0毛煜-毒代动力学在新药临床前安全性评价中的应用

13三月20240毛煜毒代动力学在新药临床前安全性评价中的应用Non-clinicalsafetyevaluation急性毒性试验(acutetoxicity)长期毒性试验(chronictoxicity)特殊毒性试验(genotoxicity、reproductive、carcinogenicity)其他毒性(Allergic、stimulate、hemolysis)TGN1412试药人注射新药后出现严重过敏反应Extrapolation？SpeciesdifferentinADMEattoxicitydoseAbsorptionDistributionMetabolismExcretiontoxicokineticsDoseToxicity一、什么是毒代动力学？（概述）二、毒代动力学的试验设计三、伴随毒性试验的不同领域的毒代动力学四、TK研究的具体实例

毒代动力学

一、什么是毒代动力学？（概述）

伴随（concomitant）毒代动力学Toxicokinetics=Toxikon+kinesis毒代动力学（Toxicokinetics）的定义毒代动力学是药代动力学在全身暴露评价中的延伸，为非临床毒性研究的一个组成部分，或为某一特殊设计的补充研究。研究结果可用于阐明毒理学发现及其与临床安全性的关系。ICHTopicS3―Toxicokinetics:AGuidanceforAssessingSystemicExposureinToxicologyStudies有关毒代动力学的指导性文件InternationalConferenceonHarmonisationofTechnicalRequirementsforRegistrationofPharmaceuticalsforHumanUse我国SFDA（国家食品药品监督管理局药品评审中心）有关毒代动力学的指导性文件研究目的描述在动物上造成的全身暴露；暴露水平与毒理学结果之间的关系；支持动物种属、给药方案的选择；评价动物结果与临床安全性的相关性药物系统循环中的药物浓度吸收药物在组织中的分布作用部位的药物浓度药物的代谢或排泄分布消除药理活性临床疗效药效毒性药物代谢动力学的研究Pharmacokinetics~Toxicokinetics

Differentgoals

PK-ADMEproperties

TK-safetyassessment

Differentdose药物溶解性：由于毒代动力学研究时采用的高给药剂量所导致的给药问题，更严重的情况：动物体液或组织器官产生药物沉淀所导致的特殊毒性。药物稳定性：高剂量所导致的药物稳定性的改变以及可能的降解等问题。药物吸收：药物吸收在毒代动力学研究中的高剂量给药下可能出现药物在胃肠道的溶解度下降而影响药物的吸收。首过效应或系统前清除：机体的系统前清除是酶依赖性的过程，因此，在高剂量下会出现饱和。技术层面上的问题：4.血浆蛋白结合率：药物与血浆蛋白的结合是可逆的，且有饱和性，因此，在毒性剂量下，药物的分布和组织通透性会受到影响，产生不同于药代剂量下的血浆浓度-药效相关性的情况。代谢：由于代谢是依赖酶的反应，它与底物的浓度相关。因此，在毒性剂量下，药物的体内代谢途径和代谢活性可能发生改变。肾清除：肾清除既有饱和又有非饱和的作用机制的参与，且受循环药物浓度的影响大，毒性剂量可能影响肾脏清除药物的能力，特别是仅从肾脏排泄，且有主动排泄机制的药物。TK须遵循GLP原则在开展毒代动力学研究时应遵循以下原则：遵照GLP的要求开展毒代动力学研究所用的分析方法可靠实验设计合理应结合毒理学和药动学研究结果对毒代动力学研究结果进行综合分析和评价，同时应注意具体问题具体分析毒代动力学研究规范★实验要求在GLP规范下进行受试物给药样品样品处理LC-MS/MS分析二、毒代动力学的试验设计要点

