广藿香MYC转录因子克隆分析

-29-目录目录 -2-前言 -6-概述 -6-1 广藿香及广藿香醇的研究进展 -6-1.1 广藿香简述 -6-1.2 广藿香醇的生物活性 -7-1.3 广藿香醇的应用价值 -7-2 MYC转录因子的研究进展 -8-2.1 MYC转录因子简述 -8-2.2 MYC转录因子对萜类物质合成的调控作用 -8-研究部分 -10-1 试剂与仪器 -10-1.1 植物材料 -10-1.2 主要生物试剂 -10-1.3 主要仪器设备 -10-2 实验方法 -11-2.1 广藿香总RNA的提取和cDNA第一链的合成 -11-2.2 设计特异性引物 -12-2.3 MYC转录因子克隆 -13-2.4 生物信息学分析 -16-3 结果与分析 -17-3.1 MYC序列的获取 -17-3.2 MYC基因序列分析 -17-3.3 MYC蛋白质的理化性质分析 -18-3.4 MYC蛋白的疏水性分析 -18-3.5 MYC蛋白的保守域分析 -20-3.6 MYC蛋白亚细胞定位分析 -22-3.7 MYC蛋白的跨膜区分析 -22-3.8 MYC蛋白的二级结构预测 -24-3.9 MYC蛋白的三级结构预测 -27-3.10 MYC转录因子的同源性分析及系统进化树构建 -29-结论 -31-【参考文献】 -33-致谢 -34-

广藿香MYC转录因子克隆分析【摘要】[目的]广藿香是我国传统的芳香祛湿中药，是著名“十大广药”之一。广藿香醇是广藿香的重要组成成分和药效物质。作为茉莉酸（JA）信号传导途径的核心调控因子，MYC转录因子可能参与广藿香醇的合成。本研究目的在于从广藿香cDNA中克隆出广藿香MYC转录因子，并进行MYC基因及其编码的蛋白相关的生物信息学分析。[方法]应用聚合酶链式反应（PCR）和阳性克隆筛选技术克隆MYC转录因子，并通过生物信息学分析基因的序列特征和蛋白的基本性质。[结论]实验成功克隆出8条MYCs转录因子基因的CDS，分别是MYC2a、MYC2b1、MYC2b2、MYC1440、MYC1844、MYC4、MYC6、MYC1716。经分析，8条转录因子基因均含有属于bHLH家族的两个保守域。其编码的蛋白均属于亲水性不稳定蛋白，均无跨膜区域，亚细胞定位于细胞核，二级结构以α-螺旋和不规则盘绕为主。MYC转录因子的克隆和生物信息学分析为其他植物体内的bHLH家族、MYC因子的克隆和研究提供参考，同时也为进一步研究MYC转录因子对JA信号通路介导广藿香醇合成的调控机制提供基础支持。【关键词】广藿香；MYC转录因子；基因克隆；生物信息学CloningandBioinformaticAnalysisofTranscriptionFactorMYCfromPogostemoncablin【Abstract】[Object]AsaChinesetraditionalaromaticherbwitheffectsofeliminatingdampnessandrelievingheatstroke,Pogostemoncablin,whosemainingredientandmedicinalsubstancesispatchoulialcohol,oneofthe“ToptenmedicinalcropsinGangdongProvince”.transcriptionfactorMYC,playingakeyroleinJasmonate(JA)signalpathway,maybeparticipateinthesynthesisofpatchoulialcohol.TheaimofthisstudyisnotonlytoclonetheMYCgenefromthecDNAofPogostemoncablin,butalsotoanalyzethebioinformationofit.[Methods]CodingSequence(CDS)isobtainbasedonpolymerasechainreaction(PCR)andscreeningofpositiveclones.Thebioinformationofthesequencewereanalyzed.[Result]8CDSofMYCsgene,MYC2a、MYC2b1、MYC2b2、MYC1440、MYC1844、MYC4、MYC6、MYC1716respectively,weresuccessfullycloned.TheseMYCgeneshavetwoconservedregionsbelongingtothebHLHfamily.TheMYCproteinsisunstable,havehydrophilicityandnotransmembraneregion,andislocalizedinthenucleus.Thesecond-levelstructureismainlycomposedofalphahelixandrandomcoil.ThecloningandbioinformaticsanalysisoftranscriptionfactorsMYCprovidereferencesforthediscoveryandresearchofbHLHfamily,especiallyMYCs,andalsoprovidebasicsupportforthefurtherstudyonthemechanismofMYCregulatingthesynthesisofpatchoulialcoholthroughJAsignalpathway.