SNT 1695-2006马焦虫病微量补体结合试验操作规程

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准马焦虫病微量补体结合试验操作规程2006-01-26发布2006-08-16实施国家质量监督检验检疫总局I本标准主要依据OIE《诊断试剂和疫苗标准手册》(2004)第五版第2.5.6章制定。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。11范围本标准规定了马焦虫病微量补体结合试验的操作方法。-本标准适用于马属动物马焦虫病的血清学诊断。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3试剂和材料3.1.1试验用蒸馏水为GB/T6682中的三级水。3.1.2稀释液：巴比妥级冲液(见第A.2章)。3.2被检血清3.2.1采血和分离血清3.2.2运送和保存血清血清采用冷藏运送。若3d内不能送到实验室，用冷冻方法运送。3.3.1玻璃试管：10mm×75mm.圆底洁净反应管。3.3.3微量移液器。3.3.4可调连续加样器。3.3.596孔“U”型微量板。4操作方法4.1预备试验4.1.13%红细胞悬液的制备4.1.1.1绵羊全血充分混匀后，取所需量用稀释液洗三次，每次2000r/24.1.1.5用酶标仪于540nm波长下读光密度值(OD值),算出平均OD值，代入校正红细胞浓度公稀释液加入量=平均OD值×红细胞悬液量/0.115一红细胞悬液量 (1)4.1.1.6取校正红细胞浓度时所需的稀释液量加入到红细胞悬液中即得3%红细胞悬液。4.1.2溶血素效价的测定4.1.2.1稀释溶血素取0.2mL溶血素原液，加入到19.8mL生理盐水中，制成1:100倍稀释的溶血素，再按表1稀释成不同稀释倍数的溶血素。稀释倍数溶血素量溶血素1.0溶血素2.0溶血素0.5溶血素0.5溶血素1.0溶血素1.0溶血素1.0巴比妥缓冲液4.04.04.1.2.2制备不同稀释倍数的溶血素致敏红细胞取7个试管，每管加1.5mL3%的红细胞悬液，然后分别缓慢加入不同稀释倍数的溶血素1.5mL,4.1.2.3溶血素效价的确定将补体原液预稀释至1:150,按表2于96孔“U”型微量板上测定溶血素效价。表2溶血素效价测定单位为微升孔号1234567稀释液不同稀释倍数致敏红细胞溶血素稀释倍数感作37℃水浴振荡30min(每隔5min振荡1次，下同)2000r/min水平离心3min,取上清液100μL分别注人另一96孔“U”型微量反应板中，与标准比色孔比较，确定出现100%溶血时溶血素的最高稀释倍数为其效价，即此时溶血素的浓度为该反应体系下的1个标准单位，正式试验时溶血素的工作浓度为2个标准单位。4.1.3制备致敏红细胞悬液按测定的溶血素效价稀释溶血素，缓慢加入到等量的3%绵羊红细胞悬液中，混合均匀，置37℃水浴箱中感作15min。4.1.4补体效价的测定补体预稀释至1:150,做2组重复，按表3在96孔“U”型微量板上进行测定。3表3补体效价测定单位为微升孔号123456稀释液第一次感作37℃水浴振荡30min致敏红细胞第二次感作37℃水浴振荡30min2000r/min水平离心3min,取上清液100μL分别转移入另一96孔“U”型微量板中，于540nm度为此反应体系下1个补体标准单位。正式试验补体工作浓度为2个标准单位。4.1.5抗原效价的测定4.1.5.1新购抗原可按说明书稀释使用。a)标准阳性血清和标准阴性血清分别用稀释液作1:5稀释，置58℃水浴箱中灭能30min。c)将抗原按1:10作倍比稀释(见附录B)。d)建立方阵试验，用96孔“U”型微量板按附录B进行。e)取出微量反应板，2000r/min水平离心3min,与标准比色孔(比色孔的配制见附录C)比较，4.2.1灭能将标准阳性血清、阴性血清和被检血清置58℃水浴箱内灭能30min;驴、骡血清于62℃灭能30min。4.2.2试剂及血清稀释4.2.2.1试剂的稀释4.2.2.2血清的稀释4.2.3.1基本操作程序4.2.3.2定性试验加样法每个已稀释的样品加3个孔，第一孔不加抗原，加等量稀释液代替，作为抗补体对照。4.2.3.3血清效价测定加样法4出微量反应板，2000r/min水平离心1min,比照标准比色孔，记录结果。表4血清效价的测定单位为微升孔号血清试验孔血清抗补体对照抗原对照补体对照.红细胞对照2个补体单位1个补体单位0个补体单位***·血清***-———--—抗原—-——稀释液——#****补体**0第一次感作37℃水浴振荡感作40min致敏红细胞第二次感作37℃水浴振荡感作30min5.1被检血清效价的确定比照标准比色孔判读，达到50%抑制溶血时血清的最高稀释度为该血清的效价。1个单位补体对照：50%溶血。抗原对照：100%溶血。血清抗补体对照：抗补体对照孔应为100%溶血。如果抗补体对照孔与试验孔的抑制溶血程度相被检血清1:5倍稀释，抑制溶血大于等于50%判为阳性；小于50%判为可疑；完全不溶或痕量溶5(规范性附录)A.1阿氏液(Alsever’s)的制备无水柠檬酸钠8.00g葡萄糖20.5g蒸馏水至1.000mL5,5二乙基巴比妥钠氯化钠六水合氯化镁氯化钙蒸馏水 却后加入1000mL盐溶液中，最后用蒸馏水补至2000mL,混匀，0.104MPa～0.112MPa灭菌20min,分装储存于4℃备用。用法：用前将所配液体用蒸馏水作1:5稀释，调pH值至7.4。6(规范性附录)抗原效价测定表表B.1方阵试验单位为微升孔号抗原稀释度血清对照抗原对照补体对照红细胞对照抗原———阳性血清———-——————-补体工作效价稀释液————第一次感作37℃振荡感作40min致敏红细胞第二次感作37℃振荡感作30min注：抗原对照、补体对照、血清对照为100%溶血，且红细胞对照不溶血，试验成立。抗原与阳性血清各稀释度发生抑制溶血最强的抗原最高稀释度为抗原效价，其含址为1个单位，(规范性附录)标准比色孔的制备取3%绵羊红细胞3.0mL,加入到9.6mL蒸馏水中，充分破解，再加入4.25%氯化钠2