高效液相色谱操作步骤1

高效液相色谱1.概述-开展关于色谱别离方法的研究始于1901年，俄国植物学家Tswett〔茨维特〕在研究植物叶子的组成时，用碳酸钙填充竖立的玻璃管，以石油醚洗脱植物色素的提取液，经过一段时间洗脱之后，植物色素在碳酸钙柱中实现别离，由一条色带分散成三种颜色的6个色带。两年后他发表了他的研究成果“一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用”，提出了应用吸附原理别离植物色素的新方法，在这一方法中把玻璃管叫做“色谱柱”，碳酸钙叫做“固定相”，石油醚叫做“流动相”。三年后，他将这种方法命名为色谱法〔Chromatography〕。色谱法于二十世纪五十年代之后飞速开展，并开展出一个独立的三级学科-色谱学。1952年英国科学家阿切尔·马丁、理查德·辛格因创造了分配色谱法而共同获得诺贝尔化学奖，此外色谱分析方法还在12项获得诺贝尔化学奖的研究工作中起到关键作用。1.概述-色谱别离的特点应用范围广复杂混合物，有机同系物，异构体，手性异构体。气相色谱：沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分析。液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的别离分析。别离效率高假设用塔板理论数来表示色谱柱的效率，每米柱长可达几千至几十万的塔板数，特别适用于极复杂混合物的别离，且通常收率、产率、和纯度都较高。操作模式多样可通过选择不同的操作模式，以适应不同样品的别离。灵敏度高可以检测出μg.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。色谱别离的几个概念所有的色谱别离操作均分为：装柱、上样、层析、洗脱。其中的固定不动的相，称为固定相；携带试样混合物流过此固定相的流体，称为流动相；作为流动相的液体或气体，称为洗脱剂；洗脱时从柱中流出的溶液，称为洗脱液；参加洗脱剂使各组分分层的操作，叫层析，也叫展开。别离原理色谱过程的本质是待别离物质分子在固定相和流动相之间分配平衡的过程，不同的物质在两相之间的分配会不同，这使其随流动相运动速度各不相同，随着流动相的运动，混合物中的不同组分在固定相上相互别离。不同组分在色谱别离过程中别离情况取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等的差异。常用的固定相〔色谱柱填料〕硅胶活性炭离子交换树脂大孔吸附树脂氧化铝凝胶纤维素衍生物环糊精聚丙烯酰胺硅胶：应用广泛，适合各类成分氧化铝：主要用于碱性或中性亲脂性成分，如生物碱、甾体、萜类等活性炭:用于水溶性氨基酸、糖类及苷类聚酰胺：主用于酚类、醌类如黄酮类、蒽醌类及鞣质等成分吸附色谱凝胶过滤色谱离子交换色谱大孔树脂色谱分配色谱色谱别离法吸附色谱物理吸附：硅胶、氧化铝、活性炭为吸附剂进行的吸附色谱；化学吸附：黄酮等酚酸性物质被氧化铝吸附、生物碱被酸性硅胶吸附等；半化学吸附：聚酰胺与黄酮类、醌类等酚性化合物之间的氢键吸附，吸附力较弱，介于物理吸附与化学吸附之间。常用的极性吸附剂：硅胶、氧化铝。常用的非极性吸附剂：活性炭。凝胶过滤色谱〔凝胶渗透色谱、分子筛滤过色谱、排阻色谱〕原理：分子筛作用葡聚糖凝胶〔sephadexG〕羟丙基葡聚糖凝胶(sephadexLH-20)凝胶过滤色谱离子交换树脂法原理：可交换离子与树脂上的交换基团进行离子交换，并被吸附，用适当的溶剂从柱上洗脱下来，实现物质的别离。吸附规律阳离子交换树脂—别离碱性成分阴离子交换树脂—别离酸性成分大孔吸附树脂吸附性和分子筛原理相结合以苯乙烯为母体，二乙烯苯为交联剂〔非极性〕吸附力：范德华力或氢键工艺流程：树脂预处理→树脂上柱→药液上柱→树脂的解吸→树脂的清洗、再生。分配色谱原理：被别离成分在固定相和流动相之间的分配系数不同。正相分配色谱：流动相极性<固定相极性反相分配色谱：流动相极性>固定相极性正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。用的最多，约占60～70％。液相色谱类型高效液相色谱仪的应用1.环境污染物分析：大气、水、土壤和食品中的多环芳烃、多环联苯，阴离子外表活性剂，有机氯农药、有机磷农药，除草剂，酚类胺类，黄曲霉毒素等污染物的别离与鉴定。2.精细化工：在精细化工生产中使用的具有较高分子量和较高沸点的有机化合物，如高碳数脂肪族或芳香族的醇、药物、燃料，工业产品的醛、酮、醚、酸、酯等化工原料，以及各种外表活性物质的别离与测定。3.食品、药品质量分析：药物残留，防腐剂、抗氧化剂、人工合成色素等食品添加剂的别离与测定，保健食品中的成效成分检测，真菌毒素分析等。色谱柱简介正相柱------固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能团胺基团，如〔NH2〕和氰基团〔CN〕的键合相填料。