【Keyword】Pogostemoncablin;MYC;geneclone;bioinformaticsanalysis前言广藿香作为我国传统的岭南道地芳香型药材，与砂仁、巴戟天、广陈皮、化橘红、广佛手、沉香、高良姜、广地龙、金钱白花蛇一起名列“十大广药”，是被列入《广东省岭南中药材保护条例》第一批8个保护品种之一。广藿香及其挥发油具有抗病原微生物、保护胃肠道、抗炎、镇痛、解热、止吐、镇咳、化痰、通便、抗肿瘤、抗氧化和调节免疫系统等方面的作用[1]，被广泛应用在医药行业、日化、食品等行业中。广藿香醇是广藿香的萜类次生代谢产物，也是广藿香的重要药效物质。广藿香醇本身的生物活性也得到越来越多研究者的关注，具有广阔的单独应用前景。MYC转录因子是茉莉酸信号通路中的核心调控因子，广泛参与植物中萜类、色素、生物碱等次生代谢产物的合成。因此开展广藿香相关基因的克隆研究，不仅有助于提高广藿香中广藿香油、尤其是广藿香醇的累积，而且对广藿香药用资源的保护、开发、应用均具有重要意义。概述广藿香及广藿香醇的研究进展广藿香简述广藿香Pogostemoncablin(Blanco)Benth.，别名大叶薄荷、山茴香、水蔴叶，属于双子叶植物纲唇形目唇形科植物，以干燥的地上部分入药，是我国传统的芳香祛湿中药。广藿香性味辛，微温，归脾、胃、肺经；具有芳香化浊、和中止呕，发表解暑的功效；常用于湿浊中阻，脘痞呕吐，暑湿表症，湿温初起，发热倦怠，胸闷部署，寒湿闭暑，鼻渊头痛等[2]。广藿香药用历史悠久，广藿香以“藿香”之名最早被记载在东汉时期杨孚所著的《南裔异物志》[3]。广藿香最初并不是作为药材，而是作为香料而被民间使用。宋朝的《嘉祐本草》就有“（藿香）形如都梁，叶似水苏，可着衣服中”的记载。广藿香作为药材的记载最早出现在南北朝的《名医别录》，书中就有“藿香微温，疗风水毒肿，去恶气，止霍乱心痛”的功效记载。现今，广藿香作为香料和药材仍然是现代日用化妆品和医药等行业的热门原料。广藿香的主要成分可分为挥发油、非挥发油两种，其中挥发油主要为萜类、酮类等化合物，其中广藿香醇、广藿香酮的研究较为深入和全面；非挥发油主要为黄酮类化合物、苷类化合物等。在广藿香的有效成分中，挥发油（即广藿香油）占重要地位。广藿香油独特之处在于它主要由多种倍半萜类化合物组成，如广藿香醇、愈创木烯、广藿香烯（绿叶烯），其中广藿香醇占31.86%左右，是最主要成分[4,5]。广藿香醇的生物活性广藿香醇，又名百秋李醇，是三环倍半萜类化合物。广藿香醇具有多种生物活性，已有多项研究证明广藿香醇具有减少神经毒性、抗炎、抗病毒、抗真菌、毒杀白蚁等生物活性，具有广泛且重要的应用前景。黄氏等人[6]的研究发现广藿香醇作为选择性雌激素受体β亚型激动剂，通过抑制β-淀粉样蛋白所引起的细胞内活性氧和钙离子浓度升高，从而起到神经毒性的抑制作用。Lin等人[7]的研究表明广藿香醇通过抑制脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症的相关基因的表达，进而抑制炎症细胞生产过量的TNF-α、IL-6、PGE2、NO等炎症介质的从而达到消炎的目的。Li等人[8]对感染了致死及非致死水平流感的小鼠给予口服广藿香醇，研究结果表明口服广藿香醇能通过增强宿主免疫反应、抑制全身及肺部的炎症反应来增强宿主对流感病毒的体内免疫作用。WAN等人[9]的研究表明广藿香醇在体内对127株菌株，包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，均具有抗菌活性。在体外，广藿香醇对一些耐药细菌例如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)具有抗菌活性。BettyC-RZhu[10]等人将广藿香醇局部应用于台湾白蚁背部后，发现广藿香醇能严重破坏台湾白蚁外骨骼，其实验进一步证实广藿香醇对台湾白蚁有驱赶和毒杀作用。广藿香醇的应用价值作为广藿香油的主要成分，广藿香醇是《中华人民共和国药典》规定的用于广藿香、广藿香油质量控制的指标成分之一[2]。作为香料的应用。广藿香醇本身带有特殊木香型香气，且香气浓而持久，其作为定香剂、调香剂被广泛用在国外日用品、化妆品行业中。在国外的日化行业，每年用量大1000公斤左右。作为药材的应用。在医药领域，随着人们对广藿香醇的研究不断深入，广藿香醇的应用越来越广泛，如在防治流感病毒、溃疡性结肠炎、老年性痴呆症、男性性功能障碍等方面均具有良好的应用前景，相关的应用技术已被申请了专利。赖氏[11]等人的研究表明广藿香醇对甲1型流感病毒、乙型流感病毒、H5N1禽流感病毒具有明显的抑制及灭毒作用，且无细胞毒性，因此其具有良好的治疗或预防流感的应用前景。张氏[12]等人的研究表明广藿香醇能够通过抑制过氧化物酶活性、促进紧密蛋白和黏蛋白表达，来保护肠上皮黏膜屏障，因此其具有应用于防治溃疡性结肠炎药物的前景。