生物医学工程前沿之生物医学检测与疾病诊断

《生物医学工程前沿》主讲教师涂秋芬第二章生物医学检测与疾病诊断一：显微镜的发展二：医学生物化学检测三：医学成像检测一：显微镜的发展（一）光学显微镜的鼻祖---单式显微镜早在公元前一世纪，人们就已发现通过球形透明物体去观察微小物体时，可以使其放大成像。后来逐渐对球形玻璃表面能使物体放大成像的规律有了认识。单式显微镜的致命缺点：它的焦距与透镜直径成正比,与放大倍数成反比。如果放大倍数是100倍,透镜的焦距为0.25毫米,透镜直径大约为0.33毫米。他一生亲自磨制了550个透镜，装配了247架显微镜，为人类创造了一批宝贵的财富，至今保留下来的有9架。

（二）列文虎克显微镜——单式显微镜的顶峰

用列文虎克制作的显微镜观察到的人血涂片

现存于荷兰尤特莱克特大学博物馆(UniversityMuseumofUtrecht)中的一架的放大倍数为270倍。分辨力为1.4μm。在当时,这个水平是很高的，直到19世纪初所制的显微镜还未超过这一水平。

大约在16世纪末，荷兰的眼镜商詹森（ZacchariasJanssen）和他的儿子把几块镜片放进了一个圆筒中，结果发现通过圆筒看到附近的物体出奇的大，这就是现在的显微镜和望远镜的前身。

詹森制造的是第一台复合式显微镜。其基本原理是使用两个凸透镜，一个凸透镜把另外一个所成的像进一步放大。（三）最早的复式显微镜

第一个复式显微镜——詹森显微镜复式显微镜的发明,是科学史上的里程碑,人类从此开始认识微观世界。从十六世纪晚期，第一个复式显微镜发明并开始被人们使用，一直到十七世纪末,复式显微镜都使用得没有单式显微镜广泛。因为当时的透镜制造技术不高,制造出的复式显微镜的像差和色差都很大，这使人们大都不喜欢使用复式显微镜。不过还是有些人制造,使用了一些复式显微镜，例如意大利人伽利略(Galileo)和英国人罗伯特.胡克(Hooke)。

伽利略的显微镜胡克的显微镜软木塞（四）卡夫显微镜（十八世纪）英国显微镜设计师JohnCuff在17世纪中叶设计了一种新型的显微镜。这种显微镜很快得到了人们的喜爱。在以后的很多年里这种显微镜被大量地制造和使用(甚至在当时的一些解剖学著作里都可以看到对这种显微镜的介绍)，同时又被不断地改造和完善。它们被统称为Cuff显微镜。这类显微镜的特色在于:

新式底座：几乎所有的显微镜的基座都连在一个木盒子上。

独特镜臂结构。

当时最先进的聚光方法。

卡夫(Cuff)显微镜

十九世纪，随着工业革命的进行，显微科学也同其它学科一起飞速发展起来。其主要的原因是机械的使用使透镜的质量大大提高和光学的发展使显微镜的结构更加符合光学原理。（五）Wenham显微镜（十九世纪）

由FrancisWenham在1882年制造。有着当时最为精巧先进的齿轮传动系统和齿轮调焦系统,聚光系统，还有成像系统

。是十九世纪中性能最好的显微镜,也是历史上最精美的显微镜。※由于人们在物理，数学和材料科学等领域取得了非常大的进展，显微镜的质量大大提高。※数字成像技术开始了用计算机来处理传送显微影象的时代，使人们记录显微影象的方式又前进了一步。（六）现代显微镜（二十世纪以后）倒置相差显微镜蔡司普通光学显微镜荧光显微镜※激发光源（紫外光或蓝紫光）激发标本（经过荧光染色或没有）产生荧光进行观察。※优点：成像对比强烈，色彩鲜艳，分辨率高，可以观察到一般不可见的物质（如DNA等分子）的分布情况等。※有明视野、暗视野

※相差

※偏振、微分干涉

※荧光

※显微摄影

是一种高档次的显微镜。万能显微镜细胞光学显微镜图片CD31人类认识生物的脚步绝对不会停止在细胞水平，对于亚细胞物质、微小病毒颗粒的认识需要更大放大倍数的显微镜出现。SARS病毒

