分子生物学第4章：翻译

翻译

比DNA复制和转录更为复杂的过程氨基酸活化与转运----这个过程是在氨基酸活化酶和镁离子作用下把氨基酸激活成为活化氨基酸。起始----核糖体与mRNA结合并与氨酰基tRNA生成起始复合物。延伸----由于核糖体沿mRNA5’端向3’端移动，开始了从N端向C端的多肽合成，这是蛋白质合成过程中速度最快的阶段。终止以及肽链的释放，核糖体从mRNA上解离，准备新一轮合成反应。

mRNA蛋白质合成的模板蛋白合成的三种RNAtRNA氨基酸的运输工具

rRNA蛋白质合成的场所

参与蛋白合成的RNA1.密码子与反密码子遗传密码贮存在DNA上的遗传信息通过mRNA传递给蛋白质，mRNA与蛋白质之间的联系是通过遗传密码的破译来实现的。mRNA上每3个核苷酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸，这3个核苷酸就称为密码，也叫三联子密码。

tRNA的识别只与反密码子有关，而与tRNA上携带的氨基酸无关。Chapeville和Lipmann的试验：将放射性同位素标记的半胱氨酸在半胱氨酰－tRNA合成酶催化下与tRNAcys形成半胱氨酰tRNAcys。然后用活性镍作催化剂，使半胱氨酸转变成丙氨酸，形成丙氨酰tRNAcys，然后将它放到网织红细胞无细胞体系中进行蛋白质合成，结果发现，丙氨酸插入到原半胱氨酸的位置中了。密码子的性质

简并性：由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象。

18种氨基酸都有一个以上的密码子

只有精氨酸是个例外，因为在真核生物中CG双联子出现的频率较低，所以尽管有4个密码子同时编码，蛋白质中精氨酸的使用率仍不高。密码子使用偏爱性

几乎在所用的简并密码子家族中，都有一个或者两个是优先使用的偏爱密码子；有一些密码子在各种不同基因中（不管其编码的蛋白质的丰度如何）都是最常用的，例如CCG便是编码Pro的4种同义密码子中优先使用的密码子；高表达活性的基因往往比低表达活性的基因呈现高程度的密码子偏爱性；简并密码子的使用频率通常反映着它们相应的tRNA的丰度。

密码子使用偏爱性的原因

同工tRNA在细胞中有丰度差异，使用频率高的密码子由丰度高的相应tRNA负责译码，反之亦然；

在某些物种中，密码子的偏爱性与以嘧啶碱基（C和U）结尾的密码子之间的非随机选择有关。

密码子使用偏爱性对基因表达效率的影响：由于物种使用密码子的偏爱性不同，使得那些使用大肠杆菌罕用密码子的真核基因很难在大肠杆菌中有效表达，正是外源基因不同类型密码子的使用频率，使蛋白质的表达水平在质和量两个方面都受到影响。

密码子的通用性与特殊性

遗传密码不管在体内还是体外，不管是对病毒、细菌、动物还是植物都是适用的，大量事实证明生命世界从低等到高等，都使用几乎完全相同的一套密码，这是密码子的普遍性和通用性。

特殊性在支原体中，终止密码子UGA被用来编码色氨酸，在嗜热四膜虫中，另一个终止密码子UAA被用来编码谷氨酰胺。对人、牛及酵母线粒体DNA序列和结构的研究还发现，在线粒体中也有不少例外情况。

线粒体与核DNA密码子使用情况的比较

密码子和反密码子的相互作用：在蛋白质生物合成过程中，tRNA的反密码子在核糖体内是通过碱基的反向配对与mRNA的密码子相互作用的。1966年，Crick根据立体化学原理提出摆动假说(wobblehypothesis)，解释了反密码子中某些稀有成分(如I)的配对，以及许多氨基酸有2个以上密码子的问题。

摇摆假说（Wobblehypothesis）1.

任意一个密码子的前两位碱基都与tRNA反密码子中的相应碱基形成Watson-Crick碱基配对。2.

反密码子第一位是A或C时，只能识别一个密码子。当反密码子第一位是U或G时，能识别两个密码子。当Inosine（I）作为反密码子第一位时，能识别三个密码子。3.

