固定化微生物简介及海藻酸钠包埋固定法分析研究 环境工程专业

固定化微生物简介及海藻酸钠包埋固定法分析研究环境工程专业摘要：固定化微生物技术起始于1959年，由Hattori等人首次实现了大肠杆菌的固定化，此后发展迅速。该技术最初主要用于工业发酵，20世纪70年代以后，由于水污染严重，迫切需要一种高效、快速，能连续处理的废水处理技术，从而微生物固定化技术才在污水处理中得到广泛应用[1]。固定化微生物技术是将微生物固定在载体上使其高度密集并保持其生物活性功能，在适宜条件下还可以增殖以满足应用之需的生物技术。在生物反应器中所使用的微生物菌体往往被称之为生物催化剂。由于在传统的废水生物处理工艺中，微生物通常是在水中以悬浮态生长的，因而易于从反应器中流失，又由于其与水的密度差小，因此从流出的水中回收微生物进行重复利用将变得较为困难或复杂。为此，采用固定化技术，将微生物通过一定的技术手段是微生物固着生长，有利于提高生物反应器内微生物的数量，利于反应后的固液分离，利于去除氮，取出高浓度有机物或难以生物降解物质，提高系统的处理能力和适应性，是一项高效低耗，运行管理简单的废水生物处理技术[2]。关键词：固定化，载体，海藻酸钠，细胞活性，前景1.引言下面介绍一下固定化微生物中的一些基础知识，即固定化微生物的要求，载体的要求，以及载体种类，制备等。1.1被固定的微生物（主要是人为选定的特效降解菌的优势菌种）基本条件：①投加的菌体活性高；②菌体可快速降解目标污染物；③在系统中不仅能竞争生存，而且可维持相当数量[1]。1.2固定化载体为微生物创造了更不易解体的生存环境，所以一个理想的固定化载体的选择也很重要。适合于废水处理的固定化载体应具有以下性能：①对微生物无毒，生物滞留量高，不干扰生物分子的功能；②传质性能好；③具有足够的机械、物理和化学稳定性，不易被生物降解；④机械强度高，使用寿命长；⑤固定化操作简单；⑥对其它生物的吸附小；⑦价格低廉[1]。1.3载体分类目前常用的载体可分为无机载体、有机高分子载体和复合载体3大类型。无机载体如多孔玻璃、硅藻土、活性炭、石英砂等。有机载体还可分为两类：一类是高分子凝胶载体，如琼脂、角叉莱胶和海藻酸钙等；另一类有机合成高分子凝胶载体，如聚丙烯酰胺凝胶、聚乙烯醇凝胶、光硬化树脂、聚丙烯酸凝胶等。复合载体是由无机载体和有机载体材料结合而成，使两类材料的性能互补，从而显示复合载体材料的优越性[1]。1.4固定化微生物的制备方法

物理固定法主要有包埋法、吸附法（载体结合法）和包络法，化学固定法包括共价结合法和交联法（架桥法）[1]，又有自溶酶灭活法，絮凝吸附法[4]等。目前，国内外学者对可用做包埋载体的有机物的研究较为广泛，相关报道很多，但主要有聚乙烯醇、海藻酸钠、聚丙烯酞胺、聚乙烯醇缩丁醛等几类[1]。2.海藻酸钠固定法2.1基本机理[5]海藻酸盐是棕色藻类的胞内产物，它由两种不同类型的单糖组成，即1，4—β—D—甘露糖醛酸（M）和1，4——L—古洛糖醛酸（G）。海藻酸盐是一种聚合物。海藻酸系天然有机高分子电解质，其一价盐(Na+,K+,NH4+)为水溶性盐而二价以上的盐(Ca2+,Al3+)为水不溶性盐，因此可形成耐热的凝胶或被膜，这是海藻酸钠经CaC12溶液钙化后形成固定化凝胶的内在机理。同时，海藻酸钠易与蛋白质、明胶等多种物质共溶，并可与细胞混合形成均匀的悬浮液，使凝胶具有微生物分布的均匀性。除此之外，海藻酸钠还具有价格低廉、水溶液粘度很大(1%的溶液可达200cp)、不易被大多数微生物降解等良好特性。由于组成海藻酸盐单体的结构中含有羧基和羟基能与金属离子发生螯合作用，因此海藻酸盐在包埋微生物的同时更可增加其吸附容量。海藻酸钠与微生物的混合液与钙离子发生的凝胶反应主要在羧基上进行，用反应式表示为:具体操作方法是:取一定量的湿菌体细胞，与浓度为3%的海藻酸钠溶液混合均匀，然后滴入4℃的浓度为4%的氯化钙溶液，形成直径2-3mm的均匀小球，钙化4h，然后用去离子水洗涤。2.2生产方法[6]A.C.Hulstl等曾经报道了一种可以大量制作海藻酸钙的方法，其实验装置，如图1所示:此装置靠机械带动震针上下震动，向上时产生负压吸入细胞悬浮液，向下运动则打出小球。