硕士研究生开题报告

PAGE2-南开大学攻读硕士学位研究生毕业（学位）论文选题报告评审表硕士生姓名王克双学院（系、所）医学院专业名称耳鼻咽喉科学指导教师杨仕明职称主任医师，教授入学日期2013年9月南开大学研究生院填表日期2015年6月2日

说明1．硕士研究生的毕业（学位）论文对所研究的课题应有新的见解。其选题应在理论上或应用上有一定的意义或价值。2．本评审表包括硕士研究生的书面报告和评审意见两方面内容。书面选题报告由硕士生用A4纸张书写后作为附页，主要内容包括：该选题当前研究状况；硕士研究生本人完成这一课题研究已具备的基本条件；拟在哪些方面有所进展和突破，可能遇到的问题，困难及解决的办法和措施。3．选题报告由硕士研究生所在的专业、学科点组织3名以上有高级职称的同行进行评审。硕士生应向评审小组作全面的选题报告，评审小组经认真评审后填写具体评审意见。选题报告通过后不可随意改题。确有特殊原因需改题者，须由硕士生本人写出书面报告，经导师和评审小组及学院（系、所）主管领导签署意见批准后，留存学院（系、所）备案。该生应及时重作选题报告。4．选题报告工作一般应于第二学期内或第三学期初进行，并将硕士生的选题报告评审表留存学院（系、所）备查。论文题目单独MITF-M亚型突变对耳蜗功能影响的研究报告日期2014年9月18日阅读文献情况已阅读的主要文献：YokoyamaS,WoodsSL,BoyleGM,AoudeLG,MacGregorS,ZismannV,GartsideM,CustAE,HaqR,HarlandM(2011)AnovelrecurrentmutationinMITFpredisposestofamilialandsporadicmelanoma.Nature480:99-103.YajimaI,SatoS,KimuraT,YasumotoK-i,ShibaharaS,GodingCR,YamamotoH(1999)AnL1elementintronicinsertionintheblack-eyedwhite(Mitfmi-bw)gene:thelossofasingleMitfisoformresponsibleforthepigmentarydefectandinnereardeafness.Humanmoleculargenetics8:1431-1441.VachtenheimJ,BorovanskýJ(2010)“Transcriptionphysiology”ofpigmentformationinmelanocytes:centralroleofMITF.Experimentaldermatology19:617-627.SteingrímssonE,CopelandNG,JenkinsNA(2004)Melanocytesandthemicrophthalmiatranscriptionfactornetwork.AnnuRevGenet38:365-411.PingaultV,EnteD,Dastot-LeMoalF,GoossensM,MarlinS,BondurandN(2010a)ReviewandupdateofmutationscausingWaardenburgsyndrome.HumMutat31:391-406.PingaultV,EnteD,Dastot‐LeMoalF,GoossensM,MarlinS,BondurandN(2010b)ReviewandupdateofmutationscausingWaardenburgsyndrome.Humanmutation31:391-406.LovellJM,HarperGM(2007)Themorphologyoftheinnerearfromthedomesticpig(Susscrofa).Journalofmicroscopy228:345-357.MarcusDC,WuT,WangemannP,KofujiP(2002)KCNJ10(Kir4.1)potassiumchannelknockoutabolishesendocochlearpotential.AmericanJournalofPhysiology-CellPhysiology282:C403-C407.CheliY,OhannaM,BallottiR,BertolottoC(2010)Fifteen-yearquestformicrophthalmia-associatedtranscriptionfactortargetgenes.PigmentCell&MelanomaResearch23:27-40.LevyC,KhaledM,FisherDE(2006)MITF:masterregulatorofmelanocytedevelopmentandmelanomaoncogene.Trendsinmolecularmedicine12:406-414.LiK,GoodallJ,GodingC,LiaoS,WangC,LinY,HiragaH,NojimaT,NagashimaK,SchaeferK(2003)ThemelanocyteinducingfactorMITFisstablyexpressedincelllinesfromhumanclearcellsarcoma.Britishjournalofcancer89:1072-1078.选题报告内容提要本实验研究的目的是通过建立单独MITF-M基因突变的实验动物模型，明确MITF-M基因影响血管纹中间层细胞的机制，从而验证MITF-M基因突变导致听力-色素综合征的分子及病理机制。首先本课题组使用基因敲除的方法培育出了单独MITF-M亚型基因突变的小鼠。