黄氏等人[13]的研究发现广藿香醇具有抗神经细胞凋亡、促进原代海马神经元轴突生长、促进老年痴呆模型小鼠学习记忆的作用，因此其具有应用于防治老娘性痴呆症药物的前景。黄氏等人[14]的研究表明广藿香醇通过舒张平滑肌、促进NO释放来引起海绵体舒张，是现有的治疗男性勃起障碍药物有不同的治疗机制，因此其具有应用于防治男性性功能障碍药物的前景。MYC转录因子的研究进展MYC转录因子简述转录因子，是参与RNA转录合成的一类DNA特异性结合蛋白。转录因子位于细胞核内，通过与基因启动子区域中的顺式作用元件发生特异性相互作用，从而激活或抑制基因的转录表达。因此，转录因子又称为反式作用元件。转录因子在高等植物的生长发育、有效成分合成、逆境胁迫响应中起到关键的调控作用。在蛋白质结构水平上，转录因子由4个功能区域组成，分别：1）DNA结合域；2）转录调控域；3）寡聚化位点；4）核定位信号。DNA结合域是转录因子识别顺式作用元件并与之结合的区域，该区域的核苷酸序列决定了转录因子的特异性。转录调控域分为转录激活域、转录抑制域两类，该区域决定了转录因子对基因转录的调控类型。寡聚化位点是不同转录因子之间相互作用的区域，大多与DNA结合域相连形成一定的空间构象。核定位信号是调控转录因子进入细胞核参与转录反应的区域。转录因子的种类的数量繁多，根据结构特点可以分为4类，分别是1）锌指结构转录因子；2）螺旋-转折-螺旋（HTH）转录因子；3）亮氨酸拉链（Leucinezipper）转录因子，其与碱性域组合后便称为碱性亮氨酸拉链（bZIP）；4）螺旋-环-螺旋（HLH）转录因子，其可与碱性氨基酸序列共同组合成DNA结合域，即bHLH结构域[15]。bHLH转录因子广泛存在于真核植物中，具有重要的生物学功能。MYC转录因子是植物bHLH转录因子家族中的重要的亚族成员。在bHLH转录因子家族中，MYC转录因子属于B组bHLH，即可与具有CACGTG或CATGTG特征的DNA结合位点B-box结合[16]。MYC转录因子对萜类物质合成的调控作用萜类化合物是天然产物中一类重要的次生代谢产物，其在自然界中分布广泛、数量庞大，结构类型复杂多变且具有多种生物活性。萜类化合物的生物活性多样，具有很高的药用价值。许多常用中药如薄荷、班蝥、龙胆、青蒿、穿心莲、银杏、雷公藤、人参、柴胡等的有效成分均为萜类化合物。目前，许多萜类有效成分及其衍生物已开发成药品应用于临床，如紫杉醇、多烯紫杉醇、银杏内酯、穿心莲内酯、青蒿素、蒿甲醚、青蒿素琥珀酸单酯等。转录因子可以调控次生代谢产物合成酶基因的表达，进而促进或者抑制目标次生代谢产物的合成。近年来，MYC转录因子参与植物有效成分生物合成的分子机制得到许多解析，其中多与参与茉莉酸（JA）信号传导途径有关。茉莉酸（JA）是植物体的一种内源性激素。茉莉酸及其类衍生物，如茉莉酸甲酯（MeJA）、JA-异亮氨酸复合体(JA-Ile)，统称为茉莉酸类化合物（JAs）。JAs通过激活或抑制转录因子的活性，进而影响相关代谢物合成酶基因的表达，从而有效调控萜类、黄酮类、糖类、生物碱等多种植物有效成分的合成，在植物的初级代谢、次生代谢过程中发挥着重要作用。MYC2转录因子作为MYC家族中最为重要的信号分子，是JA信号传导途径的核心调控因子。MYC2转录因子参与JA信号传导途径的分子机制如下：当植物体内JA含量水平相对较低时，抑制蛋白JAZ（jasmonate-ZIMdomain）与MYC2转录因子结合，抑制MYC2转录因子对次生代谢物合成酶基因表达的激活作用，使植物内有效成分的含量降低。当受到环境胁迫时，植物体内的JA含量水平升高，进而在JAR1酶（jasmonicacidresistant1）的作用下形成活性形式JA-Ile。JA-Ile促进SCFCOI1（Skpl/Cullin1/F-boxproteinCOI1）与JAZ蛋白结合，进而使JAZ蛋白被泛素化和降解。MYC2转录因子因此被释放，进而MYC2转录因子能与合成酶基因的顺式作用元件结合，启动了次生代谢产物的合成[17,18]。目前，MYC转录因子对萜类物质合成的调控机制在许多植物中得到了深入的研究。中药丹参具有活血祛瘀、通经止痛的功效，二萜醌类化合物丹参酮是丹参的主要有效成分。周氏[19]的研究发现SmMYC2a和SmMYC2b是丹参酮和另一有效成分丹参酚酸的正调控因子，并且是SmJAZ的靶蛋白。紫杉醇，来源于天然红豆杉，是具有显著抗肿瘤活性的紫杉烷类二萜化合物，临床用于治疗卵巢癌、乳腺癌、肺癌。张氏[20]的研究发现TcMYC2通过参与JA信号传导直接和间接地调控多种紫杉醇合成酶基因和相关转录因子的表达。阳春砂是中药砂仁的药用植物，临床用于治疗呕吐腹泻、脾胃虚寒等症状。砂仁最主要的化学成分为挥发油，其中多含乙酸龙脑酯、龙脑、樟脑等挥发性萜类成分。王氏[21]的研究发现阳春砂单萜合酶AvPS的启动子可能受AvMYC2、AvMYC4b的调控。金铁锁是“云南白药”的主要药材之一，其有效成分是齐墩果烷型三萜皂苷。孟氏等人[22]的研究发现金铁锁三萜皂苷合成途径的关键基因的启动子可能存在MYC2转录因子的结合位点。研究部分试剂与仪器植物材料本研究所用广藿香均由广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心的植物培养室培育。