高三生物二轮复习讲义非选择题5：借用实验设计思路破解生物工程题目

高三生物二轮复习非选择题专项突破

借用实验设计思路破解生物工程题目

【真题剖析】

（2022∙山东等级考）某种类型的白血病由蛋白P引发,蛋白UBC可使P被蛋白酶识

别并降解,药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗

该病的机理,需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-PΔoPΔ是缺失特

定氨基酸序列的P,FLAG是一种短肽,连接在P或PA的氨基端,使融合蛋白能与

含有FLAG抗体的介质结合,但不影响P或PA的功能。

⑴为构建重组载体,需先设计引物,通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基

因的引物需满足的条件是____________________________________________,

为使PCR产物能被限制酶切割,需在引物上添加相应的限制酶识别序列,该限制

酶识别序列应添加在引物的（填“3端”或“5端”）。

（2）PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后,与编码FLAG的序列形成一个

融合基因,如图甲所示,其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载

体导入细胞后,融合基因转录出的mRNA序列正确,翻译出的融合蛋白中FLAG的

氨基酸序列正确.但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析,出现该问题

的原因是_________________________________________________________o

修改扩增P基因时使用的带有EcoRI识别序列的引物来解决该问题,具体修改方

案O

ECORlBamW1

重组载体

的部分结P基因I终止了∙1

放大I编码FLAG的序列Z、τ

L…生。RLi.VafflHI

DNMM码链ATGGAC-AAGGCGAATTCATGTGCA--GGATCCb

氨基酸序列MelIASP…L词AlaAsnSerCysAlaGlySer

FLAG

注：DNA编码链为转录时所用模板链的互补链

甲

(3)融合蛋白表达成功后,将FLAG-P.FLAG-PΔ.药物A和UBC按照图乙中的组

合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质,分离出与介质

结合的物质并用UBC抗体检测,检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-PΔ

不能降解UBC,由①②③组结果的差异推测,药物A的作用

是；由②④组或③⑤组的差异推

测,PA中缺失的特定序列的作用是.

