生化试验报告

2013年生物化学实验B2013年生物化学实验B实验报告姓名：易顺学号：201145009实验时间：2013年11月9日实验分组：第6组组内成员：练伟平（201144402）黄皓辉（201144406）李雨霖（201144407）任课教师：李晓晖小牛肠碱性磷酸酶的提纯及酶活测定 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 SDS-聚丙烯凝胶电泳测定蛋白质相对分子量易顺化工1101摘要碱性磷酸酶广泛存测定在于动物脏器，微生物和植物中，本实验具体介绍怎样从小牛肠中提取碱性磷酸酶，利用考马斯亮蓝法测定期中蛋白质含量及酶的活性；通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子质量关键词小牛肠碱性磷酸酶、酶活测定、考马斯亮蓝法、SDS-聚丙烯凝胶电泳碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,EC3.1.3.1,AKP)是一种非特异性磷酸单酯水解酶,能催化多种磷酸单酯类化合物的水解从而得到相应的醇。AKP广泛存在于动物各脏器、微生物和植物中。本实验拟通过刮去、离心、析出等方式提取小牛肠碱性磷酸酶，从而测定其酶的活性。目前测定蛋白质含量的常用方法主要有凯氏定氮法、考马斯亮蓝(CBB)染色法、紫外分光光度法、双缩脲法、Folin-酚试剂法(Lowry法),其次双辛可宁酸(BCA)法、银染法、荧光法(灵敏度一般较低)的报道。有关文献报道CBB法优于其他的方法[3]。鉴于文献报道CBB染色法与其它方法相比,具有消耗蛋白质量小、灵敏度高、受外界因素影响小的优点,下面采用CBB染色法测定蛋白质含量。Shapiro[4]于1967年首次报告了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳系统，根据他对11种蛋白质电泳获得的结果，发现蛋白质（或亚基)分子量的对数与蛋白质分子的迁移率之间有直线关系。Weber[5]等人的深入研究，肯定了Shapiro的发现，确立了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量的新方法。Shapiro和Weber所应用的SDS-凝胶电泳缓冲系统为连续的磷酸盐系统，后来Laemmli[6]将SDS电泳和DaVis[7]的不连续盘状电泳结合起来，设计出不连续的SDS-Tris-甘氨酸系统，此系统具有很好的浓缩效应，分辨率比磷酸系统更髙应用更为广泛。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种用作测定蛋白质分子量常用的生物化学实验方法。它的基本原理是SDS与蛋白质分子结合，形成复合物。而且各种蛋白质-SDS复合物在凝胶电泳中迁移率只与蛋白质的分子量有关系，因此电泳迁移率就取决于蛋白质分子的大小。用这种方法测定蛋白质的分子量，操作简便，快速，所需设备廉价，所得结果在分子量为15KD-200KD的范围内，与其他方法测得的分子量相比，误差一般在+10%以内。本实验用这种方法测定给定蛋白质样品的相对分子质量。1实验部分1.1试剂与仪器1.试剂(2):平衡缓冲液（0.01mol/LTris-HCl,pH0.8,含1.0x10-3mol/LMgCl2和1.0x10-5mol/LZnCl2）(3):底物缓冲液：1mol/L二乙醇胺-盐酸缓冲液。（pH9.8）(4):酶的底物溶液：用底物缓冲液配制15x10-3mol/L对硝基苯磷酸二钠溶液。(5):分离胶缓冲溶液：1.5mol/LTris-HCl缓冲液，pH8.8，已加入10%SDS。(7):浓缩胶缓冲液：0.5mol/LTris-HCl缓冲液，pH6.8，已加入10%SDS。(8):上样缓冲液：100mgSDS、2mg溴酚蓝、2g甘油，0.1mL巯基乙醇、2mL0.05mol/LpH8.0Tris-HCl，加超纯水定容至10mL。(9):染色液：含0.1%考马斯亮蓝R250，40%甲醇和10%冰醋酸的染色液500mL，过滤后备用。(10):脱色液：500mL10%甲醇和10%冰醋酸的脱色液1000mL。(11):电泳缓冲液；考马斯亮蓝；生理盐水。2.仪器1000W，220V.AC电子万用炉（北京市永光明医疗仪器厂）；DYY-8C型电泳仪（北京市六一仪器厂）；eppendorf5804R型冷冻离心机；JYL-350A型匀浆机（九阳公司）；UV762型紫外可见光分光光度计（棱光）；WD-9405A型脱色摇床（北京市六一仪器厂）；GSY—2型恒温水浴1.2实验过程1.聚丙烯凝胶的制备1）.装板2）.