根据海藻酸钠-细胞悬浮液的密度、粘度、表面张力和所需小球的粒径等条件，计算出震针的震动频率和幅度。用此装置一分钟可产生400-500粒固定化颗粒，为这种固定化方法的工业化运用开辟了道路。用这种方法生成的小球在与磷酸、柠檬酸、EDTA和乳酸等溶液接触后，海藻酸钙凝胶颗粒会逐步解体。用聚乙烯亚胺(PEI)和戊二醛对包埋小球进行交联强化可以有效地解决这一问题。先将固定化颗粒置于的PEI-CaC12混合溶液中，间歇搅拌24h，取出，用水洗涤，再置于戊二醛溶液中搅拌lmin，得强化固定化细胞颗粒。实验表明最佳强化条件是:PEI浓度0.55%，戊二醛浓度1.0%,CaC12为50mmol/L,PEI-CaC12混合溶液pH=8.20。2.3固定化方法2.3.1实验一[4]用海藻酸钙包埋固定热带假丝酵母菌，在三相流床反应器中连续处理含酚废水，进水酚浓度为300mg/L，出水酚浓度小于0.5mg/L，分的最大容积负荷比活性污泥法高1倍，其污泥发生量仅为活性污泥法的1/10。2.3.2实验二以海藻酸盐为载体，建立包埋固定化微生物的方法如下[5]：方法I=1\*GB3①将海藻酸钠加热溶于水；=2\*GB3②将海藻酸钠溶液与微生物细胞混合均匀，使海藻酸钠最终浓度为2%~4%；=3\*GB3③将海藻酸钠与菌体混合液用针形管滴入5%~10%的CaCl2溶液中，固定化7~8h；=4\*GB3④滤出颗粒，用生理盐水洗净，备用。方法II=1\*GB3①将按方法I制得的固定化细胞颗粒置于0.06mol/L的己二胺溶液中搅拌1~2h；=2\*GB3②滤出颗粒，水洗后，用0.5%戊二醛交联5min；=3\*GB3③滤出颗粒，用生理盐水洗净，备用。方法III=1\*GB3①将按方法I制备的固定化颗粒浸泡于下列溶液中：壳聚糖0.5%CaCl20.2mol/LpH6.0=2\*GB3②滤出颗粒，水洗后，用0.5%戊二醛交联5min；=3\*GB3③滤出颗粒，用生理盐水洗净，备用。分别利用以上三种固定化方法，包埋黑曲酶细胞，比较各种固定化细胞的活性，其结果如表1：表1海藻酸钙包埋法的比较固定化方法方法I方法II方法III固定化细胞相对活性57.1%52.9%44.8%由表1可以看出，用海藻酸钠系列包埋固定化方法固定化微生物，固定化细胞的活性较高。其中用方法I固定化细胞的活性最高，在方法II、III中，由于在海藻酸钙凝胶表层突上了一层高分子膜，虽然增强了固定化颗粒的机械强度，但是同时加大了底物及氧的扩散阻力，从而降低了细胞活性。此外，在方法II、III中所采用的戊二醛对细胞液具有毒性，在使用前应作毒性试验，确定是否采用改种交联剂。2.4海藻酸钠包埋法固定化试剂对细胞活性的影响2.4.1海藻酸钠对细胞活性的影响海藻酸钠是一类天然高分子多糖类，对微生物没有毒害作用。但海藻酸钠的浓度会影响固定化细胞的机械强度、质量传递等，进而影响到微生物的活性。海藻酸钠浓度对固定化细胞活性的影响如表2所示。表2海藻酸钠浓度对细胞活性的影响海藻酸钠浓度细胞相对活性成球难易海藻酸钠浓度细胞相对活性成球难易1.0%56.2%易2.5%52.3%易1.5%57.1%易3.0%45.6%较难2.0%55.4%易2.4.2CaCl2浓度细胞活性的影响在海藻酸钠包埋固定化过程中，凝胶化剂CaCl2中的Ca2+于海藻酸钠根离子螯合形成不溶于水的海藻酸钙凝胶，从而将细胞固定。CaCl2溶液的浓度对固定化细胞颗粒机械强度的影响见表3。表3CaCl2浓度对固定化细胞凝胶机械强度的影响CaCl2浓度/%234510机械强度较好较好较好好好随着CaCl2浓度的增加，微生物细胞的活性降低。当CaCl2浓度低于5%时，细胞活性可以保持在80%以上；但是当CaCl2浓度达到10%，细胞活性下降到60%左右，主要原因估计有两种（=1\*romani）由于盐的渗析作用，引起细胞脱水，致使微生物活性部分丧失；（ii）在PCR技术中，CaCl2是使细胞处于感受态的物质，这个时候微生物是最脆弱的，很容易被外界的干扰破坏。