①②③④⑤注：

“+”表示有

FLAG-P-十+

FLAG-PΔ++表示无

药物A

+÷①②③④⑤

UBC+++++UBC——

乙丙

⑷根据以上结果推测,药物A治疗该病的机理是

［答题模板］以实验设计的思路,梳理题目信息

项目内容

目的利用基因工程探索药物A治疗由蛋白P引发的白血病的机理

①将P基因或P△基因插入含编码FLAG的序列的载体中.获得含融合基

因重组载体,将该重组载体导入细胞后使其正确表达,即可获得融合蛋

原理白。

②利用抗原一抗体杂交技术检测者样品中含有FLAG,它们就会被含

FLAG抗体的介质滞留;用抗UBC的抗体检测介质中的UBC含量,若出

现UBC的条带,说明FLAG-P或FLAG-P△能与UBC结合

⑴设计弓I物利用PCR技术扩增P基因。设计的引物需能与P基因模板

链的一段碱基序列互补配对

⑵将P基因插入载体,与编码FLAG的序列形成融合基因。为了使P基

因能与载体连接,需在引物的5,端添加限制酶识别的序列

⑶将重组载体导入细胞并使其表达融合蛋白。由图甲可知,由于EaR1

操作识别序列的添加,P基因编码链的第一个碱基与Ec“Rɪ识别序列的最后

步骤两个碱基编码一个氨基酸,导致mRNA的密码子被错位读取。因此可在

引物中的EcoR1识别序列3端添加1个碱基解决此问题

(4)将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照不同组合分成图乙所示

①~⑤五组,分别流经含FLAG抗体的介质,分离出与介质结合的物质并

用UBC抗体检测,以此确定P是否能结合UBC,以及药物A对P与UBC

结合的影响

按照单一变量原则对图丙结果进行分析:①和②单一变量是有无FLAG,

检测两组对比可知UBC能与P结合并通过FLAG滞留在介质处;②和③单一

结果变量是有无药物A,两组对比可知药物A能促进UBC与P的结合;②和

分析④或③和⑤的单一变量为是否缺失P中特定氨基酸序列,通过对比可知

P中特定氨基酸序列参与P与UBC的结合

结论药物A通过增强P与UBC结合促进P降解

1.题目特点毗类试题往往为“任务驱动型”,围绕实现某T弗或实验目

模板

的过程中使用的工程技术、原理、以及最终结果分析和应用设置一系列

构建

问题。

2.答题模板:此类试题中涉及的工程技术和原理一般为达成最终的目的

服务,因此可借助实验设计的思路,梳理并理解题目中涉及的工程技术流

程,并结合题目相关信息和工程技术原理进行分析作答。

3.关键点:明确题目中为答成任务目标而涉及的工程技术、原理以及实验

分析方法

答案：(1)能与P基因母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸5端

(2)P基因编码链的第一个碱基与ECoR1识别序列的最后两个碱基编码一个氨基

酸,导致mRNA的密码子被错位读取在引物中的Ec。RI识别序列3,端添加1

个碱基

⑶增强FLAG-P与UBC的结合参与P与UBC的结合

(4)通过增强P与UBC结合促进P降解

［评分细则］规范答题不失分

评分细则答题规则

(1)4分。第一空2分,能与P基因母链的一段碱基序列互补规则L尽量使用课

配对的短单链核酸。只答出“短单链核酸”得1分;第二空2本中的语句作答。

分5端。规则2.生物学名词

(2)4分。第一空2分,P基因编码的第一个碱基(或A)与EcoR要书写正确。

I识别序列的最后两个碱基(或TC)编码一个氨基酸,导致规则3.答题要完

的RNA的密码子被错位读取(其他相同含义的描述也可)；整、全面。

第二空2分,在引物的EcoRI识别序列3端添加1个碱基。规则4.理由的得出

(3)2分。第一空1分,增强(或加强、促进)FLAG-P(或P)与应根据实验结果，

UBC结合;第二空1分,参与P与UBC的结合(作用)或P与并且答题符合逻辑

UBC的结合(作用)位点。

(4)2分。药物A通过增强P与UBC结合(作用)促进P降

解,或答成药物A能促进药物P降解。其他答案不得分

【典例训练】

L某地中海贫血(TDT)是单基因病,严重时可能危及生命。人类γ基因启动子上游

的调控序列中含有BCLllA蛋白结合位点,该位点结合BCLllA蛋白后,γ基因

的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列,解除对Y基因表达的抑制,可对TDT

患者进行基因治疗。科研人员扩增了Y基因上游不同长度的片段,将这些片段分

别插入表达载体中进行转化和荧光检测,以确定BCLIlA蛋白结合位点的具体位

置。相关信息如图所示。

调控序列及启动子，基因

∖R

IIIIIIIIIIIIIIIIIIIII■;

FiF2F7I

xho↑MunlSalX终止子

载体的终止子荧光蛋白基因PBdll/基因

部→分结f构⅜⅜L,≠.\⅞人/_-

Nhe[ECORlΛ⅛∏IfcoRIXhd[终止子

注:

FI〜F7、R:引物

P：雌激素诱导下发挥作用的启动子

限制酶识别序列及切割位点：

I

MιuΛ:CAATTG

1

Xho[:CTCGAG

ECORl:GAATTC

I

Saiτl:GTCGAC

Nhe{：3CTAGC

(1)图中启动子是识别和结合位点,且启动子是具有方向性

的,目的基因只有正确插入启动子和终止子之间才能正确表达。在表达载体中绿

色荧光蛋白基因作为,要使绿色荧光蛋白基因表达出来,图

b中还缺启动子,请判断即将插入的启动子方向(填“向左”

或'向右”)。

(2)PCR扩增γ基因上游不同DNA片段的原理是__________________,为使

PCR反应体系中的模板解链为单链,需要满足的条件是o

(3)将扩增后的产物定向插入载体指导绿色荧光蛋白基因表达,需要在引物末端添

加限制酶识别序列。据图可知,在R末端添加的序列所对应的限制酶应

为在F1~F7末端添加的序列所对应的限制酶

是O

(4)从产物扩增到载体构建完成的整个过程中,除限制酶外,还必须用到的工具酶

有DNA连接酶和,其中前者催化形成的化学键

是O

(5)将构建的载体导入除去BCLIM基因的受体细胞,成功转化后,含Fl~F6与R扩

增产物的载体表达荧光蛋白,受体细胞有荧光,含F7与R扩增产物的受体细胞无

荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是.

