体内药物分析课件

药物分析与生物药物分析

绪论一．药物分析的性质

药物分析是以药品质量控制为研究目的一门学科。主要运用化学、物理学或生物学等学科的方法和技术研究各种药物及其制剂（合成药物、天然药物、生物药物及其制剂，中药制剂）的质量控制方法。1．综合性

常规化学分析；仪器分析；计算药物分析；

X-射线衍射，热分析；

DNA、蛋白质、基因分析，免疫分析，细胞分析，体内药物分析。2．指导性

眼睛学科，先峰学科我国中药制剂目前存在的问题：缺乏明确的质量控制标准，不能很好地打入国际市场。二．药物分析的主要任务1．常规药品检验药物分析的主体、核心。分析对象主要是各药厂生产的常规制剂（已用于临床）及原料药、医院制剂。2．为新药研究服务如新药质量标准的制定药物动力学研究新原料药的合成，天然产物的研究：结构鉴定，药物与杂质的分离3．研究药物分析新方法、新技术分析手段的发展：化学分析

纸色谱、TLC

GC（填充柱、毛细管柱）

HPLC

CE、CEC

各种联用技术分析状态的发展：静态分析

实时动态分析分析对象的发展：血浆

多细胞

单细胞、单分子手性药物分析的发展：外消旋体

左、右旋体分别分析研究目的：以新方法、新技术本身为主要目的

---基础理论研究以分析对象为主要目的---应用研究4．与药物分析有关的其它工作三．药品质量标准是国家对药品质量规格及检验方法所作的技术规定，是药品生产、供应、使用、检验和管理部门共同遵循的法定依据。包括：国家药品标准：药典、中国生物制品规程等部颁标准：如中国医院制剂规范地方标准四．药典pharmacopoeia是记载药品标准的法典。凡是药典收录的药品，其质量不符合规定标准的均不得出厂，不得销售，不得使用。（一）中国药典1．沿革：已出版：1953，1963，1977，1985，1990，1995，2000年版2．基本结构和主要内容ChP由凡例、正文、附录和索引四部分组成。（1）凡例

1）标准规定：对有关规定、要求和含义等所作的说明。如避光是指用不透光的容器包装；阴凉处系指不超过20oC等

2）检验方法和限度

ChP收载的原料药及制剂均应按规定方法进行检验；或将其他方法与规定方法对照。限度不是真实含量。若未规定上限，系指不超过101.0%。

3）标准品和对照品

指用于鉴别、检查和含量测定的标准物质。不包括色谱用的内标。标准品：是指用于生物检定、抗生素或生化药品中含量或效价测定的标准物质，按效价单位或µg计。对照品：除另有规定外，均按干燥品或无水物计算后使用。

4）计量：法定计量单位

5）精确度精密称定：准确至所取重量的千分之一。称定：准确至所取重量的百分之一。取用量约若干：指该量不得超过规定量的±10%。精密量取：指量取体积的准确度应符合该体积移液管的精密度要求。称取、量取：其精确度可根据数值的有效数位来确定。如称取0.1g，指称取重量可在0.06-0.14g范围内；2g-----1.5-2.5g；2.0g----1.95-2.05g;2.00g---1.995g-2.005g恒重：小于0.3mg按干燥品（或无水物，或无溶剂）计算：除另有规定外，应取未经干燥（或未去水或未去溶剂）的供试品进行试验，测得干燥失重后，再在计算时从取用量中扣除．空白试验：不加供试品或以等量溶剂替代供试液，同法操作所得结果。试验温度：如不说明，系指室温，通常以25±2℃为准。

6）包装、标签（2）正文

收载不同药品、制剂的质量标准。

药品名称包括：中文名（中国药品通用名称），汉语拼音名称和英文名称。

*中药材不使用英文名称，而采用拉丁名称。（3）附录主要内容：制剂通则，生物制品通则，通用检测方法，生物检定法，试药与试液，溶液配制，原子量表等（4）索引：中（按汉语拼音顺序排列）、英文（二）常用外国药典１．美国药典USP与美国国家处方集NF(Nationalformulation)合并出版；从2002年起，USP-NF将原来的每5年一版改为每年出一版，最新版为USP26-NF21。同时还发行了亚洲版。２．英国药典BP也有《英国国家处方集》配套出版。３．日本药局方JP４．欧洲药典Ph.Eur.有英文和法文两种文本。五．药品检验工作的基本程序1．取样从大量样品中取出少量样品，应考虑取样的科学性、真实性和代表性。取样基本原则：均匀、合理。2．药物的鉴别：判断药品的真伪根据药物的化学结构和理化性质进行某些化学反应，根据反应现象判断；或测定理化常数或光谱特征，来判断。其它包括药品的外观、颜色、气味等的鉴别。应结合多个鉴别试验结果进行判断，而不能以单个鉴别试验判断，否则会误判。3．药物的检查

主要指纯度检查：是限度检查4．药物的含量测定测定主要有效成分的含量。

**第3和第4项可用来判断药品质量的优劣。5．检验报告的书写完整、清楚地记录原始资料，并写出检验报告（给出结论）。六．全面控制药品质量的科学管理良好药品实验研究规范（goodlaboratorypractice,GLP）即药品非临床研究质量管理规范。科学、可靠的研究方法才能得出有效、可靠的实验数据，故需对新药研究条件作严格规定。良好药品临床试验规范（goodClinicalpractice,GCP）

GCP可保护受试者的安全和权利，有助于保证提供有价值的临床研究资料。良好药品生产规范（goodmanufacturepractice,GMP）即药品生产质量管理规范良好药品供应规范（goodsupplypractice,GSP）保证药品在运输、贮存和销售过程中的质量SomeJournalsor→电子资源→ElsvierSDOSJournalofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysisJournalofChromatographyAJournalofChromatographyBAnalyticalChimicaActaTalantaTrendsinAnalyticalChemistryJournalofElectroanalyticalChemistryAnalyticalChemistryJournalofMedicinalChemistryMolecularPharmaceuticsBiomacromoleculesBiochemistryAnalyst

ElectrophoresisJournalofPharmaceuticalScienceJournalofSeparationScienceChiralityJournalofMicrocolumnSeparationJournalofMassSpectrosmetryLuminescenceBiomedicalChromatographyBiopharmaceuticsanddrugDispositionDrugdevelopmentResearchElectroanalysisJournalofBioluminescenceandChemiluminescenceSingleMolecules药学学报中国药学杂志药物分析杂志药学通报国外医学-药学分册药学进展化学学报分析化学高等学校化学学报色谱化学进展各主要大学学报第一章药物的鉴别试验