主要生物试剂实验主要使用的生物试剂见表1。表1主要生物试剂试剂试剂品牌RNA提取试剂盒GMbiolab公司逆转录试剂盒GenStar公司引物合成和基因测序华大基因有限公司高保真DNA聚合酶试剂盒Vazyme公司DNA切胶回收试剂盒Vazyme公司PLB零背景快速克隆试剂盒TIANGEN公司DH5α化学感受态细胞Vazyme公司质粒提取纯化试剂盒GMbiolab公司主要仪器设备实验主要使用的仪器设备见表2。表2主要仪器设备试剂仪器品牌1μl、10μl、50μl、100μl、1000μl微量移液枪Eppendrof高速冷冻离心机Eppendorf三槽梯度PCR仪AppliedBiosystems水平电泳仪北京六一仪器厂凝胶成像仪VL全温振荡培养箱中国华太生物仪器净化工作台上海龙跃纯水超纯水制备系统MilliporeElix超低温冰箱松下电器实验方法广藿香总RNA的提取和cDNA第一链的合成总RNA提取于新鲜广藿香植物组织中按照提起总RNA，具体步骤如下。快速取新鲜组织，在液氮中迅速研磨成粉末状。立即将样品放入EP管中，加入450μl含2-Me的PlantRNALysisBSolution，震荡混合，于60℃水浴中反应5-10min。反应过程中来回翻转EP管数次以帮助混合，往EP管加入150μl的ProteinPrecipitationSolution到细胞裂解液中，混合均匀置于冰上反应5min，以最高转速在常温离心5min。将RNASpinFilter放入2ml的收集管中，再将上一步所得细胞裂解液用移液枪转移至吸附柱中。以最高转速离心2min。取上清滤液至新的灭菌1.5mlEP管中，加入相对于滤液1.5倍体积的含有Ethanol的RNABindingSolution。用移液枪抽吸混合均匀。将RNASpinColumn放入新的2ml的收集管中，将上一步所得的细胞裂解液及絮状沉淀物共同转移至RNASpinColumn中。以最高转速离心1min，去滤液。将RNASpinColumn放回收集管中，加入500μl的RNAWashSolutionⅠ，以最高转速离心1min，弃滤液。新鲜配置80μl的DNaseⅠIncubationBuffer和2μlDNaseⅠ的混合液。将次混合液吸取至RNASpinColumn中心，室温静置15min。加入500μlRNAWashSolutionⅠ至离心管中，以最高转速离心1min，去废液。将RNASpinColumn放回收集管中，加入600μlRNAWashSolutionⅡ，以最高转速离心1min，去废液。重复此步骤。以最高转速空柱离心3min，去除残留的酒精。将RNASpinColumn放至新的1.5mlEP管中。加入50μlNuclease-freeWater至滤膜中央，静置1min，以最高转速离心1min回收RNA。回收的RNA样品保存于-70℃或置于冰上继续后续步骤。逆转录以上一步所提取的广藿香总RNA为模板，按照StarScriptIIFirst-strandcDNASynthesisMix说明书合成cDNA第一链。按表3配置反应体系。表3反转录反应体系组分体积RNA模板1μgOligo(dT)18(50μM)1μl2×Reactionmix10μlStarScriptIIRTMix1μlDEPC-ddH20补足至20μl轻轻混匀，短暂离心。25℃水浴孵育10min，42℃孵育50min。85涉世度加入5min，使StarScriptIIRTMix失活。置于冰上进行后续步骤。设计特异性引物从课题组的MYC全长转录组数据库中根据MYC注释筛选出11条MYC全长转录本，见表4。根据注释上的编号在NCBI数据库上下载对应的核酸序列，并分析其开放阅读框（ORF）。根据目标基因序列，使用primerpremier5.0进行引物设计，见表5。表4MYC蛋白家族的全长转录本筛选GeneIDNR注释i1_HQ_c29887/f2p0/1643{XP_011094312.1;PREDICTED:transcriptionfactorMYC2[Sesamumindicum]}i1_LQ_c14665/f1p0/1844{XP_011094312.1;PREDICTED:transcriptionfactorMYC2[Sesamumindicum]}i1_LQ_c26776/f1p0/1849{XP_011094312.1;PREDICTED:transcriptionfactorMYC2[Sesamumindicum]}i1_LQ_c6437/f1p0/1440{XP_011094312.1;PREDICTED:transcriptionfactorMYC2[Sesamumindicum]}i1_LQ_c66027/f1p2/1716{XP_011094312.1;PREDICTED:transcriptionfactorMYC2[Sesamumindicum]}i2_LQ_c23188/f1p0/2337{XP_011082365.1;PREDICTED:transcriptionfactorMYC4-like[Sesamumindicum]}i2_LQ_c3377/f1p0/2374{XP_011094312.1;PREDICTED:transcriptionfactorMYC2[Sesamumindicum]}i2_LQ_c44276/f1p0/2568{XP_011082365.1;PREDICTED:transcriptionfactorMYC4-like[Sesamumindicum]}i2_LQ_c47382/f1p0/2360{XP_011082365.1;PREDICTED:transcriptionfactorMYC4-like[Sesamumindicum]}i2_LQ_c50785/f1p0/2305{XP_011082365.1;PREDICTED:transcriptionfactorMYC4-like[Sesamumindicum]}i2_LQ_c54214/f1p0/2318{XP_011082365.1;PREDICTED:transcriptionfactorMYC4-like[Sesamumindicum]}表5引物信息目标基因引物名称引物序列）MYC21FATGATCGGTTATAGGACGCCC2FATGATCGGTTACCGGACTCCC3FATGACGGAGTACCGCATGA1RCTATCTACTCTCCCCCACCTTGG2RTTATAATCGATCGGTAAATCCG3RTCAGGGGGAGGGTGAGGTMYC14401440-FATGGCTGACATAATCGTCTCAACTT1440-RAGTGGTTTGGTGTGATTGAGAAATGMYC18441844-FGCAAAAGAAAAGACAAGACACG1844-RGAGTATGAAACAAACAGGCCTGMYC17161716-F1TATGGCTGACATAATCGTCTCA1716-F2GCAGCAAAAGCAAAAGAAAAGACACA1716-R1GGAATTAAAGTGGAAGAAGGAGATGATAG1716-R2GGTGTGATTGAGAAATGAAAAAATTAGTAMYC转录因子克隆PCR扩增以广藿香叶片cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系及程序分别如表6、表7所示。表6PCR反应体系组分体积（μl）2×PhantaMaxBuffer25dNTPMix(10mMeach)1模板DNA0.5引物1（10μl）2引物2（10μl）2PhantaMaxSuper-FidelityDNAPolymerase1ddH20upto50表7PCR反应程序循环步骤温度时间循环数预变性95℃3min1变性95℃15s35退火56℃15s延伸72℃2min彻底延伸72℃5min1PCR产物纯化回收PCR反应完成后，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。确定扩增产物与预期大小一致后，将反应体积等比例扩大至50μl进行PCR，并按照DNA切胶回收试剂盒回收纯化PCR产物。具体步骤如下：在紫外切胶仪上用洁净的刀片快速切下含目的DNA片段的凝胶。尽可能切除DNA条带边缘多余的凝胶，并将切下的DNA条带凝胶放入1.5ml的EP管中。称取凝胶重量（去除空管重量），回收的DNA条带不应超过30g。100mg凝胶等同于100μl体积。在EP管中加入等倍体积BufferGDP，50-55℃水浴7-10min，确保凝胶块完全溶解。水浴期间颠倒混匀2次加速凝胶溶解。将吸附柱置于收集管中，再将上一步所得溶液用移液枪转移至吸附柱中。1,200rpm离心30s。弃废液，将吸附柱置回收集管中。加入300μlBufferGDP至吸附柱中。静置1min后，1,200rpm离心30s。弃废液，将吸附柱置回收集管中。加入600μlBufferGW（已提前加入无水乙醇）至吸附柱中。1,200rpm离心30s。弃废液，将吸附柱置回收集管中。再重复此步骤，确保盐分被完全清除。1,200rpm空柱离心2min。将吸附柱置于新的1.5ml灭菌EP管中，加入50μlElutionBuffer至吸附柱中央，静置2min。1,200rpm离心1min。弃去吸附柱。所得的纯化DNA置于冰上继续用于下一步或保存于-20℃。零背景克隆纯化获得的PCR产物按照pLB零背景快速克隆试剂盒进行平末端连接，构建克隆载体。具体步骤如下：在灭菌的1.5mlEP管中按照表8加入各种成分。表8pLB零背景快速克隆反应体系组分体积（μl）目标PCR片段1PLBVector12×Reaction5T4DNALigase1ddH2Oupto10轻弹EP管以混匀反应液，短暂离心3-5s。将混合反应液放置于PCR仪上22℃恒温反应5min。反应结束后，静置于冰上。转化大肠杆菌感受态细胞将克隆载体转化至大肠杆菌DH5α化学感受态细胞。具体步骤如下：将大肠杆菌DH5α化学感受态细胞（100μl）从-80℃拿出，迅速置于冰上融化。用以移液枪吸50μl感受态细胞到一新的灭菌EP管中，即分装成50μl/EP管。在EP管中加入5μl上一步所得的连接产物，并轻弹EP管底轻轻混匀（避免用移液枪吸打）。冰上静置30min。42℃水浴热激45s，迅速置于冰上并静置2min，切勿摇动EP管。向EP管中加入900μl不含抗生素的LB培养液，混匀后37℃，200rpm复苏60min。