示意图血小板

西门子公司于1939年研制成功世界上第一台商品透射电镜，分辨率优于100埃；1954年进一步研制成功ElmiskopI型透射电镜，分辨率优于10埃。

德国西门子公司总部15（七）透射电子显微镜随着20世纪90年代纳米科技的发展，有力推动了透射电镜的进一步发展，目前透射电镜晶格分辨率最高达0.1nm，放大倍率150万倍。加速电压可达2000kv的超高压透射电镜17核仁清晰、细胞器丰富透射电镜（×6656）SARS病毒透射电镜图比较部分光学显微镜透射电镜光源可见光(日光、电灯光)电子源(电子枪)照明控制玻璃聚光镜电子聚光镜样本1mm厚的载玻片约10nm厚的薄膜放大成象系统玻璃透镜电子透镜介质空气和玻璃高度真空聚焦方法移动透镜改变线圈电流或电压分辨本领200nm0.2~0.3nm有效放大倍数103×106×在透射电镜的基础上,1935年德国学者诺尔首次提出了扫描电镜的概念，1952年剑桥大学Oatley等制作了第一台扫描电镜。OatleyandMcMullan

18（八）扫描电子显微镜1965年剑桥大学推出第一台商品扫描电镜。目前其发展方向是场发射型高分辨扫描电镜和环境扫描电镜。场发射扫描电镜（左）和环境扫描电镜（右）目前扫描电镜的最高分辨率可达1-2nm，最好的高分辨环境扫描电镜可在气压为4000Pa下仍保持2nm的高分辨率水平。扫描电镜下的花粉图片20能谱的测试范围有限，一般为Be（4）到U（92），在这范围之外元素的信号不能通过探测窗口。1：EDS所能测到的是核外原子数必须大于2的，所以H、He都是测不到的。2：核外电子太少

采集器采集时只能采到很少。扫描电镜分析材料元素

史上最强显微镜----扫描透射电子全息显微镜（STEHM）日本日立公司用了一年时间在加维多利亚大学一个研究中心地下实验室，组装了这部超高分辨率、超稳定的仪器。2013-07-31重7吨、高4.5米；分辨率35皮米（0.035nm）；该显微镜能让研究人员以一种前所未有的方式观测原子、确定元素类型和数量。有了这部设备，很多需要观测原子结构量级的国际多学科科学和工程研究项目得以深入开展，相关科学研究也将开启新纪元。（九）激光共聚焦显微镜1957年，MalwinMinsky在其专利中首次阐明了激光共聚焦显微镜技术的基本工作原理，1970年，Sheppard和Wilson推出第一台单光束共聚集激光扫描显微镜，1987年，White和Amos在Nature杂志发表了“Confocalmicroscopycomeofage”,标志着LSCM已成为科学研究的重要工具。激光共聚焦显微镜结构图激光扫描共焦显微镜基本原理激光扫描共焦显微镜分辨率人眼分辨率： 0.2mm光学显微镜分辨率：0.25μm电子显微镜分辨率：0.2nm共焦显微镜分辨率：0.18μm共焦显微镜与传统荧光显微镜的区别（1）