（identificationtest）第一节概述

ChP和其它各国药典所收载的药物项下的鉴别试验方法，仅适用于贮臧在有标签容器中的药物，用以证实是否为所标示的药物。这些方法不能用于鉴别未知物。一．鉴别项目（一）性状：包括外观、色泽、臭、味、溶解度及一些物理常数。（二）一般鉴别试验（generalidentificationtest,GIT）GIT仅适用于确认单一的化学药物，对多种化学药物的混合物或有干扰物质存在时，除另有规定外，不适用。GIT只能证实药物的类别，将药物与其它类别的药物区分开，不能证实是哪一种药物。（三）专属鉴别试验（specificidentification,SIT)在GIT的基础上进行，可证实药物属于某类药物的哪一种。SIT根据每种药物化学结构的差异及其所引起的物理化学特性的差异，采用灵敏、选择性强的定性反应进行。二．鉴别试验条件1．溶液的浓度：主要指被鉴别药物的浓度，但其他试剂的浓度也应注意控制，特别是以化学反应产生的化学现象为依据进行鉴别的情况。药物+试剂

产物（颜色、沉淀等）2．溶液的温度影响化学反应的快慢。一般温度每升高10℃，可使反应速度增加2-4倍。3．溶液的酸碱度溶液的酸碱度应能使各反应物有足够的浓度处于反应活化状态，并使反应生成物处于稳定、易于观测的状态。4．干扰成分采用专属性更高的鉴别反应或将干扰成分分离除去，以消除干扰。５．试验时间对有机化合物的化学反应影响较大。因为有机反应能否进行，取决于旧共价键断裂和新共价键形成的难易，而这些共价键的更替需要一定时间。三．鉴别试验的灵敏度sensitivity

１．反应灵敏度最低检出量（minimumdetectablequantity,mmin）：应用某一反应，在一定反应条件下，能观测出反应结果所需的供试品的最小量。最低检出浓度（minimumdetectableconcentration,Cmin）：应用某一反应，在一定反应条件下，能观测出反应结果所需的供试品的最小浓度。**检测限（limitofdetection,LOD）zeptomole:10-21zmol；attomole:10-18amolfemtomole:10-15fmol；picomole:10-12pmolnanomole:10-9nmol2.空白试验blanktest消除试剂和器皿可能带来的影响。在与供试品鉴别试验完全相同的条件下，除不加供试品外（或以等量溶剂替代供试液），其他试剂同样加入进行的试验。3．提高反应灵敏度的方法1）消除干扰：如荧光法需滤出天然光和激发光的干扰。2）改进观测方法：如将目视观测溶液的颜色改为可见分光光度法。3）加入与水互不相溶的有机溶剂：浓集有色生成物（脂溶性）于有机溶剂中→颜色加深，易观察。第二节药物的一般鉴别试验一．鉴别方法（一）化学鉴别法

1．干法：无溶剂参与反应焰色试验：鉴别盐的类型气体产生法：在适当温度条件下，加热使供试品分解，生成有特殊气味的气体。２．湿法：鉴别反应在适当溶剂中进行，发生易于观测的化学变化，如颜色、沉淀、气体、荧光等。１）呈色反应鉴别法：常用反应有：三氯化铁呈色反应：适用于含Ar-OH或可产生Ar-OH的药物。异羟肟酸铁反应：多适用于芳酸及其酯类、酰胺类。印三酮呈色反应：多适用于含脂肪胺基的药物。重氮化-偶合显色反应：适用于含Ar-NH2

或能产生Ar-NH2

的药物。氧化还原显色反应２）沉淀生成反应鉴别法与重金属离子的沉淀反应：重金属指比重大于5的金属，如Cu，Ni，Pb，Zn，Sn，W等。与硫氰化铬铵（雷氏盐）的沉淀反应：主要适用于生物碱及其盐、具有芳香环的有机碱及其盐。

3）荧光反应鉴别法荧光：是分子吸收了较短波长的光（激发光，通常为可见和UV光），在很短时间内发射出的较长波长的光。除去激发光源后，荧光立即熄灭。

常用荧光发射形式：药物本身在UV或可见光下发射荧光----自发荧光。药物溶液+硫酸呈酸性后，发射；药物+Br2反应后，发射；药物+间苯二酚反应后，发射----衍生后发荧光。４）气体生成反应鉴别法

氨气（胺气）生成法：适用于胺（铵）类、酰胺类及酰脲类药物。药物经强碱处理后，加热，可产生NH3or胺气。

H2S气体生成法：适用于含硫药物。经强酸处理，加热，产生H2S。碘蒸气生成法：适用于含碘有机药物。经直火加热，生成紫色碘蒸气。醋酸乙酯生成法：适用于含醋酸酯的药物和乙酰胺类药物。二．电磁辐射与电磁波谱1.光：是一种电磁辐射（即电磁波）。具有波粒二相性。光的波动性：用波长、波数和频率表征

ν=c/λ光的微粒性：用每个光子具有的能量表征

E=hνh=6.63×10-34J.S2.电磁波谱γ射线→X射线→UV→可见→红外→微波→无线电波波长逐渐变长三．电磁辐射与物质的相互作用常见电磁辐射与物质相互作用的术语：１．吸收：是原子、分子或离子吸收光子的能量（等于基态和激发态能量之差），从基态跃迁至激发态的过程。２．发射：是物质从激发态跃迁回基态，并以光的形式释放能量的过程。３．散射：是光通过介质时，与介质分子发生弹性碰撞所致，碰撞时没有能量交换，光频率不变，但光子的运动方向发生改变。三．电磁辐射与物质的相互作用４．拉曼散射：是光通过介质时，与介质分子发生非弹性碰撞所致，碰撞时不仅光子的运动方向发生改变，而且还有能量交换，光频率发生变化。５．折射和反射６．干涉和衍射四．光学分析法的分类

表1:原理分析方法辐射的发射1)发射光谱法2）荧光光谱法3）火焰光度法辐射的吸收1）比色法2）分光光度法（可见，紫外，红外等）

3）原子吸收法4）核磁共振法辐射的散射1）拉曼散射2）散射浊度法辐射的折射折射法辐射的衍射1）X-射线衍射法2）电子衍射法辐射的旋转1）偏振法2）旋光法3）圆二色光谱法（一）光谱法与非光谱法１．光谱法：利用物质的光谱进行定性定量和结构分析的方法。有3种基本类型：吸收光谱法、发射光谱法和散射光谱法光谱（spectrum）是物质与辐射能相互作用时，物质内部发生能级跃迁所产生的辐射能强度随波长变化的图谱。