(6)向培养液中添加适量的雌激素,含Fl~F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光,

而含F5-F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若Y基因上游调控序列上与引

物序列所对应的位置不含有BCLllA蛋白的结合位点序列,据此结果可推

MBCLIIA蛋白结合位点位于o

【解析】(1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点,用于基因的转录。绿色荧光

蛋白基因作为表达载体中的标记基因。要使绿色荧光蛋白基因表达出来,图b中

还缺启动子.即将插入的启动子方向向左。(2)PCR扩增的原理是DNA双链复制。

在体外利用PCR技术扩增目的基因时,利用DNA的高温变性加热至90~95C破

坏双链之间的氢键,使DNA解链变为单链。⑶据图中对限制酶的注释可知,限制

酶I识别切割后的黏性末端与限制酶EcoRI识别切割后的黏性末端相同,

故R末端添加的序列所对应的限制酶是Ec。RIo在Fl~F7末端添加的序列所

对应的限制酶是SHI。(4)从产物扩增到载体构建完成的整个过程中,除限制酶外,

还必须用到的工具酶有DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶,DNA连接酶作用的

对象是磷酸二酯键。(5)只有扩增产物中含有完整的启动子,荧光蛋白基因才能表

达,含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是F7与R扩增产物不含完整的

启动子,荧光蛋白基因不表达。(6)向培养液中添加适量的雌激素,此时重组载体上

的BCZJIA基因表达产生BCLIIA蛋白,BCLlIA蛋白与BCLlIA蛋白结合位

点结合后,导致荧光蛋白基因被抑制;含Fl~F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧

光,则说明BCLllA蛋白结合位点在引物F4与引物R之间的序列上,含F5~F6与

R扩增产物的受体细胞仍有荧光,则说明BCLIlA蛋白结合位点在引物F5的上游

序列,故据此结果可推测,BCLlIA蛋白结合位点位于引物F4与F5在调控序列上

所对应序列之间的区段上。

答案:(1)RNA聚合酶标记基因向左

(2)DNA双链复制加热至90~95℃

(3)ECORISalI

(4)耐高温的DNA聚合酶磷酸二酯键

⑸F7与R扩增产物不含完整的启动子,荧光蛋白基因不表达

(6)引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上

2.金黄色葡萄球菌是食源性致病菌,随着抗生素的大量使用,金黄色葡萄球菌的耐

药性越来越强,给临床治疗带来了极大的困难。已知金黄色葡萄球菌的耐盐性高,

并能够利用甘露糖醇产酸,从而使溪麝香草酚蓝溶液变黄。某兴趣小组对生鲜肉

中金黄色葡萄球菌进行了分离、鉴定,过程如图所示。

生鲜肉I邀整八取上清液.喔

高盐液高盐平板1

高盐平板2高盐液体培养基

⑴培养基的营养物质一般都含有等。高盐平板2能够鉴

定金黄色葡萄球菌很Il该平板与高盐平板1相比,还需添加,

并选取使培养基呈色的菌株进行保存或进一步实验。

⑵高盐平板2的接种方法是,用此方法计数时,所得的菌落数比

活菌数目偏少,原因是_____________________________________________________

(3)抑菌圈是指利用待测药物在琼脂平板中的扩散,使其周围的细菌生长受到抑制

而形成的透明圈。为检测金黄色葡萄球菌的抗药性,将浸有不同抗生素且大小相

同的纸片分别贴附在涂有金黄色葡萄球菌的平板上,培养一段时间后,结果如图所

①头抱嗖林］「②头抱曲松

④氧氟沙星」L③诺氟沙星

由图可知,该菌对抗生素（填序号）的抗性最强。如果隔一段时间后在抑菌

圈中又长出少许菌落,分析其原因可能有（至少写出两

种）。

【解析】（1）培养基的营养物质一般都含有水、无机盐、氮源、碳源。结合题意“金

黄色葡萄球菌的耐盐性高,并能够利用甘露糖醇产酸,从而使溪麝香草酚蓝溶液变

黄”可知,高盐平板2能够鉴定金黄色葡萄球菌,该平板属于鉴定培养基,故应添加

甘露糖醇和溪麝香草酚蓝溶液;在该培养基上金黄色葡萄糖球菌可以利用甘露糖

醇产酸从而使溪麝香草酚蓝溶液变黄,故应选取黄色的菌株进行保存或进一步实