抑制图像的模糊，获得清晰的图像。（3）

点对点扫描去除了杂散光的影响。（2）

具有更高的轴向分辨率，

并可获取连续光学切片。（十）原子力显微镜1981年，IBM公司苏黎士研究所的科学家成功开发扫描隧道显微镜，为原子力显微镜的问世奠定了基础。1986年，徳裔物理学家G.Binnig等人原子力显微镜进行了改良，开始使用微悬臂梁作为探针。1988年，国外开始对原子力显微镜进行改进，激光检测原子力显微镜。1989年，白春礼等人研制出了我国第一台原子力显微镜，并跻身于国际先进行列。原子力显微镜发展历史原子力显微镜工作原理金属表面与针尖的电子云图图AFM的工作原理将一个对微弱力极敏感的微悬臂一端固定，另一端有一微小的针尖，针尖与样品表面轻轻接触，由于针尖尖端原子与样品表面原子间存在极微弱的排斥力，通过在扫描时控制这种力的恒定，带有针尖的微悬臂将对应于针尖与样品表面原子间作用力的等位面而在垂直于样品的表面方向起伏运动。利用光学检测法或隧道电流检测法，可测得微悬臂对应于扫描各点的位置变化，从而可以获得样品表面形貌的信息。原子力显微镜的成像特点具有非常高的横向分辨率和纵向分辨率。横向分辨率可达到0.15nm，纵向分辨率高达0.05nm。原子力显微镜具有很宽的工作范围，可以在诸如真空、空气、高温、常温、低温以及液体环境下扫描成像。样品制备简单。原子力显微镜所观察的标本不需要包埋、覆盖、染色等处理，可以直接观察。原子力显微镜具有对样品的分子或原子进行加工的力行为。（1）小尺寸样品的观察：

适用于观察原子级样品，DNA分子等，在纳米材料科学、分子生物学、仿生学等研究领域有广泛研究。原子力显微镜对表面形貌的观测原子力显微镜的应用沉积于云母片上的抗体分子原子力显微镜，使得学键首次肉眼可见（5月30日《Science》）（2）纳米加工：

利用AFM可以对样品进行表面原子搬运，原子蚀刻，从而制造纳米器件。用AFM针尖移动Si原子形成的IBM文字STM针尖移动原子形成的图形文字（3）测量肿瘤细胞、微生物等的粘附力

（4）测量分子间的作用力，例如抗原抗体结合力、受体配体结合力

（5）DNA互补链间的氢键

二：医学生物化学检验（一）医学生物化学检验（临床检验）医学生物化学检验是以健康和疾病发生时的生物化学过程为研究目的，通过测定组织、体液的成分，揭示疾病变化和药物治疗对机体生物化学过程和组织、体液成分的影响，以提供疾病诊断、病情监测、药物疗效、预后判断和疾病预防有用信息的一门学科。病理生理学免疫学药理学实验诊断学检验学生理学生物化学著名的诺贝尔奖获得者亚瑟·肯伯格在哈佛大学医学院建校100周年时说：“所有的有生命体都有一个共同的语言，这个语言就是化学。”生命的本质是化学自然界所有的生命物体都由三类物质组成：水、无机离子和生物分子。生物分子是生物体和生命现象的结构基础和功能基础，是生物化学研究的基本对象。◆1780-1789Lavoisier（法）研究“生物体内的燃烧”，指出此类“燃烧”耗氧并排出二氧化碳。后人称他是生物化学之父。（二）生物化学发展里程碑Lavoisier（拉瓦锡）◆1830-1842Liebig（德）将食物分为糖、脂、蛋白质类，提出“代谢”一词，证明动物体温形成是食物在体内“燃烧”的缘故。最先写出两本生物化学相关专著。Liebig（李比希）EmilFischer（埃米尔·费舍尔）◆1890－1902Fischer（德）首次证明了蛋白质是多肽；发现酶的专一性，提出并验证了酶催化作用的“锁-匙”学说；合成了糖及嘌呤。1902年获诺贝尔奖。李纳斯·鲍林（LinusPauling）◆1949Pauling（美）指出镰刀形红细胞性贫血是一种分子病，并于1951年提出蛋白质存在二级结构。（1954年获诺贝尔奖）詹姆斯·沃森（JamesD.Watson）◆1953年Watson（美）与Crick（英）提出DNA分子的双螺旋结构模型，1962年共获诺贝尔奖。弗朗西斯·克里克（FrancisH.Crick）弗雷德里克·桑格（FrederickSanger）

◆诺贝尔化学奖(1958年)1955年将胰岛素的氨基酸序列完整地定序出来，同时证明蛋白质具有明确构造。

◆诺贝尔化学奖(1980年)