由于硅胶外表的硅羟基〔SiOH〕或其他极性基团极性较强，因此，别离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相比照固定相低，如正已烷，氯仿，二氯甲烷等。反相柱------固定相通常是以硅胶为基质，外表键合有极性相对较弱官能团的键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲醇、乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保存。

常用的反向填料有：C18〔ODS〕、C8〔MOS〕、C4〔Butyl〕、C6H5〔Phenyl〕等。化学键合相利用化学反响将不同的有机官能团通过共价键键合到载体硅胶外表的游离羟基上而形成的固定相。种类非极性键合相：如键合C18、C8、苯基等，其中十八烷〔ODS或C18〕键合相是常用的代表，可完成HPLC分析任务的80%。中等极性键合相：如键合醚基，可别离能形成氢键的化合物〔如酚类〕流动相反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度

H2O＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜丙醇＜异丙醇＜四氢呋喃

正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜异丙醇流动相的选择原那么①样品易溶，且溶解度尽可能大。②化学性质稳定，不损坏柱子。③不阻碍检测器检测，紫外波长处无吸收。④粘度低，流动性好。⑤易于从其中回收样品。⑥无毒或低毒，易于操作。⑦易于制成高纯度，即色谱纯。⑧废液易处理，不污染环境色谱别离过程理论根底塔板理论由马丁〔Martin〕和欣革〔Synge〕最早提出将色谱柱比作蒸馏塔，把一根连续的色谱柱设想成由许多小段组成。在每一小段内，一局部空间被固定相占据，而另一局部空间充满流动相。组分随流动相进入色谱柱后，就在两相间进行分配。在每一个塔板内组分分子在固定相和流动相之间形成平衡，随着流动相的流动，组分分子不断从一个塔板移动到下一个塔板，并不断形成新的平衡。一个色谱柱的塔板数越多，其别离效果就越好。柱效率实际工作中，塔板数的计算用以下公式：

而理论塔板数的计算公式为：

n=L/H其中L为色谱柱的柱长；H为理论板高度。考虑到组分在死时间内不参与柱内分配，用调整保存时间代替保存时间，得有效塔板数和有效塔板高度：保存时间〔tR〕：从进样到某个组分的色谱峰顶点之间的时间间隔死时间〔tM〕：不被固定相滞留的组分从进样开始、通过色谱柱、到出现峰最大值所需要的时间。调整保存时间〔tR＇〕：tR＇=tR－tM保存值是色谱过程的根本热力学参数之一。在相同的操作条件下，不同的物质有各自固有的保存时间，因此它也是色谱定性的根本依据。液相色谱图相关术语(1)色谱图相关术语:色谱峰(Peak):色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分曲线峰底(PeakBase):峰的起点与终点之间连接的直线峰高(PeakHeight):峰最大值到峰底的距离峰宽(PeakWidth):在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离半(高)峰宽(PeakWidthatHalfHeight):通过峰高的中点作平行于峰底的直线,其与峰两侧相交两点之间的距离HPLC的图形结果

--色谱图(Chromatogram)色谱图:色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为保存时间.←色谱峰时间(分)基线↓峰高峰宽响应值峰宽Wb：色谱峰拐点处的两条切线与基线的两个交点之间的距离；半峰宽Y1/2：峰高一半处对应的峰宽，为2.35

；相邻色谱峰峰顶之间的距离除以此二色谱峰的平均宽度。用R表示：别离度定性时要求：R=1.0〔相邻两峰别离程度98%〕定量时要求：R=1.5〔相邻两峰别离程度99.7%，基线别离，作为完全别离的标准〕。一般将R≥1作为色谱能较好别离的判据。液相色谱图相关术语(2)色谱图相关术语:峰面积(PeakArea):峰与峰底之间的面积,又称响应值标准偏差(σ)(StandardError):0.607倍峰高处所对应峰宽的一半拖尾峰(TailingPeak):后沿较前沿平缓的不对称峰前伸峰(LeadingPeak):前沿较后沿平缓的不对称峰鬼峰(GhostPeak):并非由试样所产生的峰,亦称假峰

