人源化抗体：构建的核心原则与策略

人源化抗体：构建的核心原则与策略第一代人源化抗体是通过将鼠源McAb的可变区与人抗体的恒定区相结合，形成了一种嵌合抗体。尽管这两部分在空间结构上相对独立，使得其独特的抗原亲和力得以保持，但由于嵌合抗体中仍然包含鼠源McAb的可变区，因此在应用时仍可能引发强烈的HAMA反应。为了克服这一问题，科学家们进一步进行了改进，将鼠源McAb可变区中的相对保守的骨架区（Frameworkregion,FR）替换为人的FR，而仅保留抗原结合部位的互补决定区（Complementarity-Determiningregion,CDR）。这种改进使得抗体真正实现了人源化。然而，FR作为抗体的脚手架，不仅为CDR提供了空间构象环境，有时还参与抗体结合位点正确构象的形成，甚至与抗原的结合。因此，简单的CDR移植往往会导致原抗体亲和力的丧失或降低。为了解决这一问题，目前科学家们已经探索出了四种策略，旨在优化FR和CDR之间的相互作用，以恢复或提高人源化抗体的亲和力。这些策略的实施将有助于进一步提升抗体人源化的效果，为医学研究和治疗提供更多的可能性。人源化抗体构建原则与策略1.模板替换在使用与鼠对应部分有较大同源性的人抗体FR替换鼠FR时，通常有两种途径可供选择。第一种途径是采用同一个（或少数几个）具有已知晶体结构数据的人源抗体可变区框架（如VH中的NEW、KOL，VL中的REI等）作为基本模板，通过序列比较与分子模建，确定人、鼠间存在种源差异的氨基酸残基，特别是与鼠CDR密切作用的氨基酸残基，在替换过程中予以保留。为了确保CDR的空间构象得以维持，需要特别关注原来抗体CDR下方的堆积残基以及周围的残基。这种方法的优势在于，已知的人源FR晶体结构为残基替换提供了明确的信息。然而，其不足之处在于可能难以保持鼠CDR的天然构象，从而可能导致抗体亲和力的降低或丧失。第二条途径是在已有的抗体序列库中搜索与鼠McAbFR具有最大同源性的人源FR进行替换。在选择同源的人FR时，早期的研究者倾向于将VL和VH作为一个整体来考虑，以寻找最高同源的人FR，理由是同一个抗体的VL和VH在折叠上更能匹配。然而，后来的研究者则认为将VL和VH分开考虑，分别寻找最高同源的对应序列，可以更好地保持FR原来的框架，为鼠CDR提供整体上最类似的环境。同源替换的主要考虑因素是确保鼠CDR在此背景下具有类似的折叠环境，从而维持其原来的构象。同样需要借助分子模建来提供CDR移植后可能缺失的FR关键残基的信息。这种方法的优点在于能够减少需要更改的氨基酸数目，更好地保持CDR所需的空间环境。然而，其不足之处在于选择的人源FR可能并无结构数据可供参考，因此无法提供有效的关键残基信息。2.表面重塑对鼠CDR及FR的表面残基进行镶饰（veneering）或重塑（resurfacing），以使其轮廓（profile）或型式（pattern）更加类似于人抗体的CDR或FR。这一策略的前提是，鼠McAb可变区的免疫原性主要源自其表面残基。由于残基的运动性和溶液可及性是成为抗原决定簇的关键因素，因此表面残基很可能携带全部或绝大部分的抗原表位。在定义溶液可及性表面残基时，我们采用的标准是：构成该残基的全部原子的30%以上是溶剂可及的。尽管人、鼠间抗体可变区表面暴露残基的精确型式存在差别，但大多数表面位置的残基类别具有强烈的倾向性。仅仅考虑这种表面型式，我们就可以区分抗体可变区的不同组别。这表明抗体可变区的表面至少与框架区核心一样保守，而表面型式的差异则是人鼠间抗体的主要区别。根据对现有抗体晶体结构数据的分析结果统计，人、鼠间抗体可变区残基在序列配对位置上的相对溶剂可及性分布保真度高达98%。这意味着在异种间诱导免疫反应的残基是由其余的种特异性溶液可及表面残基引起的。通过将鼠特异性表面残基替换为人源性的残基，我们可以模拟人源抗体的表面轮廓，从而逃避人体免疫系统的识别，达到人源化的目的。这种策略可以在不进行同源模建的情况下，基于序列同源分析，选择与鼠表面残基暴露类型最相匹配的人源型式进行。然而，需要注意的是，如果要改变的残基在侧链大小、电荷、疏水性或有可能形成氢键从而影响到CDR的构象时，则不应进行改变。这是因为改变的残基较少，有助于减少CDR-FR之间的不相容性。作为一种较新的人源化途径，该策略仍在逐步成熟阶段。关于鼠源McAb在人体引起的HAMA反应是否完全由其表面暴露残基引起，还是由表面残基与内部残基的共同贡献所致，这涉及到抗体产生最基本的免疫学机制，目前仍是研究的热点。通过深入探索这一策略，我们有望为抗体人源化提供更多有效的解决方案。3.补偿变换在选择人FR进行改变时，我们重点关注那些与CDR有相互作用、与抗体的亲和力有密切关系或对FR空间结构折叠起关键作用的残基。这些改变旨在补偿完全的CDR移植可能带来的影响。根据立体结构数据和同源性分析，我们了解到在抗原结合、稳定CDR构象和FR折叠方面，构成抗体FR的残基并不具有相同的重要性。基于这一点，我们可以将这些残基分为三类：低风险性残基，这些残基暴露于溶剂中，对抗原结合和抗体结构的贡献较少。替换这些位置的残基可以降低免疫原性，而几乎不影响抗体的亲和力；高风险性残基，这些残基直接参与抗原结合、稳定CDR构象或FR折叠。为了保持人源化抗体的活性，我们应尽量避免在这些位置进行替换；中度风险性残基，对于这类残基，我们需要谨慎处理。FR中的高风险性残基和某些中度风险性残基，统称为非CDR区补充调控残基。它们分布于线性序列的不同位置，为每个CDR回折提供了合适的“平台”。这些残基的形状和侧链大小协同决定了CDR的基本构象，并影响其抗原结合的特异性。因此，在将CDR移植到人源FR后，我们必须将人FR中的这些位置替换成鼠源非CDR区补充调控残基，以补偿完全的CDR移植带来的影响。这种分析方法使我们能够制定具有选择性和针对性的人源化突变方案，避免了盲目的、可能导致失败的探索。此外，通过在中度风险性残基中进行变化，我们还有可能提高人源化抗体的亲和力。然而，需要注意的是，对残基的分类需要基于晶体数据和三维结构，以确保提供准确的标准。4.定位保留(positionalconsensusmethod)人源化McAb保留了鼠源McAb可变区中参与抗原结合的关键氨基酸残基，这包括了CDR以及FR中的一些至关重要的残基。尽管我们可以将鼠框架区的其余部分从某个人FR中移植过来，但无可避免的是，这样得到的人源化抗体序列与人抗体的保守序列（consensussequences）在某些位置上仍会存在差异。这些非典型残基，源自个体型抗体在亲和力成熟过程中的体细胞突变，应用于病人后可能会诱导免疫反应。因此，一个更为理想的途径是，以人FR的保守序列为模板进行人源化设计。由于人抗体轻、重链可变区不同亚类的保守序列存在差异，我们需要寻找一种合适的方法来确定最适合的保守序列。最简位置模板（minimalpositionaltemplate）为我们提供了确定这些关键位置的方法，它揭示了抗体可变区中哪些位置对于维持抗原结合结构域的完整性是绝对必要的。在选择人框架区时，我们首先会从现有的人源抗体保守序列中搜寻与鼠框架区最为类似的序列。接着，根据最简位置模板，我们确定鼠可变区的关键位置残基。最后，我们将保留所有这些关键位置，而将其余部分进行人源化改造。上述人源化的四种策略，均以保持抗体的亲和力为核心目标，以降低免疫原性为最终目的，各具特色。总的来说，抗体人源化设计的关键步骤包括：①从同源抗体或共同序列抗体中选择适合的人源FR。②根据已发