1975年，Sanger双脱氧链终止法（chainterminationmethod）技术测定DNA序列。1969-1972,Arber(瑞士),Smith(美)与Nathans(美)在核酸限制酶的分离与应用方面做出突出贡献,1978年共获诺贝尔奖。1972Berg（美）在基因工程基础研究方面作出了杰出成果，获1980年诺贝尔奖。1973Cohen等（美）用核酸限制性内切酶EcoR1，首次基因重组成功。HamiltonO.SmithDanielNathansWernerArberPaulBergStanleyCohenHerbertBoyer2001Venter（美）等报道完成了人类基因组草图测序。早在3000年前就有人发现了疾病可引起体液成分的变化。最早注意到的是尿液中的蛋白和糖。18世纪后期，英国医生BenceJones提出了第一个肿瘤标志物。100多年前，有人使用重量分析法对血浆电解质进行分析。直到50年代初，火焰光度计的使用才使电解质的分析方法产生了革命性的变化。1920年开始了对体液酶的分析。70年代，放射免疫分析。初

期（三）生物化学发展的趋势71各种计算机系统控制的全自动生化分析仪以及各种商品化药盒在我国临床实验室广泛应用。21世纪引进生化分析仪的模块化系统，使得生化检验系统概念形成。

气相和高效液相色谱分析使人们能更有效地进行治疗药物的监测，并对体内激素和代谢物水平和成分实施分析。近期：72质谱分析则提供了药物和新生儿代谢异常迅速鉴定的手段。

生物芯片仪器设备的实质是对生物信号进行平行分析：利用微点阵技术，将细胞、蛋白质以及DNA等生物组份在小范围固相基质上进行集中，从而在空间尽量缩小但速度尽量加快的情况下完成传统生物学分析手段。全实验室自动化：把实验室相关或不相关的自动化仪器通过计算机整合系统串联整合，形成自动化的大规模检验过程，使检测作业平台为流水线组合。发展趋势：1：样品盘或样品架样品盘：放置待测样品的转盘，可放置一定数量的样品杯或不同规格的采血试管，通过样品盘的转动来控制不同样品的进样。样品架：随着样品架移动及样品的被检测，可不断追加已放置样品杯或采血试管的样品架；通过样品架的移动能将样品传送到另一个分析模块甚至另一台分析仪上再进行分析。全自动生化分析仪基本结构

转盘式试剂室：内装放置试剂瓶的转盘，一般可放置20种以上具有一定形状的塑料试剂瓶，大型分析仪可放置30-45种试剂瓶。通过试剂转盘的转动来选用不同试剂。

2：试剂室和试剂瓶试剂架式试剂室：可放置容量为250ml-500ml的任意形状的试剂瓶，试剂瓶不能转动，但每个试剂瓶内引出一条试剂管路及其喷嘴，即每种试剂均有专用的加试剂装置，因而不同试剂间无交叉污染。

但试剂管路较长使试剂存在一定的死体积，因而适宜用于使用频率高、消耗试剂量大的检测项目。3：反应杯和反应盘是样品与试剂进行化学反应的场所，同时用作比色杯。由透光特性好的硬塑料或石英玻璃制成。比色杯光径不同分析仪有0.5-0.7厘米不等，大多数分析仪在计算时将其折算为1厘米光径。由取样针、取样臂、取样管路、取样注射器和阀门组成，能定量吸取样品或试剂并加入到反应杯（盘）。

4：取样和加试剂装置多数加样装置设有防撞功能，遇到阻碍时取样针立即停止运动并报警。某些取样针还设有阻塞报警功能，当取样针被样品中的凝块、纤维蛋白等物质阻塞时，机器会自动报警、冲洗取样针，并跳过当前样品，进行下一个样品的取样检测。78

反应杯里的样品与试剂通过搅拌棒搅拌而充分混匀，搅拌棒的形状为扁平棒状或扁平螺旋状，表面的疏水材料能防止反应液被搅拌棒所携带。其工作方式大多为旋转式搅拌，也有震动式搅拌方式。5：混匀与搅拌装置79温控系统使反应杯浸浴在恒温环境：恒温循环水浴方式：温度传递速度快，保养要求较高。恒温空气浴方式：温度传递速度不如恒温水浴循环方式，保养简单。