2．非光谱法：不涉及物质内部能级的跃迁，即不以光的波长为特征讯号，仅测量电磁辐射的某些基本性质（反射，折射，干涉，衍射和偏振）所发生的变化。（二）原子光谱法和分子光谱法原子光谱法：以测量气态原子或离子外层或内层电子跃迁所产生的光谱。线状光谱。分子光谱法：是分子中电子能级、振动能级和转动能级发生变化产生的光谱。带状光谱。IR,UV,分子荧光等。（三）吸收光谱法与发射光谱法吸收光谱：是物质吸收相应的辐射能而产生的光谱。利用物质的吸收光谱进行定性定量及结构分析的方法为吸收光谱法。如UV-Vis,IR,NMR发射光谱：是物质的原子、离子或分子受到辐射能、热能、电能或化学能的激发跃迁至激发态后，又从激发态回到基态时以辐射的方式释放能量而产生的光谱。如原子发射光谱法，原子荧光光谱法，分子荧光光谱法，磷光光谱法等．五．光谱分析仪器研究吸收或发射的电磁辐射强度与波长关系的仪器称分光光度计。其组成图大致如下：辐射源→分光系统→样品池→检测器→讯号处理及显示器1．分光系统将复合光分解成单色或有一定波长范围的谱带。分为单色器和滤光片。单色器由入射狭缝、出射狭缝、准直镜和色散元件组成。其中色散元件是心脏，有棱镜和光栅。滤光片有：带通滤光片：只能分出一个波长带；截止滤光片：只能消除给定波长以上或以下的所有辐射。凹口滤光片：2．检测器：多采用光电转换器，包括量子化检测器（如光电倍增管）和热检测器（如真空热电偶）．第二章紫外-可见分光光度法一．基本原理和概念UV-Vis是研究物质在紫外-可见光区（UV:200-400nm，Vis:400-800nm）分子吸收光谱的分析方法。（一）UV-Vis的常用概念1．吸收光谱吸收度或透光率与波长的关系曲线。2．吸收峰及最大吸收波长λmax3.峰谷及最小吸收波长λmin4.肩峰(shoulderpeak):在一个吸收峰旁边产生的一个曲折。5．末端吸收（endabsorption）：在图谱短波端呈现强吸收但不成峰形的部分。（二）定量原理——Lambert-Beer定律A=-lgT=ECL描述物质对单色光吸收的强弱与吸光物质的浓度与厚度间关系的定律。吸收系数可用于定性定量。百分吸收系数：指在一定波长下，溶液浓度为1%（W/V,g/ml）,溶液厚度为1cm时的吸光度．摩尔吸收系数ε：指在一定波长下，溶液浓度为1mol/L,溶液厚度为1cm时的吸光度.ε=(M/10)×

M为摩尔质量吸光度的加合性：混合组分的吸光度是各组分吸光度的和。（三）定性依据

吸收光谱：最大吸收波长吸收系数两波长处吸收度比值（四）影响测定准确性的因素1．偏离Beer定律的因素光学因素：单色光不纯，比色皿厚度的均匀度不合要求。

化学因素：若溶液为胶体溶液或混浊，则入射光通过溶液时部分光会散射或反射而损失；溶液中的溶质因浓度改变而发生解离、缔合、与溶剂相互作用等变化，使吸收发生改变，偏离Beer定律。2．透光率测定误差来自仪器的噪音

可见，浓度相对误差取决于透光率及其测量误差的大小。A在0.2－0.7范围时，浓度测量值的相对误差较小。二．紫外-可见分光光度计1．光源钨灯和卤钨灯：发可见光氢灯和氘灯：发紫外光2．单色器3．吸收池光学玻璃吸收池：只能用于可见光区。熔融石英（氧化硅）吸收池：在紫外光区和可见光区都可用。4．检测器常用光电倍增管、光二极管阵列检测器（photo-diodearraydetector）三．UV-Vis分析方法（一）定性鉴别

UV-Vis一般采用对比法进行定性鉴别。将试样的吸收光谱特征与标准化合物的吸收光谱特征进行对照比较。１．对比吸收光谱特征数据２．对比吸收度或吸收系数的比值可消除溶液浓度和吸收厚度的影响。３．对比吸收光谱的一致性（二）纯度检查1．杂质检查2．杂质的限量检查：后面讲（三）定量测定1．测定方法的建立（１）查文献，根据化学结构确定有无紫外吸收（２）测定条件的选择：通过测定吸收光谱，确定波长：一般选择

max，以提高灵敏度并减少误差；或无干扰且吸收度较大的峰对应的波长；不选择末端吸收波长。溶剂的选择：（３）估算灵敏度，决定取样量标准曲线线性范围的吸收度最好在0.2-0.7之间。（4）空白液：一般以空白体液的提取液为空白，消除体液中其他物质的干扰。2．单组分的定量方法1）吸收系数法：单色光很纯时采用

C=A/(εl)2）校正曲线法必须使用相同仪器，且固定工作状态和测定条件，否则吸光度和浓度之间的关系就会偏离线性。３）对照法

Cx=(Ax/As)×Cs

Cs:标准溶液的浓度。在相同仪器、相同波长下测定。标准物和试样为相同物质。３．同时测定多组分的定量方法

—计算分光光度法样品中有两种组分共存时，各组分吸收光谱相互重叠的程度主要三种：各组分的吸收峰处，其它组分没有吸收：可按单组分的测定方法，分别在各自的吸收峰处测定。各组分的吸收光谱有部分重叠：可先在λ1处按单组分测定法测得混合溶液中a组分的浓度Ca，再在λ2处测定混合溶液的吸收度A2(a+b),则可根据吸收度的加和性计算组分b的浓度Cb.

A2(a+b)=A2a+A2b=E2a×Ca+E2b×Cb各组分的吸收光谱完全重叠（相互干扰）：最常见的情况。可采用以下方法测定。１）差示分光光度法（differencespectrophotometry）不需事先分离，能消除背景吸收和干扰物对供试液测定的影响。测定方法与原理：取两份相等的供试液，制成两种不同的化学环境（如在其一中加酸或碱，改变pH；或在其一中加入能与供试品发生化学反应的试剂），供试品在不同的化学环境中以两种不同的化学形式存在（如分子型与离子型，氧化型与还原型），且两种化学形式的吸收光谱有显著差异；而背景吸收和干扰物的吸收不受化学环境的影响。将两份供试液稀释到相同浓度，分别置于样品池和参比池中，于适当波长处测定吸收度的差值(∆A)，即可对供试品进行定量。二．电磁辐射与电磁波谱1.光：是一种电磁辐射（即电磁波）。具有波粒二相性。光的波动性：用波长、波数和频率表征