接下来，将从形态听力、蛋白表达及基因三个角度来研究单独Mitf-M基因突变对听觉系统的影响及其分子病理机制。通过本实验研究，我们可以建立人类Waardenburg综合征2A型及其严重类型Tietz综合征的实验动物模型；明确MITF-M基因突变导致听力-色素综合征的分子及病理机制；发现MITF-M基因的上游及下游信号通路，找到治疗疾病的作用靶点；从而为人类的Waardenburg综合征2A型及其严重类型Tietz综合征的诊治提供实验依据。（选题报告全文见附页）导报师告对的选评题语本选题报告逻辑清晰，实验设计合理，前期调研及预实验较成功。由于本研究的实验动物为基因敲除鼠，相对比较宝贵，希望能充分利用实验资源，取得满意的实验结果。导师签字杨仕明 2015年6月2日评主审要小成组员姓名职称工作单位杨伟炎教授解放军总医院杨仕明教授解放军总医院曹秀堂教授解放军总医院邹艺辉副教授解放军总医院评审小组对选题报告的意见评语：本选题报告有一定创新性，有理论意义及应用价值。文献调研及研究课题的发展动态介绍比较清楚，综合分析比较正确。采用了新的方法和技术，实验设计比较周密、合理，有一定可行性。由于实验内容较多，为了获得预期实验结果，请紧凑安排实验时间。成绩（按百分制评定成绩）95分评审小组负责人签字曹秀堂2015年6月2日学院（系、所）意见学院（系、所）主管院长签字年月日选题报告王克双1、选题背景：首先，人类的Waardenburg综合征是一种以听觉-色素异常为特点的常染色体显性遗传疾病，占先天性耳聋的2%。按临床特征和遗传标准可分为四种亚型。其中定位于3号染色体短臂1区2带3区段-1区4带1区段之间的人类MITF基因，它的突变与一些类型的听觉色素异常综合征有关，如Waardenburg综合征2型（WS2）,其临床特点为皮肤、虹膜、毛发着色异常和感音神经性耳聋。MITF基因编码的小眼畸形相关转录因子，拥有一个碱性螺旋-环-螺旋拉链（bHLH-Zip)结构。它调控着许多细胞的分化，如神经嵴来源的黑色素细胞，视杯来源的视网膜色素上皮细胞（RPE）以及骨髓来源肥大细胞和破骨细胞等。在人类，MITF基因有着一种独特的多启动子机制，它至少拥有9种5’端特异的启动子-外显子单位来启动其对应的转录变异体的转录（即有至少9种基因亚型）。然而，不同的亚型的2-9外显子序列是完全相同的，它们是编码这些转录因子的功能区域，即激活结构域（transactivationdomain,TAD）和b-HLH-Zip。MITF基因是以细胞依赖性的方式通过使用不同启动子产生了不同表达模式的基因亚型，而MITF-M是专门表达于神经嵴来源的黑色素细胞和黑色素瘤细胞，并且由黑素细胞特异性启动子（M启动子）的调控。2、选题的研究状况：目前大量研究已经证明Mitf-M基因突变将导致神经嵴来源的黑色素细胞缺失，最终产生耳聋等症状，Waardenburg综合征2A型及其严重类型Tietz综合征就是由MITF-M基因突变引起的。但是单独Mitf-M基因对听觉系统的作用及其分子病理机制至今未明。多年来，人们一直在对该基因突变的动物模型进行研究，试图明确该基因的真正功能以及与各种调控系统的复杂联系。因此，寻找合适的疾病动物模型进行Mitf-M基因对听觉系统的相关功能研究是很有必要的。本课题组曾研究过MITF-M自然突变的白化耳聋荣昌猪家系，确定白化耳聋荣昌猪突变基因为Mitf-M基因，得到听力表型稳定可靠的Waardenburg综合征2A型荣昌猪模型，确定了Mitf-M基因特异性针对血管纹黑色素细胞（即中间层细胞）分化、迁移和存活过程的重要作用。因为猪的MITF基因相关研究还处于起步阶段，相关研究结果很有限，加上取材麻烦，所以选用鼠作为动物模型来进行进一步的机制探讨。人和小鼠的MITF基因具有高度同源性，60多年前，PaulaHertwig发现并描述了第一个Mitf突变鼠，自此以后，在Mitf基因位点，另外23个等位基因已经被鉴定。从相关文献可以看出，到目前为止，单独Mitf-M基因敲除小鼠还没有，Mitf-M基因突变后产生的许多病理变化都无法解释，本实验研究单独MITF-M亚型突变对耳蜗功能的影响，对于耳聋的基因诊断和分子病理机制研究是很重要的意义。完成此选题已具备的实验条件：目前本课题组通过基因敲出的方法已经培育出单独MITF-M亚型基因突变的小鼠，对基因敲出小鼠进行RT-PCR研究确认本实验小鼠确实为单独MITF-M亚型基因突变小鼠。从结果图可以看出基因敲出鼠体内确实没有MITF-M亚型基因的表达。与此同时，该基因敲除鼠的表型为皮毛白色，虹膜浅染，ABR测听阈值为双耳极重度耳聋，与Waardenburg综合征2型（WS2）的临床特点相一致。形态学结果有明显异常，显示为：耳蜗血管纹明显变短变薄，外毛细胞有明显缺失。4、选题计划及技术路线：总体计划是从形态学听力、蛋白表达及基因三个角度来阐述单独Mitf-M基因对听觉系统的作用及其分子病理机制。本选题的技术路线见下图：5、选题拟突破和进展的方面：本实验研究在建立单独MITF-M基因突变的实验模型基础上，验证MITF-M基因突变导致听力-色素综合征的分子及病理机制。拟于通过实验研究其是影响神经嵴分化过程中间层细胞的迁移？还是影响中间层细胞的正常存活或引起异常凋亡？从而，验证MITF-M基因突变导致听力-色素综合征的分子及病理机制。研究计划及进度安排：2014.9-2014.12 不同孕期的胎鼠耳蜗进行火棉胶切片，找到Mitf-m基因作用的关键时间点，完善小鼠听功能及内耳形态学数据2015.3-2015.6 分别取耳蜗血管纹进行透射电镜，冰冻切片荧光免疫组化及转录组分析，对比分析出鼠血管纹结构和功能标志物，对比研究出Mitf-m基因的上游及下游信号通路2015.9-2015.12 实验数据的整理及分析，查漏补缺，进一步完善实验，并发表文章2016.3-2016.6 归纳总