拖尾

前伸

AB

1/10h

h拖尾因子Tf不对称因子(As)=BAA拖尾因子(Tf)=A+B2A10%峰高5%峰高液相色谱图相关术语(3)色谱图相关术语:基线(Baseline):在正常操作条件下,仅由流动相所产生的响应信号的曲线基线飘移(BaselineDrift):基线随时间定向的缓慢变化基线噪声(N)(BaselineNoise):由各种因素所引起的基线波动保存时间(tR)(Retentiontime)：组分从进样到出现峰最大值所需的时间噪声和漂移噪声〔N〕：在没有样品进入检测器时，基线在短期内发生的波动。噪声的来源：固定液的流失、载气的不纯，电子元件不稳定、温度变化、外磁场干扰等。基线漂移：基线在一定时间内产生的单向、缓慢移动。良好的检测器其噪声与漂移都应很小。流动相脱气的方法超声波振荡脱气惰性气体鼓泡吹扫脱气在线〔真空〕脱气HPLC用水专门的纯水机或超纯水机；二次或三次重蒸水；市场上瓶装的纯洁水或蒸馏水；其它途径；流动相溶剂的要求溶剂对于待测样品必须具有适宜的极性和良好的选择性。溶剂要与检测器匹配对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差异的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。高纯度由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。化学稳定性好低粘度假设使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于别离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙腈等。洗脱方式等度洗脱用恒定配比的溶剂系统洗脱梯度洗脱在一个分析周期内，按一定程序不断改变流动相的浓度配比。化学键合相利用化学反响将不同的有机官能团通过共价键键合到载体硅胶外表的游离羟基上而形成的固定相。种类非极性键合相：如键合C18、C8、苯基等，其中十八烷〔ODS或C18〕键合相是常用的代表，可完成HPLC分析任务的80%。中等极性键合相：如键合醚基，可别离能形成氢键的化合物〔如酚类〕评价色谱柱好坏的标准1〕理论塔板数n2〕拖尾因子Tf3)色谱柱批与批之间的重现性4〕pH值的适用范围5〕使用寿命对理想检测器的要求高灵敏度；适用范围广，对所有组分都有响应；温度、流动相流速的变化对响应没有影响；可梯度洗脱，响应与流动相的组成无关；死体积小；使用方便、可靠、耐用；线性范围宽；响应时间快；紫外检测器〔UV〕配置最普遍；主要用于检测具有π-π、p–π共轭结构的化合物，如芳烃、稠环芳烃等；灵敏度高；可用于梯度洗脱

缺点：只能检测有紫外吸收的样品；〔衍生化解决〕对流动相的选择有一定的限制；〔截止波长〕荧光检测器〔FD〕适用于能产生荧光的化合物；主要用于氨基酸、多环芳烃等样品；灵敏度极高〔比紫外高1~3个数量级〕，适用于痕量分析；可梯度洗脱

缺点：许多化合物不产生荧光〔可衍生化解决〕；示差折光检测器〔RID〕通用性好；对糖类分析灵敏度尚可；缺点：灵敏度低〔比紫外低3个数量级〕；不能梯度洗脱〔否那么，基线会漂移〕蒸发光散射检测器〔ELSD〕20世纪90年代新开发；是示差折光检测器的理想替代品，对葡萄糖最小检出量5ng；高灵敏；可梯度洗脱；缺点：对有紫外吸收的样品，检测灵敏度较低；检测器比较

紫外

荧光示差折光蒸发光散射测量参数吸光度荧光强度折射率质量类型选择型选择型通用型通用型梯度洗脱可以可以不可以可以最小检出量约1ng约1pg约1μg0.1~10ngHPLC定性、定量分析定性分析利用保存值定性；色谱-光谱联用定性；

利用馏分收集器收集后，再用光谱定性；定量分析归一化少用外标法内标法常用的定量方法标准曲线法,分为外标法和内标法:外标法在液相色谱中用得最多内标法准确，但是麻烦在标准方法中用得最多外标法定量〔一〕配制一系列浓度的标样外标法定量〔二〕采集不同浓度标样的色谱图积分,按外标法定量计算,建立标准曲线标准曲线内标法定量〔一〕配制一系列浓度的标样，其中加有内标样内标法定量〔二〕采集不同浓度标样的色谱图积分,按内标法定量计算,建立标准曲线标准曲线内标法定量〔三〕对内标物的要求化学结构与待测组分相似(同系物、异构体)在样品中不存在不与样品中组份发生任何化学反响保存值与待测组分接近浓度〔响应值〕与待测组分相当其色谱峰与其它色谱峰别离好校正曲线的检测范围校正曲线只有在建立这条曲线的浓度范围内有效，高或低于这些点都可能引起计算错误液相色谱仪的根本结构脱气装置高压泵进样阀检测器流动相色谱柱液相色谱的根本流程图保护柱一般在分析柱前装上较短的保护柱，不仅可除去溶剂中的颗粒杂质和污染物，而且可除去样品中含有与固定相不可逆结合的组分，以保护较昂贵的分析柱，延长使用寿命。一、流动相的配制1：有机溶剂的过滤有机