ν=c/λ光的微粒性：用每个光子具有的能量表征

E=hνh=6.63×10-34J.S2.电磁波谱γ射线→X射线→UV→可见→红外→微波→无线电波波长逐渐变长三．电磁辐射与物质的相互作用常见电磁辐射与物质相互作用的术语：１．吸收：是原子、分子或离子吸收光子的能量（等于基态和激发态能量之差），从基态跃迁至激发态的过程。２．发射：是物质从激发态跃迁回基态，并以光的形式释放能量的过程。３．散射：是光通过介质时，与介质分子发生弹性碰撞所致，碰撞时没有能量交换，光频率不变，但光子的运动方向发生改变。三．电磁辐射与物质的相互作用４．拉曼散射：是光通过介质时，与介质分子发生非弹性碰撞所致，碰撞时不仅光子的运动方向发生改变，而且还有能量交换，光频率发生变化。５．折射和反射６．干涉和衍射四．光学分析法的分类

表1:原理分析方法辐射的发射1)发射光谱法2）荧光光谱法3）火焰光度法辐射的吸收1）比色法2）分光光度法（可见，紫外，红外等）

3）原子吸收法4）核磁共振法辐射的散射1）拉曼散射2）散射浊度法辐射的折射折射法辐射的衍射1）X-射线衍射法2）电子衍射法辐射的旋转1）偏振法2）旋光法3）圆二色光谱法（一）光谱法与非光谱法１．光谱法：利用物质的光谱进行定性定量和结构分析的方法。有3种基本类型：吸收光谱法、发射光谱法和散射光谱法光谱（spectrum）是物质与辐射能相互作用时，物质内部发生能级跃迁所产生的辐射能强度随波长变化的图谱。

2．非光谱法：不涉及物质内部能级的跃迁，即不以光的波长为特征讯号，仅测量电磁辐射的某些基本性质（反射，折射，干涉，衍射和偏振）所发生的变化。（二）原子光谱法和分子光谱法原子光谱法：以测量气态原子或离子外层或内层电子跃迁所产生的光谱。线状光谱。分子光谱法：是分子中电子能级、振动能级和转动能级发生变化产生的光谱。带状光谱。IR,UV,分子荧光等。（三）吸收光谱法与发射光谱法吸收光谱：是物质吸收相应的辐射能而产生的光谱。利用物质的吸收光谱进行定性定量及结构分析的方法为吸收光谱法。如UV-Vis,IR,NMR发射光谱：是物质的原子、离子或分子受到辐射能、热能、电能或化学能的激发跃迁至激发态后，有激发态回到基态时以辐射的方式释放能量而产生的光谱。如原子发射光谱法，原子荧光光谱法，分子荧光光谱法，磷光光谱法等．五．光谱分析仪器研究吸收或发射的电磁辐射强度与波长关系的仪器称分光光度计。其组成图大致如下：辐射源→分光系统→样品池→检测器→讯号处理及显示器1．分光系统将复合光分解成单色或有一定波长范围的谱带。分为单色器和滤光片。单色器由入射狭缝、出射狭缝、准直镜和色散元件组成。其中色散元件是心脏，有棱镜和光栅。滤光片有：带通滤光片：只能分出一个波长带；截止滤光片：只能消除给定波长以上或以下的所有辐射。凹口滤光片：2．检测器：多采用光电转换器，包括量子化检测器（如光电倍增管）和热检测器（如真空热电偶）．第二章紫外-可见分光光度法一．基本原理和概念UV-Vis是研究物质在紫外-可见光区（UV:200-400nm，Vis:400-800nm）分子吸收光谱的分析方法。（一）UV-Vis的常用概念1．吸收光谱吸收度或透光率与波长的关系曲线。2．吸收峰及最大吸收波长λmax3.峰谷及最小吸收波长λmin4.肩峰(shoulderpeak):在一个吸收峰旁边产生的一个曲折。5．末端吸收（endabsorption）：在图谱短波端呈现强吸收但不成峰形的部分。（二）定量原理——Lambert-Beer定律A=-lgT=ECL描述物质对单色光吸收的强弱与吸光物质的浓度与厚度间关系的定律。吸收系数可用于定性定量。百分吸收系数：指在一定波长下，溶液浓度为1%（W/V,g/ml）,溶液厚度为1cm时的吸光度．摩尔吸收系数ε：指在一定波长下，溶液浓度为1mol/L,溶液厚度为1cm时的吸光度.ε=(M/10)×

M为摩尔质量吸光度的加合性：混合组分的吸光度是各组分吸光度的和。（三）定性依据

吸收光谱：最大吸收波长吸收系数两波长处吸收度比值（四）影响测定准确性的因素1．偏离Beer定律的因素光学因素：单色光不纯，比色皿厚度的均匀度不合要求。

化学因素：若溶液为胶体溶液或混浊，则入射光通过溶液时部分光会散射或反射而损失；溶液中的溶质因浓度改变而发生解离、缔合、与溶剂相互作用等变化，使吸收发生改变，偏离Beer定律。2．透光率测定误差来自仪器的噪音

可见，浓度相对误差取决于透光率及其测量误差的大小。A在0.2－0.7范围时，浓度测量值的相对误差较小。二．紫外-可见分光光度计1．光源钨灯和卤钨灯：发可见光氢灯和氘灯：发紫外光2．单色器3．吸收池光学玻璃吸收池：只能用于可见光区。熔融石英（氧化硅）吸收池：在紫外光区和可见光区都可用。4．检测器常用光电倍增管、光二极管阵列检测器（photo-diodearraydetector）三．UV-Vis分析方法（一）定性鉴别

UV-Vis一般采用对比法进行定性鉴别。将试样的吸收光谱特征与标准化合物的吸收光谱特征进行对照比较。１．对比吸收光谱特征数据２．对比吸收度或吸收系数的比值可消除溶液浓度和吸收厚度的影响。３．对比吸收光谱的一致性（二）纯度检查1．杂质检查2．杂质的限量检查：后面讲（三）定量测定1．测定方法的建立（１）查文献，根据化学结构确定有无紫外吸收（２）测定条件的选择：通过测定吸收光谱，确定波长：一般选择

max，以提高灵敏度并减少误差；或无干扰且吸收度较大的峰对应的波长；不选择末端吸收波长。溶剂的选择：（３）估算灵敏度，决定取样量标准曲线线性范围的吸收度最好在0.2-0.7之间。（4）空白液：一般以空白体液的提取液为空白，消除体液中其他物质的干扰。2．单组分的定量方法1）吸收系数法：单色光很纯时采用

C=A/(εl)2）校正曲线法必须使用相同仪器，且固定工作状态和测定条件，否则吸光度和浓度之间的关系就会偏离线性。３）对照法

Cx=(Ax/As)×Cs

Cs:标准溶液的浓度。在相同仪器、相同波长下测定。标准物和试样为相同物质。３．同时测定多组分的定量方法

—计算分光光度法样品中有两种组分共存时，各组分吸收光谱相互重叠的程度主要三种：各组分的吸收峰处，其它组分没有吸收：可按单组分的测定方法，分别在各自的吸收峰处测定。各组分的吸收光谱有部分重叠：可先在λ1处按单组分测定法测得混合溶液中a组分的浓度Ca，再在λ2处测定混合溶液的吸收度A2(a+b),则可根据吸收度的加和性计算组分b的浓度Cb.