如果数个密码子同时编码一个氨基酸，凡是第一、二位碱基不相同的密码子都对应于各自的tRNA。4.根据上述规则，至少需要32种不同的tRNA才能翻译61个密码子。

在目前已知一级结构的200多个tRNA中，反密码子第一位为C、G、U、I者都符合摆动假说。对某些密码子来说，反密码子的第一个碱基可识别4种密码子，表明3对碱基中的第三对是无关紧要的，这就是所谓“三中配二”原则。

密码子使用规律：

原核生物中大部分以AUG为起始密码子，少数使用GUG，真核生物则全部使用AUG为起始密码子，而终止密码子UAA、UAG、UGA全部被使用，有时连用两个密码子，以便更保险地终止肽链合成。在哺乳动物中，对同义密码子的使用差异甚大，有的广泛使用，有些则有所偏爱。在大肠杆菌中，以C、U为结尾的同义密码，若前两个碱基为A、U，则第三位碱基优先使用C而不是U，若前两个碱基为C、G，则优先使用U。

氨基酸的运输工具“中介作用”携带氨基酸反密码子与mRNA的密码子作用2.

tRNA由不超过100个核苷酸组成，稀有碱基和修饰碱基二级结构是三叶草型，含有4个双链的茎和4个单链的环。5‘端和3’端的碱基通过形成7个waston-Crick碱基配对将两端拉在一起，形成受体臂。氨基酸通过与3端的核糖连接形成氨酰－tRNA分子。三叶草型的二级结构可折叠成L－型的三级结构。L型结构由两个螺旋以直角的方位构成，结合氨基酸的一端称为接受臂,另一端含有反密码子，称为反密码子臂。与多肽合成有关的位点有：

1）氨基酸接受位点－－3‘端CCA。

2）识别氨酰－tRNA合成酶的位点。

3）识别核糖体的位点。

4）识别mRNA的位点－－反密码子臂。tRNA转运活化的氨基酸至mRNA模板上tRNAsecondarystructureDloopTloopAnticodonloop15:invariant8:RorYxtRNAtertiarystructuretRNAtertiarystructuretRNAtertiarystructure●

tRNA的”L”三维结构与功能“L”结构域的功能---aaacceptarm位于“L”的一端，契合于核糖体的P位点和A位点,以利肽键的形成---anti-codonarm位于”L”另一端，与结合在核糖体小亚基上的codonofmRNA配对A

P---“L”结构中碱基堆积力大使其拓扑结构趋于稳定

wobblebase

位于“L”结构末端堆积力小自由度大使碱基配对摇摆---TΨCloop&DHUloop

位于“L”两臂的交界处，利于“L”结构的稳定tRNA种类起始tRNA和延伸tRNA同工tRNA校正tRNAAA-tRNA合成酶●

副密码子---由若干Nt组成，存在于tRNA不定位置上---与AARS侧链基团的分子发生特异的“契合”---成为tRNA准确负载氨基酸的机制之一1）氨酰－tRNA合成酶帮助使氨基酸结合到特定的tRNA上，氨酰－tRNA合成酶参与氨基酸与tRNA结合的二步反应。a、氨基酸＋ATP

氨酰－AMP＋Ppi（活化）b、氨酰－AMP＋tRNA氨酰－tRNA＋AMP氨酰－tRNA合成酶催化的反应是可逆的，其作用在于：

a、氨基酸与tRNA分子的结合使得氨基酸本身被活化，利于下一步肽健形成的反应。

b、tRNA可以携带氨基酸到mRNA的特定部位，使氨基酸能够被掺入到多肽链的合适位置。(反应的专一性）2）每一个氨酰－tRNA合成酶可以识别一个特定的氨基酸和与此氨基酸对应的tRNA的特定部位。酶与底物的选择性主要由氢健来决定的。

例子：酪氨酰－tRNA合成酶与反应中间物酪氨酰－腺苷复合物的晶体结构解析模型。反应中间物结合在酶分子的一个深沟里，二者之间形成11个氢键。6个氢键涉及AMP部分，5个涉及酪氨酰部分。

3）氨酰－tRNA合成酶能够纠正酰化的错误氨酰－tRNA合成有校正某些错误的功能，可以水解非正确组合的氨基酸和tRNA之间形成的共价联系。通过氨酰化部位以及校正部位的共同作用，可使翻译过程的错误频率小于万分之一。

COO－

COO－H3N+CHH3N+CHCHH3CCH

H3CCH3CH2

缬氨酸（Val.V）CH3

异亮氨酸

（Ile.I）

异亮氨酰tRNA合成酶缬氨酰－tRNAILe

+H2O

缬氨酸＋tRNAILe3.rRNA与核糖体

rRNAhaveGCcontentof60%

unusuallyrepetitive,dependingontheorganism,eachcellcontainsfromseveralhundredtoover20,000copiesofrDNAgene

rRNAsynthesizedinnucleolusandwasstimulatedbylowionicstrength&Mg+2

butotherRNAsynthesizedinniucleolpasmandstimulatedbyhighionicstrength&Mn+2

核糖体是蛋白质的合成工厂

核糖体的一些基本特性是一个巨大的核糖核蛋白体。由rRNA和蛋白质组成。原核中以游离核糖体形成或与mRNA结合形成串状的多核糖体的形式，每个细胞约有20000多个。真核中一般与细胞内质网相结合。形成粗面内质网，每个细胞中含有的数目为106～107。核糖体由两个亚基组成，一大一小，其结构组成如表所示。

rRNA在形成核糖体的结构与功能起着重要作用。其结构特点是有许多双螺旋区。核糖体的结构模型核糖体上必须至少有5个以上的活性中心1）mRNA结受部位（在小亚基上）。2）结合或接受AA－tRNA部位（A位）（在大亚基上）。3）结合或接受肽基tRNA的部位。4）肽基转移部位（P位）（在大亚基上）。5）肽健形成部位（转肽酶中心）等。4.肽链的合成起始—延长—终止的过程肽链合成的方向多肽链的合成是从N端走向C端，合成速度极快，大肠杆菌中，一个核糖体每秒钟可延伸20个氨基酸。mRNA上信息阅读的方向是5‘-----3’inProk.