1.分析方法★药物浓度测定方法的技术要求与药代动力学研究相同(专属性好灵敏度高)MethodvalidationRobustandreliablemethodReproducibilityAccuracySpecificitySensitivitySpecificitySensitivityAccuracySpecificitySensitivityReproducibilityAccuracySensitivityReproducibilityAccuracySpecificitySensitivityReproducibilityAccuracy气相色谱法（不常用，用于挥发性好、耐热的化合物检测）高效液相色谱法（连接紫外或荧光检测器，具有经济、简单的特点，但专属性较差）液相-单级质谱联用检测液相-串联质谱联用检测（灵敏度高，特异性好，能同时获得可靠的定性定量结果）毛细管电泳法（适用于蛋白质等的定量分析）毒代生物样品的分析方法毒代动力学与药代动力学一样，要求建立灵敏度高、特异性好的血药浓度测定方法，测定方法的建立和确证应按照药代动力学有关技术要求进行。方法学验证稳定性（stability）考察了解待测药物和内标物在不同pH、光照、溶剂、温度条件下稳定性。生物样品中药物的稳定性包括室温、冷藏（2～8℃）、冻融、冷冻（-20～-70℃）、进样盘中放置的考察，可参考药代动力学的实验结果。灵敏度：最低定量下限（LLOQ）

应满足日内准确度和精密度<20%。根据药物体内药物浓度确定,一般为3～5个半衰期或峰浓度的1/10～1/20。生物样品基质干扰（matrixeffect）的考察

应考察生物样品基质对待测物检测的干扰程度。如全血、血浆或血清等常用生物样品的内源性干扰。选择性（selectivity）的考察内源性物质、药物的代谢物、可能的合并用药及中药中其他组分不干扰分析。提供对照品、空白生物样品、空白生物样品加对照品及用药后的生物样品色谱图。A空白血浆样品B空白血浆样品中加入内标化合物C空白血浆样品中添加标准品D毒代血浆样品标准曲线（standardcurve）及线性关系

应分别制备药物在不同生物样品（如血浆、全血、尿、组织匀浆）中的标准曲线。每条标准曲线一般需6～7个浓度点，每个浓度点2～3个平行样。线性范围应覆盖整个生物样品的浓度范围，浓度超过最高检测上限（ULOQ）的样品应进行适当的稀释。标准曲线的相关系数应大于0.99。y=0.0076+0.0109X,r=0.9999,n=7(duplicateforeachpoint),weighingfactor:1/xLC-02concentrationinplasma,ng/mLPeakarearatio方法精密度与准确度

精密度包括日内精密度和日间精密度，一般要求应选取工作曲线低、中、高三个浓度进行考察，每个浓度需4～5个平行样。日内和日间的精密度应满足相对标准误（relativestandarddeviation，RSD%）<15%,在LLOQ浓度点附近应满足RSD%<20%.准确度一般用相对回收率（recovery，%）表示，选取低、中、高三个浓度点进行考察，每个浓度需4～5个平行样。日内和日间的准确度应满足<15%,在LLOQ浓度点附近应满足<20%.样品稀释倍数（dilutionfactor）的准确度考察超出标准曲线浓度范围的生物样品须经稀释后重新进样分析。样品稀释的倍数需经过验证后方能应用。进样残留（carryover）的考察

在分析完标准曲线最高检测上限（ULOQ）样品后立即设定运行一个空白样品来考察方法的进样残留。进样残留应尽可能小。2、TK研究的参数药时曲线下面积AUC(areaunderconcentration-timecurve)

－吸收程度，暴露Cmax（血药达峰浓度）Tmax（达峰时间）

－吸收速度，暴露t1/2（血浆消除半衰期）吸收速度不同-毒性不同血药浓度最小中毒浓度(MTL)最小有效浓度(MEL)时间其他参数F:BioavailabilityCss：Cl:Vd:

时间血药浓度AUC非静脉

AUC静脉

毒代动力学研究的评价蓄积：化学物或/和代谢产物在体内进行性增加。蓄积受给药时间间隔和该化学物半衰期的影响。线性动力学（linearpharmacokinetics）：药物在体内的转运和消除速率常数呈现为剂量或浓度非依赖性，表现为血药浓度或血药浓度-时间曲线下面积与剂量呈正比。非线性动力学（linearpharmacokinetics）：由于药物代谢和肾排泄所涉及的酶和载体具有可饱和性，药物在体内的转运和消除速率常数呈现为剂量或浓度依赖性，此时药物的消除呈现非一级过程，药物半衰期、清除率等不为常数，AUC、Cmax等不与剂量成正比变化。3、动物◎避免单独的毒代研究◎动物种属的选择Casestudy-动物选择不当56种属代谢差异的考虑CompoundDM1M2(active)Enzyme1Enzyme2毒代动力学研究中药物代谢产物的测定当药物为前药，体内产生药效的是其代谢产物。当药物在体内转化成具有药效或毒性的代谢产物。当药物在体内被广泛代谢，在血浆或组织中只能通过测定其代谢产物来反映给药后体内的暴露水平。4、给药剂量的设计低剂量：无毒性反应剂量,应超过药效学剂量下的暴露量。中剂量：低剂量暴露的合适倍数和高剂量暴露的合适分数。高剂量：主要通过毒性反应来判断,如吸收饱和则不再增加剂量。Dose(毒性剂量)-Exposure(剂量暴露)关系Lackofdose-AUCproportionality-剂量设计Transporters对药物ADME的影响uptakeexcretioneffluxexcretionreabsorptionabsorption肝肾胃肠道5、给药方案★Antiviralagent:

3equallydividedose（tid）1dose（qd）1-monthstudyinmonkey三、伴随毒性试验的不同领域的毒代动力学主要毒性试验内容急性毒性试验

长期毒性试验遗传毒性试验生殖毒性试验致癌试验组织分布试验不同领域毒代动力学（1）急性毒性试验毒性研究早期进行由暴露速度和暴露程度预测毒性提供长期毒性实验方案设计的依据剂型不同领域毒代动力学（2）长期毒性实验动物选择符合药效要求多剂量设计毒性研究与毒代研究同步设计并实施第一天暴露量与最后一次暴露量的比较稳态浓度与AUC长期给药后AUC的变化-降低010203040AUC540200剂量（mg/kg）第1天010203040AUC540200剂量（mg/kg）第1天第30天长期给药后AUC的变化-降低010203040AUC540200剂量（mg/kg）第1天第30天第90天InductionofCYPenzymeTransporters长期给药后AUC的变化-降低长期给药后AUC的变化-升高Longhalf-lifeInhibitionofCYPTransporter不同领域毒代动力学（3）组织分布实验（ICH原则）单剂量分布实验为临床前药物安全评价的基础实验多剂量分布实验必要■器官组织蓄积■稳态浓度高■靶器官毒性明显或特异分布■开发靶向释放药物exampleBumetanide(高效利尿药）20mg/kg(rat):ineffective

0.015mg/kg(human):producingdiuresis

3%ofdrugexcretedinurineforrat,66%inurineforhuman

不同领域毒代动力学（5）遗传毒性的毒代研究遗传毒性阴性的药物测定组织浓度测定骨髓浓度测定血药浓度不同领域毒代动力学（6）生殖毒性中的毒代研究注意动物在妊娠期和授乳期与正常动物的差异重点研究胚胎毒性和对子代的影响采集母体、胎子和新生子，测定浓度和暴露量不同领域毒代动力学（7）致癌实验中的毒代研究用药3个月的药物必须进行致癌实验（JAPAN）用药6个月的药物必须进行致癌实验（USA，EEC，ICH）不同领域毒代动力学（9）生物技术药物的毒代研究一般化学药物的毒代研究程序不适用与生物技术药物免疫的介入影响药代和毒代过程动物选择应考虑免疫的介入放射性标记物对结果的误导ExposureandDosageratiosRatDogReproductiveToxicologyNOAEL(mg/kg/day)100mg/kg/day50mg/kg/day30mg/kg/dayExposureratio(AUCanimals/AUChumans)*1.11.50.3Dosageratio*(mg/m2)4.16.81.2Dosageratio*(mg/kg)2012.57.5*Humandoseof200mg;AUC10.2g•h/mL剂量比值AUC比值MTD人/LD10小鼠MTD人/LD10小鼠

阿扎胞苷6.01.1阿霉素5.00.8安丫啶0.81.3塞替派0.41.0顺铂2.21.3氟达拉宾0.10.1双氢阿扎胞苷0.20.3exampleAntipsoriaticagentTwoformulations:0.1%,1%cream10-foldmarginofsafety0.1%cream:141ngeq.hr/ml33%absorption1%cream:838ngeq.hr/ml19%absorption0.1%cream,5g/day四、TK的应用实例种属间异速增长尺度律