A2(a+b)=A2a+A2b=E2a×Ca+E2b×Cb各组分的吸收光谱完全重叠（相互干扰）：最常见的情况。可采用以下方法测定。１）差示分光光度法（differencespectrophotometry）不需事先分离，能消除背景吸收和干扰物对供试液测定的影响。测定方法与原理：取两份相等的供试液，制成两种不同的化学环境（如在其一中加酸或碱，改变pH；或在其一中加入能与供试品发生化学反应的试剂），供试品在不同的化学环境中以两种不同的化学形式存在（如分子型与离子型，氧化型与还原型），且两种化学形式的吸收光谱有显著差异；而背景吸收和干扰物的吸收不受化学环境的影响。将两份供试液稀释到相同浓度，分别置于样品池和参比池中，于适当波长处测定吸收度的差值(∆A)，即可对供试品进行定量。设x、y分别代表两种不同化学环境中供试品的两种不同化学形式，它们在测定波长处的吸收度以Ax和Ay表示；背景吸收和干扰物的吸收度为Az，则：

∆A=A样品–A参比

=（Ax+Az）-(Ay+Az)=Ax–Ay=εxCL-εyCL=(εx–εy)CL具体测定方法有3种（见《体内药物分析》p82）：

1)利用最大吸收波长处的吸收度差定量；

2)利用最小吸收波长处的吸收度差定两；

3)利用差示光谱中最大吸收与最小吸收之差定量。2)双波长分光光度法一般用双波长分光光度计测定。A.等吸收点双波长法原理：以a、b两组分为例。选择两个测定波长，使干扰组分a在两波长处有等吸收，而待测组分在两波长处的吸收度有显著差别。测定混合物溶液在两波长处的吸收度之差即可对待测组分进行定量。∆A=Aλ2(a+b)-Aλ1(a+b)

=(Aλ2a+Aλ2b)-(Aλ1a+Aλ1b)=Aλ2b-Aλ1b=(ελ2b-ελ1b)CbL2)双波长分光光度法B.系数倍率法当干扰组分没有等吸收波长或虽有等吸收波长而待测组分的∆A较小时，等吸收点双波长法则不能使用。可用系数倍率法。原理：在选定的两波长处，利用双波长分光光度计的信号放大装置，将一个波长处的吸收信号放大k倍，使干扰组分a在两波长的吸收度相等,

即Aλ1a=kAλ2a。测定混合物溶液在两波长处的吸收度之差即可对待测组分进行定量。

∆A=kAλ2(a+b)-Aλ1(a+b)=(kAλ2a+kAλ2b)-(Aλ1a+Aλ1b)=kAλ2b-Aλ1b=(kελ2b-ελ1b)CbL当k=1时，即是等吸收点法。应选择使k值尽可能接近于1的波长对进行实验。3）导数分光光度法A导数光谱的波型和特点零阶光谱的极大在奇数阶的导数光谱中相应于0，在偶数阶的导数光谱中相应于极值（极大和极小交替出现）；零阶光谱的拐点在奇数阶的导数光谱中产生极值，在偶数阶的导数光谱中相应于0；随着导数阶数增加，极值数量增加（导数阶数+1），谱带边窄，分辨能力提高。因此导数光谱在定性分析中十分有用。B消除干扰组分吸收的原理若干扰组分的吸收对波长呈线性，可用一阶导数法消除干扰：

A总

=εCL+(aλ+b)dA/dλ=(dε/dλ)CL+a定量参数D=（dA/dλ）峰

-（dA/dλ）谷

=[（dε/dλ）峰

-（dε/dλ）谷]CL对给定波长，(dε/dλ)峰、(dε/dλ)谷为常数第三章荧光分析法

fluorometry一.概述

fluorometry是根据物质荧光谱线的位置及强度进行物质鉴定和含量测定的方法。灵敏度比UV-Vis法高，但重现性不如UV-Vis法。光致发光：常见光致发光有荧光和磷光。化学发光（Chemiluminescence,CL）：是指吸收了化学反应能的原子或分子由激发态回到基态时产生的一种光辐射现象。分子荧光：待测物质是分子。原子荧光：待测物质是原子。激发光：UV-Vis光，IR光，X-射线等

二．基本原理（一）分子荧光的产生1．振动弛豫vibrationalrelaxation：处于激发态各振动能级的分子通过与溶剂分子的碰撞而将部分能量传递给溶剂分子，其电子则返回到同一电子激发态的最低振动能级的过程。振动弛豫属于无辐射跃迁，因为能量不是以光辐射的形式放出的。2．内部能量转换internalconversion：受激分子由高电子能级以无辐射方式转移至低电子能级的过程。3．外部能量转换externalconversion:溶液中的激发态分子与溶剂分子或与其他溶质分子之间相互碰撞而失去能量，并以热能的形式释放能量的过程。4．荧光发射：物质分子从激发态的最低振动能级返回基态时，以辐射形式发射光量子，这些光量子就称为荧光。由于振动弛豫、内部能量转换和外部能量转换损失了部分能量，故荧光的波长总比激发光波长长。

(二)激发光谱和发射光谱激发光谱（excitationspectrum）：表示不同激发波长的光引起物质发射某一波长荧光的相对效率。绘制激发光谱曲线时，固定发射单色器在某一波长，通过激发单色器扫描，以不同波长的光激发物质，记录荧光强度对激发光波长的关系曲线，即得激发光谱。类似于吸收光谱。发射光谱（或称荧光光谱，fluorescencespectrum）：表示在所发射的荧光中，各种波长荧光组分的相对强度。绘制发射光谱时，使激发光的波长和强度保持不变，通过发射单色器扫描以检测各种波长下相应的荧光强度。记录荧光强度对发射波长的关系曲线，即得荧光光谱。激发光谱和发射光谱可用于鉴别荧光物质，且是选择测定波长的依据。

(三)荧光效率

（fluorescenceefficency）即荧光量子效率，指激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光的光子数之比。φf=发射荧光的光子数/吸收荧光的光子数一般在0—1之间。(四)有机化合物分子结构

与荧光的关系能发射荧光的物质需同时具备2个条件：有强的紫外-可见吸收：具有π-π*跃迁的长共轭分子有；具有一定的荧光效率：有刚性平面结构的分子有。1.长共轭结构与荧光的关系：含芳香环或芳香杂环的物质具有长共轭的π-π*跃迁，能产生荧光。π电子共轭程度越大，则荧光强度越大，荧光波长也长移。