验。（2）据图可知,高盐平板2上的菌落均匀分布,该接种方法是稀释涂布平板法；

稀释涂布平板法计数时,当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个

菌落,故用此方法计数时,所得的菌落数比活菌数目偏少。⑶据图可知接种头抱理

林的培养基中的抑菌圈最大,即表明头泡唾林对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最强,

而④氧氟沙星的抑菌圈最小,说明该菌对其抗性最强。如果隔一段时间后在抑菌

圈中又长出少许菌落,原因可能是该菌产生了抗性突变;落入了杂菌;抗生素失效。

答案：（1）水、无机盐、氮源、碳源甘露糖醇和溪麝香草酚蓝溶液黄

（2）稀释涂布平板法当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个

菌落

⑶④该菌产生了抗性突变;落入了杂菌;抗生素失效

3.研究发现增强子是基因转录的调控序列,它可以位于基因的上游,也可以位于基

因的下游。人肺特异性X蛋白基因（LUNX基因）仅在上颗、鼻咽和气管等呼吸道

部位表达,可作为非小细胞肺癌诊断的标志物。为了研究LUNX基因的增强子是

否具有促进基因表达的功能,以及其发挥作用的位置是位于基因的上游还是下游,

科研人员首先通过PCR技术扩增了LUNX基因的3个增强子片段(E1~E3),然后

分别连接到pGL3质粒中荧光素酶报告基因(NC+)的上游或下游,最后通过检测荧

光素酶的活性进行判断。

iitfι弓海

引物3,引物4

图1EI片段

图2pGL3质粒

(1)通过PCR扩增LUNX基因的增强子片段时,需要在反应体系中添加引物的原因

是o扩增El片段时,需选用图1中的引物,

为了将El片段与pGL3质粒相连,应在引物的端添加限制酶切割位点。

(2)构建含LUNX基因增强子的重组载体时,需要对通过⑴获得的PCR产物和图2

中的pGL3质粒分别进行双酶切,这样做的目的是,最终构

建出种重组载体。

(3)已知荧光素酶报告基因(L"c+)的表达强度越高,荧光素酶的活性越高,该实验中

各组荧光素酶活性的检测结果如图所示。

工0

迪

运Z5

建Z0

瞩L5

米L0

档

5

0.0

根据实验结果推测,在E1-E3中促进基因表达的功能最强。

E1~E3发挥作用的位置不同之处在于o

【解析】⑴通过PCR扩增LSVX基因的增强子片段时,需要在反应体系中添加引

物的原因是耐高温的DNA聚合酶不能从头开始合成子链,只能从引物的3,开始子

链的延伸。扩增El片段时,结合子链延伸的方向以及目的基因的位置可确定需选

用图1中的引物2和3,为了将El片段与pGL3质粒相连,应在引物的5,端添加限

制酶切割位点,从而为目的基因的切割做准备。⑵构建含LUNX基因增强子的重

组载体时,需要对通过⑴获得的PCR产物和图2中的pGL3质粒分别进行双酶切，

这样可以将E1~E3定向连接到LMc+的上游或下游,避免自连和反向连接,最终根据

目的基因的种类和连接部位构建出6种重组载体。(3)题图中显示El增强子位于

下游时,荧光素酶活性最高,说明此时荧光素酶的表达量最大,因此可以推测,在

E1~E3中,El促进基因表达的功能最强,且在下游效果最好。根据相关数据可以看

出,E1~E3发挥作用的位置不同之处在于El和E2只在基因的下游时增强基因的

表达,E3在基因的上游和下游时都能增强基因的表达。

答案：(1)耐高温的DNA聚合酶不能从头开始合成子链2和35'

(2)将E1~E3定向连接到的上游或下游6

⑶ElEl和E2只在基因的下游时增强基因的表达,E3在基因的上游和下游时

都能增强基因的表达

4.β-l,3葡聚糖酶可以水解许多病原真菌细胞壁外层的β-l,3葡聚糖和几丁质,降解

真菌细胞壁,从而抑制真菌的生长与繁殖。研究人员在植物中克隆到β-l,3葡聚糖

酶基因(BG2)并转入苹果主栽品种,以减少苹果真菌病害、实现无公害生产。回答

下列问题:

masOCSmas

UaS启动子GUSUaSUaS启动子

nos复合后动子Spe∖,

终止子p⅛al

NPTn

（某抗生素

NotIl⅛

抗性基因）\最师

nosnos

启动子

终止子BG2抗病质粒

（I）BG2的克隆可利用PCR技术,该过程需要一对特异性引物,引物是指o

在体外对目的基因进行大量复制后,常采用来鉴定产物。

⑵如图为利用PATC940（由农杆菌Ti质粒改造获得）构建BG2抗病质粒的过程。

图中右下处的酶为,人工设计的复合启动子的作用是。

Xb