直接取100μl感受态涂布在含氨苄的LB培养基上。剩下的菌液1,300rpm离心1min，吸100μl上清液，弃掉剩余上清液，用枪头重悬菌体，然后在涂布在另一含氨苄的LB培养基上。将平板培养基正置于37℃培养箱10min，待菌液完全吸收后，倒置平板，过夜培养16-20h。阳性克隆筛选挑取白色单菌落于10μlddH20中，枪头搅拌使其充分溶解。取1μl菌液作为DNA模板按表6配置菌落PCR体系。表9菌落PCR反应体系及反应程序组分体积（μl）循环步骤温度时间循环数2×T5SuperPCRMix（Colony）5预变性98.0℃3min1DNA模板1变性98.0℃10s3510μMForwardPrimer0.4退火60.0℃10s10μMReversePrimer0.4延伸72.0℃15sddH2Oupto10彻底延伸72.0℃2min1PCR反应完成后，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。确定转化产物与预期大小一致后，取剩下的9μl菌液加于5mlLB和5μl氨苄液体培养基中。将培养基置于37℃、220rpm的恒温摇床中隔夜培养16-20h。测序取500μl菌液用于测序，再取500μl菌液于30%甘油中于-80℃保存。剩下的菌液用于质粒提取。生物信息学分析对广藿香MYC转录因子进行生物信息学分析。在NCBI网站上，采用ORFfinder分析MYC基因的序列长度、所编码的氨基酸数、氨基酸序列。在ExPASy网站上，采用ProtParam预测MYC所编码蛋白质的理化性质，采用ProtScale预测蛋白质的疏水性。在TMHMM网站上，预测MYC蛋白的跨膜区域。在WoLFPSORT上，对MYC蛋白进行亚细胞定位分析。在NCBI网站上，使用Conserveddomains寻找MYC蛋白的保守结构域。使用SOPMA预测MYC蛋白的二级结构。使用SWISS-MODEL预测MYC蛋白的三级结构。从NBCI上采用BLAST进行氨基酸同源序列对比，并下载同源性高的其他植物序列，进一步用MEGA7.0软件构建系统进化树。用ClustalX对广藿香MYC与其他植物的MYC基因的蛋白序列进行多序列比对。表10各类生物信息学分析分析目标工具网址基因序列ORFfinder/orffinder蛋白质理化性质ProtParam/protparam/蛋白质疏水性ProtScalehttps:///protscale/蛋白保守结构域Conserveddomains/Structure/cdd/cdd.shtml蛋白质跨膜区域TMHMMhttp://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/蛋白质亚细胞定位WoLFPSORThttps://wolfpsort.hgc.jp/蛋白质二级结构SOPMAhttps://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.htmll蛋白质三级结构SWISS-MODEL/氨基酸序列同源性Blastp/Blast.cgi结果与分析MYC序列的获取基于课题组所建立的广藿香全长转录组数据库，筛选广藿香MYC的全长转录本。分析序列的开放阅读框（ORF）并设计引物。以广藿香cDNA为模板，进行MYCcDNA序列扩增，获得与预期相近的片段，进行切胶回收，并进行零背景克隆，然后送去公司进行测序，对测序结果进行对比分析。MM123M4M45678图1MYCcDNA序列扩增电泳图注：M：DL2000DNAMarker；1-8分别为patMYC2a、patMYC2b1、patMYC2b2、patMYC1440、patMYC1844、patMYC4、patMYC6、patMYC1716扩增产物MYC基因序列分析本研究从广藿香中克隆出8条MYC基因的编码序列。利用ORFfinder所测出的8条基因的CDS长度、编码氨基酸的数目如表11所示。表11MYC基因序列分析序号基因名称编码区序列大小(bp)氨基酸数目(aa)1MYC2a19836602MYC2b119596523MYC2b219776584MYC144013714565MYC184413414466MYC413654547MYC613564518MYYC蛋白质的理化性质分析根据由ORFfinder获得的氨基酸序列，利用ProtParam分析8个MYC基因编码的的蛋白质理化性质，结果见表12。表12MYC转录因子基因编码蛋白质各项理化性质基因名称分子式相对分子质量理论等电点含量最高的氨基酸不稳定指数脂肪指数MYC2aC3103H4917N895O1016S2371754.945.65丝氨酸（12.3%）46.8470.33MYC2b1C3072H4876N890O1008S2471175.315.60丝氨酸（12.4%）45.8570.60MYC2b2C3089H4892N892O1011S2471471.635.65丝氨酸（12.3%）46.0269.38MYC1440C2179H3490N618O687S1449786.255.59丝氨酸（11.4%）48.1587.24MYC1844C2139H3423N609O665S1648824.356.20丝氨酸（11.7%）50.2485.92MYC4C2170H3478N616O683S1449574.045.68丝氨酸（11.5%）48.4887.62MYC6C2163H3495N617O671S1649393.246.57丝氨酸（11.5%）48.3991.44MYC1716C2232H3581N637O688S1750892.866.60丝氨酸（12.0%）52.2688.90MYC蛋白的疏水性分析用ProtScale对MYC蛋白进行疏水性预测，并结合ProtParam分析蛋白质的理化性质中总平均亲水性，判断其疏水类型。