SpeciesAllometricScaling具体实例Almosttoogoodtobetruemouse-to-elephant曲线MaxKleiber(1932)."Bodysizeandmetabolism"].Hilgardia

6:315–351.1、TK支持临床I期剂量选择具体实例Anti-viralcompound：AZT5mg/kg/day:8~10%increaseofRBC,AUC:6μg.hr/ml→tox-endpointEquations:AUC(monkey)=F(m)×D(m)/CL(m)

AUC(human)=F(h)×D(h)/CL(h)AllometryapproachActualexposureinhuman

Dose(huamn)=5mg/kg×[0.3L/hr/kg/0.9L/hr/kg]=1.7mg/kg/day2.Sophocarpine（SC）的Beagle犬毒代动力学研究LC-MS/MS法定量分析SC（内标法）具体实例LC-MS/MS色谱图标准品空白犬血浆空白犬血浆添加标准品毒代血浆样品血浆样品前处理-不同提取溶剂提取效率的比较Liquid-liquidextraction具体实例基质效应的考察92.8%94.4%84.8%87.9%1.考察了不同提取溶剂对基质效应的影响。2.考察了内标化合物对待测化合物受基质影响的随动性。具体实例稀释倍数的考察准确性和精密度的考察具体实例SC毒代研究-90天长期毒性试验犬体内暴露情况具体实例SC毒代研究-90天长期毒性试验毒代参数1.采血时间点的频度足以评价SC在犬体内的暴露水平。2.雌雄无明显差别。在考察的剂量范围内呈现线性药动学特征。提示无明显的药物消除的饱和或药物代谢酶的诱导和抑制现象出现。具体实例3.ToxicokineticsappilicationinthedevelopmentofPNU-101017ToxicokineticsinDrugDevelopment:AnOverviewofToxicokinetic

ApplicationintheDevelopmentofPNU-101017,anAnxiolyticDrug

Candidate具体实例severalquestionswereaskedWhatisthemechanismofdeath?IsthetoxicityofPNU-101017mediatedbythedrugeffectsonthecentralnervoussystem?Willthetargetorganexposure,suchasbrain,bemorerelevanttothetoxicitythanthesystemiccirculation?Willthespeciesdifferencesinproteinbindingleadtothedifferenceinlethalserumconcentrationsbetweendogsandrats?Istheremarkedspeciesdifferenceinsensitivitytothetoxiceffectsinadditiontospeciesdifferencesinexposure?ComparisonofPNU-101017serumconcentration-timeprofilesinthedogfollowing40mg/kg/dayoraladministration(●)andcontinuousivinfusionatarateof360mg/min/kg(21mg/h/kg)(■)ofPNU-101017.

Dog：死亡时血药浓度7-11μgPNU-101017serumconcentrations-timeprofiles(left)orCSFconcentration-timeprofiles(right)inthedog(●)andmonkey(□)followingacontinuousintravenousinfusion(n=3).Dogswereinfusedat360mg/min/kgfor2to3hoursandmonkeyswereinfusedat310mg/mlfor4hoursfollowedby410mg/min/kgfor5hserumCSFPNU-101017Serum,BrainandCSFConcentrationsatLethalityintheDogandMonkeyfollowingContinuousIntravenousInfusionofPNU-101017*

RelationshipofPNU-101017CSF/SerumconcentrationsratioversustimeinBeagledogs(●)andCynomolgusmonkeys(□)followingcontinuousintravenousinfusion(n=3).

RelationshipofClinicalSignsandPNU-101017ConcentrationsinSerumandinCSF

SteepdoseresponseSerumconcentration-timeprofilesofPNU-101017(□)andPNU-172256(●)inthedog(n=4)followingintravenousinfusionofaPNU-101017solutionat360mg/min/kgfor4hwithsupportiverespirationviaaventilatorusingpureoxygen.

Bloodsampleswerecollectedupto72haftertheinitiationofinfusion.

ComparisonofPharmacokineticsofPNU-101017inmdr1a(-/-)-andmdr1a(+/+)Mice*

BloodBrainBarrierCONCLUSIONSThetoxiceffectsofPNU-101017developedrapidly,showin