制备分离胶：小烧杯中按下表配置所需浓度的分离胶分离胶制备（浓度10%，制备量10mL）分离胶制备（浓度10%，制备量10mL）试剂用量H2O4.1mL30%丙烯酰胺3.4mL1.5mol/LTris-HCl缓冲液pH8.82.4mL10%过硫酸铵100μLTEMED10μL3）.制备浓缩胶：小烧杯中按下表配置所需浓度的浓缩胶：浓缩胶制备（浓度5%，制备量6mL）浓缩胶制备（浓度5%，制备量6mL）试剂用量H2O3.4mL30%丙烯酰胺1.0mL0.5mol/LTris-HCl缓冲液pH6.81.5mL10%过硫酸铵60μLTEMED8μL4）.蛋白质样品处理：按1:1体积比例加样品和上样缓冲液，100℃加热使蛋白质变性5）.浓缩胶聚合后，将凝胶玻璃板放到电泳装置内槽上，加入电泳缓冲液2.小牛肠碱性磷酸酶的分离提取：1）.取新鲜小牛肠，刮取其内粘膜，加入1.5倍于其体积的水后高速匀浆15s,重复20次。2）.缓慢加入一倍体积冰冷正丁醇高速匀浆15s，重复20次后在4℃.10000rpm条件下离心15min3）.过滤去除杂质后静置分层，取下层水相，调pH到4.9.4℃.10000rpm条件下离心15min4).得到上清液23.8ml，调pH到6.5后，加入1.19g硫酸铵溶解。再加11.186ml冰冷丙酮，混匀，4℃静置30min，4℃.10000rpm条件下离心15min5).得到30.0ml上清液，加入35.3ml冰冷丙酮4℃放置30min，再在4℃，10000rpm条件下离心15min6).取沉淀，完全溶于1.2ml平衡缓冲液后放冰箱中保存。7）.底物37℃水浴5min3．小牛肠碱性磷酸酶酶活性检测1）.将酶稀释20倍2）.紫外分光光度计在405nm波长，测定时间60s，取值2s，记录范围0.0-1.5条件下检测3）.取2个2mL比色皿，加入上述（7）加热的底物缓冲液，校对归零。4）.将稀释20倍的酶液20μL加到其中1个比色皿中（仪器外侧），用手堵住皿口。快速上下倒2次，放回分光光度计中，测定酶动力学曲线4.考马斯亮蓝法测定蛋白质含量：1）玻璃试管中加入5mL考马斯亮蓝。2）在1.5mL离心管中，取酶液分别稀释50、100、200倍。3）各取100μL加入到5mL考马斯亮蓝试管中，混匀，反应5min以上。4）紫外分光光度计检测条件：595nm波长。5）取2个比色皿，加入考马斯亮蓝，分光光度计中校对归零。6）将样品放入外侧比色皿中，读吸光值。7）根据蛋白浓度标准曲线，计算酶蛋白浓度。5．SDS-聚丙烯凝胶电泳测定蛋白质相对分子量：1）用移液枪依次在泳道加样。2）电泳：连接正、负极，打开电源，开始时，电流控制在40A，样品进入分离胶后，缓慢升高电压至140V或电流50-60A，保持电压或电流强度不变。待溴酚兰指示剂迁移至下沿处，停止电泳,用时约2h。3）剥胶染色：电泳结束后，取出凝胶玻璃板，用水冲洗，用金属片从玻璃两侧轻轻撬开，使板内进入空气，同时用水冲洗，取出凝胶板。将剥离下来的凝胶用水漂洗，转入染色缸中，加染色液，置摇床染色15min。4）脱色：染色完毕，回收染色液，用水漂洗，加入脱色液，置摇床脱色，30min换1次脱色液，脱色至背景清晰。5）观察测定蛋白的迁移率及条带，对照标准样品，分析蛋白样品的分子量及纯度。6）拍照电泳结果，用于完成实验报告。2结果与讨论2.1考马斯亮蓝法测定蛋白质含量根据考马斯亮蓝常量法测蛋白质标准曲线，其方程为：y=0.697x-0.007；蛋白质稀释50倍的情况下测得吸光值为0.1998，根据方程，稀释50倍时蛋白质浓度C=0.297mg/ml，则原蛋白质浓度C=14.8mg/ml。 2.2小牛肠碱性磷酸酶酶活检测根据酶动力计算公式：比活力（U/mg）＝A/mi比活力（U/mg）＝A/minVRDE405VECLVR=1.5mL；D=10；E405=18.3L/(mol*cm)；VE=0.05mL；C=14.8mg/mL;L=0.5cm；所以比活力（U/mg）=0.997U/mg；2.3SDS-聚丙烯凝胶电泳 分析知，mark中出现了四条蛋白质标记线，根据其间距及参考文献中给出的mark泳道各条蛋白质标记线间距，可判定由上到下mark泳道中的四条蛋白质标记线分别是兔磷酸化酶B，牛血清白蛋白，兔肌动蛋白和牛碳酸酐酶。样品蛋白质标记线与牛血清白蛋白迁移率相近，所以样品的分子量与牛血清白蛋白分子量相近，所以样品的分子量大致为66,200/mol.实验说明：我们组的凝胶是拿回宿舍进行脱色的，脱色了四天，跟别的组的同学相比较，很明显的脱色时间过长，自己做的，样品蛋白标记线已经不太清晰，我做的是第三、四条，图上依稀只能看见一点点。2.4小牛肠碱性磷酸酶的提纯及酶活测定问题讨论1.测定底物浓度对酶反应速度的影响时，对酶反应的哪些条件要加以控制？