结果如表13、图2所示。表13MYC转录因子基因编码蛋白质疏水性预测基因名称总平均亲水性（GRAVY）最大疏水值最大亲水值平均值类型MYC2a-0.5401.822-3.522-0.85亲水蛋白MYC2b1-0.5461.822-3.522-0.85亲水蛋白MYC2b2-0.5351.822-3.522-0.85亲水蛋白MYC1440-0.3541.911-3.300-0.85亲水蛋白MYC1844-0.3181.911-3.300-1.389亲水蛋白MYC4-0.3451.911-3.300-1.389亲水蛋白MYC6-0.2351.911-3.300-1.389亲水蛋白MYC1716-0.2911.911-3.300-1.389亲水蛋白图2-1MYC2a蛋白的疏水性预测图2-2MYC2b1蛋白的疏水性预测图2-3MYC2b2蛋白的疏水性预测图2-4MYC1440蛋白的疏水性预测图2-5MYC1844蛋白的疏水性预测图2-6MYC4蛋白的疏水性预测图2-7MYC6蛋白的疏水性预测图2-8MYC1716蛋白的疏水性预测图2MYC蛋白疏水性预测MYC蛋白的保守域分析用BLAST对MYC蛋白的保守结构域进行预测，结果如表14，图3所示。表14MYC蛋白保守域类型及位置基因名称保守域1类型氨基酸位置保守域2类型氨基酸位置MYC2abHLH-MYC86-265HLH482-533MYC2b1bHLH-MYC84-263HLH479-530MYC2b2bHLH-MYC84-263HLH480-531MYC1440bHLH-MYC83-255HLH326-381MYC1844bHLH-MYC33-205HLH266-321MYC4bHLH-MYC33-205HLH274-329MYC6bHLH-MYC44-216HLH275-330MYC1716bHLH-MYC35-207HLH268-323图3-1MYC2a的保守域预测图3-2MYC2b1的保守域预测图3-3MYC2b2的保守域预测图3-4MYC1440的保守域预测图3-5MYC1844的保守域预测图3-6MYC4的保守域预测图3-7MYC6的保守域预测图3-8MYC1716的保守域预测图3MYC的保守域预测MYC蛋白亚细胞定位分析亚细胞定位分析能预测蛋白质在细胞内的分布位置，有助于进一步解释基因的功能。使用WoLFPSORT对MYC蛋白的亚细胞定位进行预测，结果表明MYC蛋白均分布在细胞核内，而在细胞质、叶绿体、线粒体内无分布，见表15。表15MYC蛋白的亚细胞定位预测基因名称Nucl（细胞核）基因名称Nucl（细胞核）MYC2a14MYC184414MYC2b114MYC414MYC2b214MYC614MYC144014MYC171614MYC蛋白的跨膜区分析用TMHMM-2.0分析MYC蛋白跨膜区，结果如图4所示，分析结果证明克隆得到的8条MYC转录因子基因编码的蛋白质均不具有跨膜结构，不属于跨膜蛋白。图4-1MYC2a蛋白的跨膜区分析图4-2MYC2b1蛋白的跨膜区分析图4-3MYC2b2蛋白的跨膜区分析图2-4MYC1440蛋白的跨膜区分析图4-5MYC1844蛋白的跨膜区分析图4-6MYC4蛋白的跨膜区分析图4-7MYC6蛋白的跨膜区分析图4-8MYC1716蛋白的跨膜区分析图3MYC蛋白的跨膜区分析MYC蛋白的二级结构预测用SOPMA对MYC蛋白进行二级结构预测，结果如表16、图5所示。表16MYC蛋白的二级结构组成基因名称α-螺旋（Hh）延伸链（Ee）β-转角（Tt）无规则卷曲（Cc）MYC2a31.97%11.67%1.97%54.39%MYC2b132.67%12.27%2.30%52.76%MYC2b232.22%12.01%2.28%53.50%MYC144037.50%12.50%3.51%46.49%MYC184439.24%11.66%2.24%46.86%MYC438.55%13.00%2.42%46.04%MYC642.79%12.64%3.99%40.58%MYC171636.56%12.90%2.58%47.96%图5-1MYC2a蛋白的二级结构预测（蓝色:α-螺旋；红色:延伸链；紫色:无规则卷曲；绿色:β-转角，下同）图5-2MYC2b1蛋白的二级结构预图5-3MYC2b2蛋白的二级结构预图5-4MYC1440蛋白的二级结构预图5-5MYC1844蛋白的二级结构预图5-6MYC4蛋白的二级结构预图5-7MYC6蛋白的二级结构预图5-8MYC1716蛋白的二级结构预图5MYC蛋白的二级结构预MYC蛋白的三级结构预测用SWISS-MODEL对MYC蛋白进行同源建模，预测三级结构，结果如表17、图6所示。