从表四可以看出，CaCl2浓度对固定化细胞的机械强度影响较大。当CaCl2浓度为2%~3%时，固定化颗粒在使用过程中会出现膨胀，甚至出现裂缝或破碎现象。因此，海藻酸钙包埋法固定化细胞活性较高。3固定化细胞性能的评价3.1固定化颗粒的密度固定化颗粒是指一定体积内固定化颗粒的量，因此，确定固定化颗粒的密度，也就是测定其体积和重量[2]。3.2固定化颗粒的通透性和机械强度固定化颗粒的通透性，是用来衡量的固定化细胞与外界交换能力的重要指标。通透性越好，固定化细胞与外界的物质交换越容易，固定化微生物对于外界污染物的降解能力越强。机械强度，主要衡量固定化颗粒在外界的持续压力冲击下保持形状的能力，一般来说，机械强度越大，颗粒可重复利用率越高，在工程上的应用价值越大。但是在固定化过程中，固定化时间越长，颗粒的机械强度越大，通透性却降低；反之，固定化时间越短，通透性提高，机械强度却无法保证。因此，在实验中应该综合考虑两个因素，在两个指标中寻找最优的组合[5]。3.3固定化颗粒的最适温度、最适pH值由于在存在状态上与游离的微生物不同，因此在最适温度和最适pH值方面也会有很大的不同。通过做对照试验，测出不同组别在不同温度和pH值的条件下降解速率，从而找出最佳的降解的温度和pH值。可以看到，在固定化以后，微生物可以存在的温度和pH值范围比固定化以前有了显著的扩大[5]。3.4微生物的包埋量由于在制作固定化颗粒的过程中，不可避免的会有一部分微生物没有包埋到颗粒之中，这部分微生物不会参加对污染物的降解，因而在一定程度上会影响降解的效果。因此包埋量的测定也是评价固定化好坏的一个很重要的指标。4.总结4.1通过实验一和实验二可以看出海藻酸钠包埋法操作简单，而且发展出了适合大规模生产的技术，海藻酸钠可比较广泛的应用于固定化，这就使此方法有较大的应用范围。海藻酸钠温和无毒，固定化的细胞容易适应，适合于固定活细胞或敏感细胞。用海藻酸钠与氯化钙交联生成的海藻酸钙固定包埋的微生物保持了较高的生物活性，但是在含有多价阴离子以及高浓度电解质溶液中比较不稳定，Ca2+容易脱落，包埋强度也随着钙离子的脱去而逐渐变弱，最后可能出现破损的现象。当存在高浓度的K+、Mg2+、磷酸盐以及其他单价金属离子时，海藻酸钙凝胶的结构也易受到破坏。除此之外，由于海藻酸钙凝胶网格的孔隙太大，酶可能会从网格中渗露出来。这是将其广泛应用于大规模废水处理所急需解决的问题，而在实际应用中常常添加其它添加物以增加其强度。4.2从固定化微生物技术诞生之初到现在，固定化微生物技术有了长足的发展，特别是在处理废水领域，相应的理论构造己发展成型、并积累了很多宝贵的经验。目前的现状如下:(1)厌氧微生物利用较多(2)固定化方法中以胶体包埋法为多(3)厌氧处理常用固定床，好氧处理多用流化床(4)适于在高负荷条件下运转(5)剩余污泥产生量少(6)对水质水量变化的适应性能力强[7]同时固定化微生物技术存在的许多急需解决的问题也显现出来:(1)廉价高效的固定微生物载体的开发(2)提高载体的重复使用率，延长使用寿命，降低使用成本(3)适合特定处理的微生物种群的选择(4)开发新型高效的固定化微生物反应器[1](5)混合固定化技术的进一步研究和开发(6)开发成型的固定化微生物（细胞）传感器[2]广泛应用在处理氨、氮废水，固定化活性污泥除BOD物质，难降解有机废水（含酚废水，含芳香烃废水，处理LAS废水，处理重金属废水）等。固定化微生物方法在污水处理中较物理法，化学法等有着明显的优势，如克服了生物细胞太小，与水溶液分离困难，易造成二次污染缺点等缺点，而有着效率高、稳定性强、能纯化和保持高效稳定浓度菌种等优点。同时，也有着明显的不足，如缺乏廉价优良载体，在文中海藻酸钠包埋法中有着很好的生物活性但却也有包埋强度较差的劣势，其他还有需严格控制微生物生长环境等。优良菌种的选择，高活性高强度载体的出现，新的包埋方法的研究都将促进固定化微生物技术在污废水处理中的应用[8]。参考资料：[1]高红梅,固定化微生物技术及其在养殖水体中的应用,中国饲料行业信息网,/tech/biotech/200509/8208