λex205nmλex286nmλem356nmλem278nmλem321nmλex404nmφf=0.11φf=0.29φf=0.362.分子的刚性与荧光的关系：在相同的长共轭分子中，分子的刚性越强，荧光效率越大，荧光波长越长。

φf=0.2φf=1.03.取代基与荧光的关系

给电子取代基：-NH2,-OH,-OCH3,-NHR,-NR2,-CN能增加分子的π电子共轭程度，荧光效率提高，荧光波长长移。吸电子取代基：-COOH,-NO2,-C=O,-NO,-F,-Cl,-Br,-I等。能减弱分子的π电子共轭程度，荧光效率减弱甚至熄灭。(五)荧光试剂与弱荧光物质或不显荧光的物质作用，得到强荧光性衍生物。常用试剂：荧光胺，邻苯二甲醛（OPA）,丹酰氯，丹酰肼，8-羟基喹啉（常用于无机离子的衍生）等。(六)影响荧光强度的外部因素1.温度：一般，温度升高，溶液中荧光物质的荧光强度和荧光效率降低。因温度升高，分子运动速度加快，分子碰撞几率增加，使无辐射跃迁增加。2.溶剂极性:一般，溶剂的极性增加，荧光波长长移，荧光强度增加。因极性溶剂中，π-π*跃迁的能量差减小，使激发波长和荧光波长均长移，跃迁几率增加，荧光强度增加。粘度：粘度减小，分子碰撞几率增加，使无辐射跃迁增加，荧光减弱。3.酸度：当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的酸度对其荧光强度影响较大。因荧光物质有其最适宜的发射荧光的存在形式。苯胺：pH7-12,主要以分子形式存在，-NH2能提高荧光效率。发射蓝色荧光。当溶液的pH<2或pH>13时，以离子形式存在，不能发射荧光。4.荧光熄灭剂quenchingmedium：能与荧光物质相互作用,使其荧光强度降低或熄灭的物质。荧光熄灭剂会使荧光分析产生误差。荧光熄灭法：如果一种荧光物质在加入某种熄灭剂后，荧光强度的降低和荧光熄灭剂的浓度成线性关系，则可利用这一性质测定荧光熄灭剂的含量。5.散射光：一束光照在溶液中时，与溶液中的物质分子相互碰撞，使光子的运动方向发生改变而向不同角度散射，这种光称散射光。又分为：瑞利光（Reyleighscatteringlight）：光子与物质分子发生弹性碰撞时，产生的散射光。其波长与入射光波长相同。拉曼光（Ramanscatteringlight）：光子与物质分子发生非弹性碰撞时，光子把部分能量转移给物质分子或从物质分子获得部分能量，而发射出比入射光稍长或稍短的光，这种光称拉曼光。散射光对荧光测定有干扰，尤其是比入射光波长更长的拉曼光，干扰更大。

三.荧光定量分析（一）定量原理

荧光强度正比于被荧光物质吸收的光强度：F=K(I0-I)根据beer定律：I=I010-ECL,则F=KI0(1-10-ECL)=KI0(1-e-2.3ECL)=KI0[1-(1++++……)]=KI0[2.3ECL---…)]当浓度很小时（即当ECL

0.05时），上式简化为：

F=2.3KI0ECL

即低浓度时，溶液的荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系。且与受下列因素的影响：荧光量子效率；入射光强度；化合物的吸收系数。（二）定量方法1．标准曲线法：以空白溶液调0（荧光强度为0），以标准系列中最大浓度的标准溶液调100%（荧光强度为100%）。2．对照法：若标准曲线通过0点，可用对照法定量。

Cx=×Cs当空白溶液的荧光强度不能调到0时，必须扣出。四．荧光分光光度计1．激发光源：汞灯，氙灯，激光2．滤光片：2个，激发滤光片位于光源和样品池之间；荧光滤光片位于样品池和检测器之间。3．样品池4．检测器：PMT收集荧光的方向:与激发光源的方向垂直五．测定方法的建立1．根据文献及结构,判断物质的荧光性质2．作激发光谱和荧光光谱，选择最佳激发波长和发射波长3．定性方法：比较待测组分与标准品的最大发射波长、荧光强度、荧光光谱等。3．定量方法：一.概述重要性:

历史上两次诺贝尔化学奖都直接与色谱研究相关1948年瑞典科学家Tiselins因电泳和吸附分析的研究获奖；1952年英国的Martin和Synge因发展了分配色谱获奖。色谱法的创建:色谱法创始于20世纪初，1903年由俄国植物学家Tsweet发现,并于1906年发表论文,将这种方法命名为“色谱”。二.色谱法分类1.按流动相与固定相的分子集聚状态分：流动相可为气体、液体和超临界流体；固定相可为液体和固体；以化学键合固定相进行的色谱法称为键合相色谱法。2.按操作形式分：柱色谱法，平面色谱法，毛细管电泳法等3.按色谱过程的分离机制分：分配色谱法，吸附色谱法，离子交换色谱法，空间排阻色谱法，CE,CEC等.三．基本原理和概念（一）色谱过程实现色谱操作的基本条件：必须具备相对运动的两相，即：固定相（stationaryphase）：固定不动；流动相（mobilephase）：携带试样向前移动的流动体。色谱过程：组分分子在流动相和固定相间多次分配的过程。（二）色谱流出曲线和有关概念1．色谱流出曲线和色谱峰1）色谱流出曲线：由检测器输出的响应信号对时间作图所得到的曲线，即色谱图。2）基线：在操作条件下，没有组分流出时的流出曲线。反映仪器（主要是检测器）的噪音随时间的变化。3）色谱峰：正常峰：对称形正态分布曲线。拖尾峰（tailingpeak）：前沿陡峭，后沿平缓。前延峰（leadingpeak）：后沿陡峭，前沿平缓。对称因子fs(symmetryfactor)或拖尾因子（tailingfactor）:fs=W0.05h/2A=(A+B)/2AW0.05h为0.05倍色谱峰高处的色谱峰宽。A,B分别为0.05倍色谱峰高处的色谱峰前沿、后沿与色谱峰顶点至基线的垂线之间的距离。fs=0.95-1.05对称峰;小于0.95为前延峰;大于1.05为拖尾峰.描述色谱峰的参数：峰高和峰面积：用于定量；保留值：定性；峰宽：衡量柱效。2．保留值1）保留时间（retentiontime,tR）：从进样到某组分在柱后出现浓度极大时的时间间隔。2）死时间(deadtime,t0)：不被固定相吸附或溶解的组分的保留时间。3)调整保留时间（adjustedretentiontime,t’R）:t’R=tR–t04)保留体积（retentionvolume,VR）:从进样到某组分在柱后出现浓度极大时,所需通过色谱柱的流动相体积。