其中，建模原理是相似的氨基酸序列对应着相似的结构。表17MYC蛋白同源建模质量评估基因名称GMQEQMEAN序列与模板相似度MYC2a0.16-4.4355.11%MYC2b10.18-3.6755.07%MYC2b20.14-3.2462.43%MYC14400.23-2.4637.29%MYC18440.24-2.5037.85%MYC40.25-.04437.29%MYC60.23-2.3237.57%MYC17160.22-2.6938.20%图6-1MYC2a蛋白的三级结构预测图6-2MYC2b1蛋白的三级结构预测图6-3MYC2b2蛋白的三级结构预测图6-4MYC1440蛋白的三级结构预测图6-5MYC1844蛋白的三级结构预测图6-6MYC4蛋白的三级结构预测图6-7MYC6蛋白的三级结构预测图6-8MYC1716蛋白的三级结构预测图6MYC蛋白的三级结构预测MYC转录因子的同源性分析及系统进化树构建采用BLASTP将广藿香patMYC2a、patMYC2b1、patMYC2b2、patMYC1440、patMYC1844、patMYC4、patMYC6、patMYC1716与数据库中植物的MYCs转录因子序列进行比对，选取同源性较高的的植物MYC转录因子，利用MEGA7.0进行系统进化树构建，见图7。对比结果显示，广藿香的MYC2a、MYC2b基因与青蒿（Artemisiaannua）、丹参（Salviamiltiorrhiza）、烟草（Nicotianatabacum）的亲缘关系最为接近，聚为一类。而广藿香的MYC1440、MYC1844、MYC4、MYC1719基因与毛果杨（Populustrichocarpa）、楸树（Catalpabungei）、芝麻（Sesamumindicum）的亲缘关系最为接近，聚为一类。广藿香的MYC6基因与一串红（Salviasplendens）、丹参（Salviamiltiorrhiza）的亲缘关系最为接近，聚为一类。用ClustalX对广藿香MYC蛋白与拟南芥、丹参、烟草的MYC蛋白序列进行多序列比对，再用Jalview对其保守域进行着色处理。如图8所示，广藿香具有bHLH-MYC蛋白家族的保守结构域。图7广藿香MYC蛋白与其他同源蛋白的系统进化树构建图8MYC蛋白与其他同源蛋白的比对结论广藿香是我国传统的芳香祛湿中药，其次生代谢产物广藿香醇既是广藿香及其精油的主要成分，又是重要的药效物质。广藿香及其精油以其芳香特性及良好药效被广泛应用在医药、日用化妆品行业。广藿香醇，别名百秋李醇，是三环倍半萜类化合物。随着对广藿香及广藿香醇的研究进一步深入，越来越多的广藿香醇生物活性被揭示。广藿香醇具有广阔的应用前景，许多应用技术已被申请专利。茉莉酸（JA）作为植物体的一种内源性激素，广泛参与萜类等多种植物有效成分的合成。而MYC是JA信号通路的关键调控因子。目前对MYC转录因子的研究大多集中在模式植物拟南芥、丹参中，而对于广藿香的研究较少。本研究从课题组的广藿香转录组数据库中筛选出11条广藿香全长转录本，并以此设计引物，从广藿香的cDNA中克隆出8条MYC基因，分别是MYC2a、MYC2b1、MYC2b2、MYC1440、MYC1844、MYC4、MYC6、MYC1716。生物学分析结果总结如下：MYC基因的序列信息：8条MYC基因的CDS序列长度在1341-1983bp之间，编码的氨基酸数量在446-660之间。MYC蛋白的理化性质：MYC蛋白均是不稳定的亲水蛋白；在所有氨基酸组成中，丝氨酸的含量最高，在12%左右。MYC蛋白的保守域：8个MYC蛋白均含bHLH-MYC和HLH保守域，且这两个保守域均属于bHLH家族。MYC蛋白的跨膜区和亚细胞定位：经TMHMM分析发现，8个MYC蛋白均不存在跨膜区，且在WoLFPSORT上的预测数值均为“Nucl:14”，即蛋白均分布在细胞核中。MYC蛋白的二级结构和三级结构：8个MYC蛋白的二级结构以以α-螺旋和不规则盘绕为主，α-螺旋的含量均值为36.44%，不规则盘绕的含量均值为48.57%。经过SWISS-MODEL的同源建模获得MYC蛋白的三级结构模型，为进一步揭示MYC蛋白的功能奠定基础。MYC蛋白的同源性：广藿香的MYC2a、MYC2b基因与青蒿、丹参、烟草具有较高同源性。广藿香的MYC1440、MYC1844、MYC4、MYC1719基因与毛果杨、楸树、芝麻具有较高同源性。广藿香的MYC6基因与一串红、丹参具有较高同源性。经ClustalX的多序列对比，发现广藿香MYC因子与丹参、拟南芥、烟草具有相同的bHLH-MYC蛋白家族的保守结构域。为MYC参与JA信号通路介导广藿香醇合成的研究提供理论支持。本研究对广藿香MYC转录因子的克隆和生物信息学分析为其他植物中MYC因子的克隆和研究提供参考，也为进一步研究MYC转录因子对JA信号通路介导广藿香醇合成的调控机制提供基础支持，有助于实现对广藿香药用资源进行更好的保护、开发和应用。【参考文献】[1]徐雯,吴艳清,丁浩然,修彦凤.广藿香的药理作用及机制研究进展[J].上海中医药杂志,2017,51(10):103-106.[2]国家药典委员会.中国药典(一部)[S]北京: