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文档简介

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准鸡马立克氏病病毒分离与鉴定方法国家质量监督检验检疫总局I本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中华人民共和国陕西出入境检验检疫局和山东出入境检验检疫局负责起草。11范围磷酸盐缓冲液(PBS);含0.05%吐温-20的PBS。以上溶液配制方法见附录B。2.8标准MDV:MDVI型病毒GA毒株。挑选临床发病的MD疑似病鸡，无菌采集枸分层液，200g离心5min,分离收集淋巴细胞，并用无菌PBS洗涤两次，用细胞维持液稀释成107个/mL淋巴细胞的细胞悬浮液直接使用或者加入15%的二甲基亚砜后保存在液氮(一196℃)中备用。取生长良好的DEF单层，弃去维持液，接种0.2mL处理好在空白细胞对照瓶的细胞生长良好的前提下，将产生广泛CPE(蚀斑形成面积占30%以上)的DEF将收集的具有广泛CPE的细胞悬浮液进行稀释，接种于96孔细胞培养板，使每孔平均含有1个细同法重复克隆二至三次。所收集的培养物就是供鉴定用的MDV分离物。25.1电镜观察5.2蚀斑测定次(每次5min),再滴加MDV分型单克隆抗体，放入37℃的水浴中作用90min～120min,用PBS冲洗三次(每次5min),滴加抗鼠免疫荧光抗体，在37℃水浴中作用30min,用含0.05%吐温-20的PBS冲用2000个蚀斑形成单位(PFU)的MDV分离物和2000个PFU的GA标准强毒株分别接种一日龄易感鸡20只～25只，同时设立相同数日的易感鸡对照组。分别隔离饲养10周，观察记录死亡情况，6.1MDV在电子显微镜下表现为近似圆形或者六角形的病毒颗粒或者核衣壳，多数出现在感染的细6.2MDV病毒可以在DEF或者CEF单层上产生蚀斑，蚀斑大小一般在1mm之内。血清I型产生3(规范性附录)A.1将SPF鸭种蛋孵化至12d～14d(SPF种鸡蛋孵化至9d～10d)。A.4通过双层消毒纱布过滤细胞悬浮液，将滤液收集于灭菌离心管，以1000r/m试剂的制备B.1.1Hanks平衡盐溶液的配制B.2细胞生长液的配制5%水解乳蛋白溶液10.0mLHanks平衡盐溶液9.5mL犊牛血清5.0mL青霉素1.0mL碳酸氢钠[NaHCO₃(7.5%)]1.0mLB.3细胞维持液的配制方法同细胞生长液的配制，只需将犊牛血清含量调整为1mL～2mL即可。B.4.1所需试剂的准备氯化钠(NaCl)氯化钙(CaCl₂·2H₂O)氯化镁(MgCl₂·2H₂O)0.132g双蒸水双蒸水B.4.5分装于500mL～1000mL灭菌瓶中，经无菌检验后贮存于4℃下备用。B.5含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液的配制B.5.1按照PBS配制方法，去掉其中的氯化钙(CaCl₂·2H₂O)

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