f

Met—tRNAf

met

&

Met--tRNAmetmAminoacyl—tRNAaainEuk.Met—tRNAI

met

&

Met--tRNA

mete

翻译的起始(细菌)30S小亚基模板mRNAfMet-tRNAfMet起始因子（IF）GTP50S大亚基Mg2＋翻译起始分为3步30S亚基与IF-1、IF-3结合，通过SD序列与mRNA模板结合在IF-2和GTP帮助下，fMet-tRNAfMet进入小亚基P位点，反密码子与起始密码子配对与50S大亚基结合，GTP水解，释放IF翻译开始于mRNA与核糖体的结合蛋白质合成中翻译的开始需要在mRNA上选择合适位置的起始密码AUG，这一过程是通过核糖体小亚基与mRNA的结合。SD序列原核生物的mRNA中核糖体的结合位点，即AUG起始密码子之前的多聚嘌呤序列AGGAGGU的部分或者全部，与16SrRNA的3‘末端互补。Shine-DelgarnoelementSD序列的重要性细菌毒素colecinE3可通过核酸酶的活性特异的在16SrRNA3’端切下50个碱基左右的片段，使得核糖体小亚基中的16SrRNA失去了与mRNA上SD序列互补的可能，由此抑制了细菌蛋白质的合成。由于原核和真核生物在合成蛋白质机制上的差异，colecinE3不影响真核生物的蛋白质合成。

真核与原核在合成上的共同点：（1）核糖体小亚基结合起始tRNA（2）mRNA上必须有合适的起始密码子（3）大亚基必须与已经形成复合物的小亚基，起始tRNA、mRNA结合。

起始还需要非核糖体蛋白的起始因子（initationfactorIF）的参与。当AUG(或GUG)密码子位于核糖体P位点时，起始才能有效进行，因为只有这时tRNA才能进入小亚基和mRNA结合所产生的P位点。

当与起始密码子紧邻的密码子被其氨酰－tRNA上的反密码子识别并结合后，延长反应就开始了。在氨基酸的掺入过程中的三步反应：进位－转位－移位进位反应：主要是密码子与反密码子的识别转位反应：涉及肽键的形成移位反应：tRNA和mRNA相对核糖体的移动具体过程见教材和flash动画

肽链延伸核糖体反应中GTP的作用

每掺入一个氨基酸的延长过程中，都有二个GTP分子发生水解，GTP的结合和水解发生在EF-Tu和EF-G上。随着GTP变成GDP，引起这些因子构象变化，而从核糖体上解离。翻译的终止需要释放因子和终止密码子的参加

1、合成好的肽酰－

tRNA的C端通终止涉及到二方面的解离过程过氨基酸酯键，从tRNA上的解离

2、mRNA与核糖体的解离

第一过程：需要终止密码子和释放因子（releasefactors,RFs）第二过程：需要核糖体释放因子（ribosomereleasingfactor,RRF）细菌含3种不同的RFRF-1识别UAA和UAG.RF-2识别UAA和UGA.RF-3不识别终止密码子，但能刺激另外二个因子的活性.

真核系统中只有一种释放因子----RF可识别3种终止密码子。

释放因子的作用机理

细胞通常无识别终止密码子的tRNA，这种识别与RF来完成。RF的功能是识别的mRNA上终止密码子，终止肽链的合成并释放核糖体。其机理是改变大亚基上的肽酰转移酶的专一性，使肽酰转移酶活性变成酯酶活性。它能结合水用于亲核攻击，水解肽键。多顺反子mRNA的翻译

大多数情况下，核糖体独立地结合在一个顺反子的起始位点。第一个顺反子翻译完成后，核糖体解离，离开mRNA，然后新的30S亚基结合在第二个顺反子的起始位点，再结合50S亚基，开始第二个顺反子的翻译。若顺反子之间的距离很短的话，30S亚基或短暂地解离，或在终止和重新起始过程中仍旧留在mRNA分子上。

核糖体在翻译中能跳跃式读码

跳跃式读码属于位移读码的特例，有的在翻译过程中可以跳过一大段mRNA（约50个碱基左右）后继续翻译。这一过程类似于一种剪接方式