6：温控和定时系统80自动生化分析仪以紫外可见分光光度法为其中心和主要的检测手段，与一般分光光度计一样，其光路和检测系统由光源、单色器和检测器组成。7：光路和检测系统光源：一般为卤素钨丝灯，也有采用长寿命的氙灯。要求在340～800nm波长范围内能发射出稳定且较平坦的光能。单色器：干涉滤光片（interferencefilter）分光系统：常带有340、380、405、500、550、600、660nm等几种滤光片，各滤光片固定在转盘上，以转盘旋转的方式来选择波长。检测器：由光敏二极管及放大电路组成，可按设定的间隔时间连续测定各反应杯的吸光度值。81具有多种数据处理功能：计算测定结果判断结果准确性保存各种数据自我诊断功能

8：数据处理系统82

反应杯清洗装置：一个反应杯内的反应和检测结束后，该反应杯就被冲洗系统及时冲洗。清洗过程：由废液针吸取反应杯内废液，加入清洗剂冲洗并抽干后，再经数次去离子水冲洗及抽干，然后做杯空白的吸光度检查，若通过检查则此反应杯可继续循环使用；更高级的仪器带有风干技术。如果不能通过，分析仪将提示该反应杯异常，并跳过此反应杯使用下一个反应杯，或提示更换反应杯。9：清洗系统三：医学成像检测

医学成像技术是借助于某种介质（如X线、电磁场、超声波，放射性核素等）与人体相互作用，用理工学基础理论和技术，把人体内部组织器官的结构、功能等具有医疗情报的信息源传递给影像信息接收器，最终以影像的方式表现出来，提供给诊断医生，使医生能根据自己的知识和经验对医学影像中所提供的信息进行判断，从而对病人的健康状况进行判断的一门科学技术。

从1895年德国物理学家伦琴发现X光并由此拍出世界上第一张伦琴夫人手部的X线透视照片以来，医学影像技术从无到有、从不完善到功能齐全、分类精细，经历了一个１0０多年的发展过程。（一）医学影像技术发展历程1、1895年11月8日，德国物理学家伦琴在做真空管、高压、放电实验时，发现了X射线，并用于临床的骨折和体内异物的诊断。

※

1896年，德国西门子公司研制出世界上第一支X线球管。

※20世纪10-20年代，出现了常规X线机。

※20世纪60年代中、末期形成了较完整的放射诊断或放射学学科体系。第一张X线照片伦琴2、1971年，世界上第一台用于颅脑的CT扫描机（计算机人体断层摄影术）由柯马克(A.M.Cormack)和郝恩斯费尔(G.N.Hounsfield)首次研制成功。1979年因此项技术的发明，柯马克、郝恩斯费尔获得了生理与医学诺贝尔奖。世界上第一台4层CT扫描机豪恩斯费尔德

CT机的分代主要以其Ｘ线管和探测器的关系、探测器的数目、排列方式以及Ｘ线管与探测器的运动方式来划分。到今天为止CT经历了5代发展，第6代CT正在研发中。（1）第1代CT机只有一个探测器，扫描角度为1º，扫描时间270s/层。仅用头部的扫描,图像质量差,以平移加旋转的扫描运动方式进行,称为平移/旋转型。（2）第2代CT机探测器的数目增加5～20个左右，X线束呈扇型，扫描角度增加为360º,扫描时间仍较长,一般在20s～1min/层，扫描方式为窄扇形束扫描平移-旋转方式。（3）第3代CT探测器数目一般多超过100个，有的接近1000个，X线扇形束扩大到40º～50º，足以覆盖人体的横径,这样扫描就不需要再平移，而只需要旋转就可以了,故称为旋转/旋转型。扫描时间一般均在几秒钟,最快速度0.5s，实现了亚秒级扫描。（4）第1代到第3代CT机的X线管和探测器都是同步旋转的，而第4代CT机与之不同，探测器呈360º环状固定排列在机架内(目前有的机型多达4800个探测器)，X线则围绕人体和机架作360º旋转,把第4代称固定/旋转型(螺旋CT属此型)。（5）第5代CT机与第1到第4代CT机不同，在成像过程中X线管不需环绕机架作机械运动，它是用电子束方法产生旋转的X线源,再穿透人体由探测器接收,这种CT机称为电子束CT,也称超高速CT，特点是扫描速度很快,50～100