cfu/g(mL)1、平板菌落数的选择：

30~300cfu2、菌落数的计算：3、菌落数的报告：低于30时按实数报告100cfu以内时按四舍五入修约，采用两位有效数字报告≥100时第三位数四舍五入修约，取前两位数字例：205043→210000or2.1×105第38页,共69页，2024年2月25日，星期天先倒平板，待其凝固后，吸取0.1ml稀释液于平板表面上，用无菌玻璃刮铲在整个平板上均匀涂布，培养观察。涂布平板法第39页,共69页，2024年2月25日，星期天第40页,共69页，2024年2月25日，星期天涂布法的优缺点可检测到热敏性菌株菌落形态比较明显更适合于严格的好氧菌没有倾注法简便，易造成机械损伤第41页,共69页，2024年2月25日，星期天三、最近似数测定法

（mostprobablenumberMPN）对未知样品做连续的10倍稀释，选择3个连续的10倍稀释液，每种稀释液接种3管（5管）装有培养基的试管中培养，根据实验结果查MPN检索表，得到样品中微生物的数量。第42页,共69页，2024年2月25日，星期天第43页,共69页，2024年2月25日，星期天根据经确证后的对应浓度阳性管数查MPN表MPN：最可能数，基于泊松分布的一种间接计数方法阳性管数MPN95%可信限0.100.010.001下限上限000<3.0-9.50013.00.159.61003.60.1718333>1100420-第44页,共69页，2024年2月25日，星期天第45页,共69页，2024年2月25日，星期天MPN的优点：操作简便与SPC相比，相似率较高采用选择性培养基可检测特殊微生物菌群特别适用于检测食品内含菌量较少的样品第46页,共69页，2024年2月25日，星期天MPN的缺点：需要大量的玻璃器皿不能观察微生物菌落形态要注意严格的无菌操作第47页,共69页，2024年2月25日，星期天食品冷饮大肠菌群检验纸片

冷饮、乳制品和调味品等大肠菌群的测定第48页,共69页，2024年2月25日，星期天餐具大肠菌快速检验纸片

餐具卫生消毒效果检测第49页,共69页，2024年2月25日，星期天四、还原试验法一种估计活性微生物数量的方法原理：

微生物细胞在进行生物代谢的氧化还原过程中，有的被氧化，有的被还原，测定还原能力即可推测样品内的菌数。

某些指示剂和色素可反映这个变化，这些成分的还原时间同细菌数量成反比。第50页,共69页，2024年2月25日，星期天三种染料：美蓝：美蓝（蓝色）无色刃天青：刃天青（蓝色）粉红色或无色红四氮唑（TTC）：红四氮唑（无色）粉色或红色第51页,共69页，2024年2月25日，星期天美蓝还原试验表美蓝褪色时间估计每毫升样品中的细菌总数鲜乳的质量20min内20000000以上很差20min至2h4000000~20000000差~较差2h至5.5h500000~4000000一般~较好~好5.5h以上500000以下很好美蓝：美蓝（蓝色）无色第52页,共69页，2024年2月25日，星期天韧天青还原试验表级别鲜乳的质量乳的颜色相当于每毫升牛乳中的细菌总数经20min经60min1良好青蓝色青蓝色小于50万2合格青蓝色蓝紫色50~400万3不好青蓝色或粉蓝色粉红色400~2000万4很坏白色白色大于2000万刃天青：刃天青（蓝色）粉红色或无色第53页,共69页，2024年2月25日，星期天显色状态判断标准显色状态判断显色状态判断未显色者阳性微红色者可疑桃红色-红色阴性红四氮唑（TTC）：红四氮唑（无色）粉色或红色第54页,共69页，2024年2月25日，星期天应用及优、缺点：应用：乳品工业上原料乳中的微生物检测优点：简便、快捷、经济缺点：所得结果不够准确不适用于含有还原性酶的食品第55页,共69页，2024年2月25日，星期天五、浊度测量法原理利用浊度计或分光光度计测定培养液中微生物的生长量。当某一波长的光线通过混浊的液体后，光的强度被减弱。因为菌体不透光，在一定浓度范围内，悬液中单细胞的数量与光密度（OD值）成正比。第56页,共69页，2024年2月25日，星期天当细菌浓度达到107个/ml时，培养基会浑浊第57页,共69页，2024年2月25日，星期天优点：样品数量较多时，此法与SPC方法相比省时省力。缺点：若样品颜色较深或含有固体颗粒时，不宜采用。第58页,共69页，2024年2月25日，星期天菌数测定方法直接法间接法显微镜直接计数法平板菌落总数测定法还原试验法最近似数测定法浊度测量法ATP生物发光法试验测定法电阻抗测量法放射测量法但至今没有一种常用的方法能准确测出食品中的实际活菌数，也没有一种方法对所有的食品都适用。第59页,共69页，2024年2月25日，星期天第二节指示菌类

一般情况下，若要直接检查食品中的病原菌困难较大实践中，常用某些指示菌类的办法来评定食品的卫生质量第60页,共69页，2024年2月25日，星期天表明食品被粪便污染和病原菌存在的指示菌应具备的特征：指示菌必须与肠道致病菌密切相关；指示菌对不良因素的抵抗力与病原菌大致相同；指示菌与病原菌繁殖速度大致相同；培养、分离、鉴定方法简便，容易检验第61页,共69页，2024年2月25日，星期天1、大肠菌群（coliforms）卫生细菌领域用语与粪便污染有关的细菌定义：

一群在一定培养条件下可发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。第62页,共69页，2024年2月25日，星期天典型大肠杆菌为粪便近期污染的标志其它菌属则为粪便陈旧污染的标志ETECEIEC阴沟肠杆菌EHEC大肠菌群耐热大肠菌群（粪大肠菌群）大肠杆菌产气克雷白氏菌大肠埃希氏菌柠檬酸杆菌O157：H7第63页,共69页，2024年2月25日，星期天2、大肠菌群的食品卫生学意义作为食品被粪便污染的指示菌

MPN值愈低则说明食品受粪便污染程度及对人体健康危害程度愈