VR=tR×Fc流动相流速（体积流速，ml/min）越大，保留时间越短，二者的乘积不变，即VR与流动相流速无关。5）死体积（deadvolume,V0）:

从进样器至检测器的流路中未被固定相占有的空间。是色谱柱中固定相颗粒间间隙、进样器到色谱柱间导管的容积、柱出口导管及检测器内腔容积的总和。

V0=t0×Fc

死时间相当于流动相充满死体积所需的时间。6）调整保留体积（adjustedretentionvolume,V’R）7)相对保留值（relativeretention,rorα）:

色谱系统的选择性指标。8）保留指数（retentionindex,I）

GC中，把组分的保留行为换算成相当于正构烷烃的保留行为，即以正构烷烃作为组分相对保留值的标准，用2个保留时间紧邻待测组分的基准物质来标定组分，这个相对值称保留指数。又称Kovats指数。

Ix=100[z+n]z和z+n为正构烷烃的碳原子数,n一般为13．色谱峰高和峰面积1）peakheight,h2)peakarea,A4.色谱峰区域宽度1）标准差（standarddeviation,σ）:0.607倍峰高处的峰宽之半。2）半峰宽（peakwidthathalfheight,W1/2）

W1/2=2.355σ3)峰底宽（peakwidth,W）:通过色谱峰两侧拐点作切线，在基线上所截得的距离

W=1.699W1/2=4σ5.分离度(resolution,R)R=R=1.5时，两峰完全分开，称基线分离。（三）分配系数与色谱分离1．分配系数和容量因子分配系数（distributioncoefficient,K）:

在一定温度和压力下，达到分配平衡时，组分在固定相和流动相中的浓度之比

K=Cs/CmK与组分、固定相和流动相的性质和温度有关。在固定相、流动相和温度一定时，K是组分的特征参数。容量因子（capacityfactor,k）在一定温度和压力下，达到分配平衡时，组分在固定相和流动相中的质量之比

k=ms/mm=(CsVs)/(CmVm)=K×(Vs/Vm)2．K和k与保留时间的关系设流动相的线速度为u，样品组分的速度为v，将二者之比称为保留比:R’=v/u(1)

在定距展开的柱色谱中，v=L/tR,u=L/t0,则：

R’=t0/tR(2)

因t0近似于组分在流动相中的时间tm，溶质分子只有出现在流动相中时才能随流动相前移故保留比与溶质分子在流动相中的分数有关：R’=R’=(3)由（2）和（3）式，得：tR=t0(1+k)(4)tR=t0(1+K)(5)(5)式为色谱过程方程，表示保留时间与分配系数的关系容量因子与保留时间的关系：

k=3．色谱分离的前提两组分A和B:tRA=t0(1+KA)tRB=t0(1+KB)

∆tR=tRA-tRB=t0(KA–KB)两组分如果被分离，保留时间必须不等，则两组分的K必须不等，-------色谱分离的前提。或∆tR=tRA-tRB=t0(kA–kB),即容量因子不等是分离的前提。四．基本类型色谱方法及其分离机制（一）分配色谱法分离原理：利用被分离组分在固定相或流动相中的溶解度差别进行分离

K=Cs/Cm=(Xs/Vs)/(Xm/Vm)Xs:溶解在固定相中的组分溶质分子

Xm:溶解在流动相中的组分溶质分子包括：气液分配色谱法;液液分配色谱法(正相分配色谱和反相分配色谱)（二）吸附色谱法分离原理：利用被分离组分对固定相表面吸附中心吸附能力的差别进行分离。吸附过程是组分分子和流动相分子争夺吸附剂表面活性中心的过程。吸附系数Ka=(Xa/Sa)/(Xm/Vm)Xa:被吸附的组分分子

Xm：流动相中的组分溶质分子

Sa:吸附剂的表面积包括：气固吸附色谱法和液固吸附色谱法。（三）离子交换色谱法分离原理：利用被分离组分离子交换能力的差别进行分离。

RSO3-H++Na+RSO3-Na++H+

用通式表示：

R-B++A+=R—A+B+

离子交换反应的选择性系数：

KA/B==KA和KB为分配系数，KA/B越大，说明A的交换能力越大。固定相：离子交换树脂交联度交换容量粒度影响保留行为的因素：溶质离子的电荷和水合半径离子交换剂的交联度和交换容量流动相组成和pH（四）空间排阻色谱法又称分子排阻色谱法，凝胶色谱法（gelchromatography分离原理：利用被分离组分分子的线团尺寸差异进行分离。在高分子溶液中，相同成分的分子的线团尺寸与其分子量成正比，因此组分按分子量大小差异进行分离。渗透系数Kp=[Xs]/[Xm]

Kp由溶质分子的线团尺寸和凝胶孔隙大小所决定。凝胶孔隙一定时，分子的线团尺寸越大，越不易进入凝胶孔隙。固定相：凝胶．主要性能参数：1）平均孔径2）排斥极限：化合物的分子量达到一定值时，就不能进入凝胶的任何孔隙，这一分子量为凝胶的排斥极限；3）分子量范围：排斥极限与全渗透点（Kp=1）之间的分子量范围。流动相：应能溶解样品组分，同时还必须能润湿凝胶；粘度低总结：根据色谱过程方程：

tR=t0(1+K

)上述各种色谱法中，K分别为分配系数，吸俯系数，选择性系数和渗透系数，Vs分别为色谱柱内固定相体积，吸附剂表面积，离子交换剂总交换容量和凝胶孔内总容积。五．色谱法基本理论1．塔板理论在解释流出曲线的形状、评价柱效等方面比较好。假设：在色谱柱内一小段长度H内，组分可以在2相中瞬间达到分配平衡。样品和新鲜流动相都加在第0号塔板上。试样的纵向扩散可以忽略。分配系数在各塔板上是常数。理论塔板高度H（plateheight,heightequivalenttoatheoreticalplate）:

H=L/n理论塔板数n(thenumberoftheoreticalplates):

n=16(tR/W)2=5.54(tR/W1/2)2

1．经典平板电泳的最大局限：

高压电场产生的焦耳热效应，导致电泳区带展宽，分离度降低。这种影响还会由于电场强度的增大而迅速加剧，极大地限制了高电压的使用，难以提高电泳分离速度。.CE概述

2．CE及其特点毛细管电泳或高效毛细管电泳（CE或HPCE）是以高压直流电场为驱动力，荷电粒子在毛细管内按其电泳淌度或/和分配系数不同进行分离的一种电泳新技术。和平板电泳相比，CE过程在散热效率极高的毛细管内进行，从而可引入高电场强度，全面改善分离质量。CE最显著特点:高效、快速和样品用量少。3．CE与HPLC的比较CE优势：柱效更高，分析速度更快，而样品用量仅为HPLC的几百分之一；同时，它不需高压泵输送系统，溶剂消耗极少，成本相对较低；另外，通过简单的操作模式和缓冲液体系改变，CE即可实现不同理化性质样品组分的有效分离，而为了达到类似目的，HPLC需要价格相对昂贵的色谱柱和有机溶剂。3．CE与HPLC的比较CE不足：由于进样量小，采用柱上在线检测，光径长度短，其灵敏度不如HPLC；同时由于电渗流难以定量控制及进样精确性的影响，CE的分离重现性和定量准确性也比HPLC逊色。4．CE发展趋势目前，CE仍然是分析化学的一个热门研究分支，其理论、仪器、应用等各方面都在不断发展。其中CE在生物学、医学和药学领域的应用已相当广泛，分离分析对象涉及到多肽、蛋白质、核酸、氨基酸、有机药物、无机离子等多种物质以及单个细胞中各种化学成分。4．CE发展趋势最新版中国药典（2000年版）和美国药典（第26版）均已收录CE。在今后较长一段时间内，CE将和HPLC并驾齐驱，互为补充，成为生物医药学领域的一种重要分离分析工具。二．CE基本理论1．电泳和电泳淌度电泳是带电粒子在电场作用下的定向迁移。电泳分离是基于组分在电场作用下的差速迁移进行的。带电粒子在电场下的迁移速度（电泳速度）为：

νe=μeE(1)

式中E为电场强度，是指单位距离的电压降（V/cm）；μe为电泳淌度，是指单位电场下带电粒子的迁移速度。对给定粒子、分离介质和操作温度，电泳淌度为一常数。

处于电场中的带电粒子以迁移速度νe运动时，受到电场力和粘滞阻力（或称摩擦力）两种力的作用，对电场力（FE）有：

FE

=qE(2)而粘滞阻力（FF）正比于粒子的迁移速度，方向与电场力相反：

FF

=fνe

(3)对于球形粒子，f由Stokes定律给出：

f=6πηr(4)式中q为粒子电荷，f为摩擦系数，η为介质粘度，r为粒子半径。当电场力与摩擦力相对平衡时，离子以稳定速度运动。即：

qE=6πηrνe

(5)显然，电泳淌度为：

μe

=(6)可见，粒子半径越小、粒子所带电荷越多、分离介质的粘度越小，电泳淌度越大。电泳淌度不同是电泳分离的基础。2.电渗流

电渗流（electrophoresisflow,EOF）或电渗是毛细管内溶液在电场作用下整体朝一个方向运动的现象。形成：对石英毛细管来说，一般情况下，由于硅醇基（-SiOH）电离，管壁表面带负电，为了保持电荷平衡，溶液中水合阳离子被吸附到表面附近，形成双电层。当在毛细管两端加电压时，双电层中的阳离子向阴极迁移，由于离子是溶剂化的，因此带动了毛细管中的整体溶液向阴极迁移，其过程如图2-1。石英毛细管中的EOF通常是从阳极流向阴极。Figure2-1SchematicofcreatingEOF.EOF大小可用电渗速度（νeo）或电渗淌度（μeo）来表示：

νeo

=E

(7)

μeo=(8)

式中ξ

为双电层的Zeta电位，ε为分离介质的介电常数。电渗速度可用实验方法求得：

νeo

=l/teo

(9)

式中l为毛细管有效长度（从进样端至检测窗的长度），teo为电渗流标记物（中性物质）从进样端迁移至检测窗所需时间。EOF的特点：

(1)平面流型

EOF的一个重要特点是具有平面流型，电渗速度的径向分布几乎是均匀的，不引起样品区带扩散。

HPLC中,由于泵驱动,液体和固体表面接触处的摩擦力会导致压力下降,因此HPLC的液体流型则是抛物线型，柱管中心速度为平均速度的两倍，使样品区带大大展宽（见图2-2）。

Figure2-2SchematicoftheflowshapeandthesamplepeaksinCE(a)andHPLC(b).（2）电渗速度大EOF的速度一般比荷电粒子的电泳速度大,因而可以使所有样品组分（正离子、中性分子、负离子）沿相同方向迁移，实现一次CE操作同时完成正、负离子和中性分子的分离分析。各组分从进样端迁移到检测窗所需时间（迁移时间）取决于电渗速度和组分电泳速度的矢量和，迁移过程如图2-3所示。

Figure2-3SchematicforthemigrationofdifferentsamplesinCE.影响EOF的因素（1）电场强度

EOF与电场强度成正比。当毛细管长度固定时，与外加电压V成正比。但V太高时，由于毛细管不能有效地散失产生的焦耳热，EOF会偏离线性。（2）缓冲液组成、浓度和pH

对同一种缓冲液，EOF随浓度增加而降低。因浓度增加，双电层厚度变薄，Zeta电势下降，EOF减小。对石英毛细管，pH增加，Si-OH易电离，负电荷密度增大，

Zeta电势增高，EOF增大。（3）毛细管材料

（4）缓冲液添加剂

中性盐：增加缓冲液离子强度，抑制硅醇基电离，EOF降低。缺点是热效应大，电流升高。

两性离子：如三甲铵基甲内盐(CH3)3-N+-CH2-COO-。可增加缓冲液离子强度，抑制硅醇基电离，EOF降低。但不增加电流。

表面活性剂：如烷基季铵盐

有机溶剂：影响机理复杂（5）柱温：

T升高，CEbuffer粘度降低，EOF增大。3．柱效和分离度CE的柱效用理论塔板数（thenumberoftheoreticalplates,N）表示，其表达式来源于色谱理论：

N=（μe

+μeo）

(10)

式中μe

为电泳淌度，μeo为电渗淌度，V为操作电压，l为毛细管有效长度，D为溶质的扩散系数，L为毛细管总长度。

实际理论塔板数可以直接从电泳图谱中求得：

N=5.54(tm/W1/2)2(11)

式中tm

为迁移时间，W1/2为半峰宽。由式（11）求得的柱效总是小于由式（10）计算的理论值。影响CE柱效的因素:CEbuffer和溶质本身,主要是自热、扩散和吸附;1)自热在毛细管内产生径向温度梯度,进而产生径向粘度梯度,使带电粒子的迁移速度产生径向不均匀分布,EOF的平面流型被破坏,导致区带展宽.2)扩散:主要是溶质的纵向扩散3)吸附:静电吸附和疏水作用引起的吸附系统本身,如进样和检测.CE中两相邻组分的分离度可用下列公式表示：

Rs=(12)

式中为两组分电泳淌度之差，为两组分平均电泳淌度。可见，分离度不仅取决于两组分的电泳淌度，