本实验所取的条件是什么?答：要控制酶的浓度和活性，pH，反应温度，控制剂或激活剂。本实验中反应温度为37℃，酶浓度为提取的酶稀释20倍后的浓度，pH为8.0.本实验的体会：做实验过程中，一开始我们组是在老师要求的稀释10倍的情况下测的，结果浓度过高得不到比较理想的图，所以在老师指导下稀释了20倍后重新做了实验。我们学会了要根据实际情况随时分析实验失败的原因并采取措施来得到准确的实验结果。2.5考马斯亮蓝法测定蛋白质含量问题讨论1、考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量的原理是什么？答：考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种，考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中的游离态呈红褐色，与蛋白质结合后转变为蓝色。前者最大吸收波长为465nm，后者为595nm。在蛋白质浓度为1.10-1.0mg/ml之间时，蛋白质-色素结合物在595

nm下的吸光度与蛋白质含量成正比，从而可以通过测定吸光度来测定蛋白质含量。2、如何正确使用分光光度计？答：实验时，在一开机预热好的条件下，设置仪器参数后，先加入两支空白考马斯亮蓝的比色皿校对归零，然后将样品放入外侧比色皿中，关盖读吸光值。3.用本实验方法所得的测定值与样品的实际值之间的误差主要是什么原因引起的？答：主要是因为酶浓度不准确从而导致的误差。2.6SDS电泳法测定蛋白质相对分子质量问题讨论1、电极缓冲液中甘氨酸有何作用答：SDS中样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸，电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。2、用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量时为什么要用巯基乙醇？答：巯基乙醇使蛋白二硫键还原,有利于蛋白质与SDS的结合,蛋白质—SDS复合物带上相同密度的负电荷，并可引起蛋白质构象改变，使蛋白质在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小，因此聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。3.样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟？答：加热使蛋白变性。4.分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP，试述其作用。答：TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合；AP提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合所必须的自由基。 参考文献[1]修志龙等.生物化学[M].化学工业出版社.2008.[2]路苹，于同泉，王淑英，等.蛋白质测定方法评价[J].北京农学院学报，2006,21(2)[3]盖新娜，蒋辉，卢静，孙少华，王钜用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法提纯蛋白质实验动物科学与管理[4]李昌厚.紫外可见分光光度计及其应用[M].化学工业出版社。2010-08-01[5]Weber,K.andM.Osborn,1975:IntheProtein.Third.Ed.Vol.1.HansNeurathandR.L.Hill(eds.),NewYork.[6]石继红，赵永同，工俊楼，等.SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳分析小分子多肽[J]第四军医人学学报，2000,21(6)TheExtractionofCalfIntestinalAlkalinePhosphataseandDeterminationofitsActivity,DeterminationofProteinContentbyCoomassieBrilliantBlue,DeterminationofProteinMolecularWeightUsingSDSElectrophoresisMethodShunYIChemicalreactionengineeringClass1101AbstractTheintestinaljuiceofca