无菌工艺验证-培养基灌封试验

9/17/2022无菌工艺验证－ 培养基灌封试验主讲人：崔强2022年3月E-mail:9/17/2022

为什么需要进行培养基灌封试验

？29/17/2022

来自生产工艺的要求

……对产品进行最终灭菌，是降低微生物污染风险的常用办法。但有大量药品不适用于最终灭菌而只能采用无菌生产工艺方法。无菌生产工艺是制药领域中最难的工艺之一，确保产品无菌是该工艺最大的难点。减少无菌工艺药品污染风险的两项重要措施

人员培训

无菌工艺验证3

最终灭菌工艺与无菌生产工艺的差异最终灭菌工艺

在高洁净净环境下进行灌装和密封

通常，产品、容器和密封件的微生

物污染水平很低

在密封容器中进行最终灭菌无菌生产工艺

产品、容器和密封件分别进行灭菌，

然后进行灌封

在极高洁净环境下进行灌装和密封

产品在最终容器中不再做进一步的

灭菌处理

对各个组成部分的灭菌工艺需要进空瓶灭菌隧道除菌过滤密封件

半压

塞瓶冻干机全压塞瓶

行严格验证和监控

蒸汽灭菌釜

在灌封前和灌封过程中的操作会带

来污染风险

人员9/17/2022

49/17/2022

来自FDA和USP的要求FDA

CGMP

无菌工艺药品指南（2022年版）

An

aseptic

processing

operation

should

be

validated

using

a

microbiological

growth

medium

in

place

of

the

product.

This

process

simulation,

also

known

as

a

media

fill.

USP

31

<1116>

洁净室和其它控制环境的微生物学评价

To

assure

that

minimal

bioburden

is

achieved,

additional

information

on

the

evaluation

of

the

microbiological

status

of

the

controlled

environment

can

be

obtained

by

the

use

of

media

fills

.

An

acceptable

media

fill

shows

that

a

successful

simulated

product

run

can

be

conducted

on

the

manufacturing

line

at

that

point

in

time.59/17/2022

来自EUGMP和国内的要求EU

GMP

附件1

无菌药品的生产（2022年2月新版）

Validation

of

aseptic

processing

should

include

a

process

simulation

test

using

a

nutrient

medium

(media

fill).中国药品生产质量管理规范附录（

1998

年修订）SFDA

化学药品注射剂基本技术要求（试行）…

培养基灌装验证是对设备、环境以及人员操作的一种系统验证

,是判断无菌保证水平的关键手段

……

采用无菌生产工艺的粉针剂，应能保证

SAL

不大于

10

-3

…

69/17/2022无菌工艺产品的无菌保证

无菌工艺产品工艺验证

Personnel人员Environment

环境

原料无菌检验7作业环节验证难易度人员依赖程度相关风险灭菌易低低房间设计N/AN/A中等环境监测中等可变高消毒难高高更衣难很高很高物品转移难高高无菌技术（灌封）难很高很高无菌装配难很高很高9/17/2022作业环节与风险89/17/2022培养基灌封实验的

常规要求99/17/2022

证明生产线采用无菌工艺生产无菌产品的能力对人员进行资格确认符合cGMP的要求

定义与目的

使用培养基模拟药品进行无菌灌封，对无菌工艺进行

验证。又称为“工艺模拟试验”.目的109/17/2022

工艺模拟试验的通常流程将培养基暴露于设备、容器胶塞密封系统的表面和关键环境条件中，并模拟实际生产完成工艺操作。

对装有培养基的密闭容器进行培养以检查微生物的生长。

评价结果，确定实际生产中（如灌装前的调试、加入无菌原辅材料、无菌连接、灌装和密封）产品污染的可能性。119/17/2022培养基灌封试验的时机

–

初始验证与再验证初始验证

需要重复多次，以确保结果的一致性和有效性。有差异的多次实验结果工艺过程失控的象征

定期再验证

定期进行，评估无菌工艺的受控情况。

应综合考虑每一班次及班次变化过程中有代表性的活动及干预。对人员的资格再确认应纳入到定期再验证中。129/17/2022培养基灌封试验的时机

–

增补性培养基灌封试验变更及其评估

对产品或生产线的每一种变更，均应根据书面

的变更控制系统进行评估

。

如果通过评估认为此项变更会影响到无菌生产工艺产品的无菌保证水平，则需要进行增补性培养基灌封实验。比如，设施或设备的变化、生产线配置的变动、人员重要变动、环境监控结果异常、容器

-

胶塞系统变更、停车时间延长、无菌检查结果阳性等。139/17/2022

实验用培养基和培养温度的选择选择时的注意事项

适应广谱微生物生长，包括细菌和真菌

较好的澄明度，较小的粘度易于除菌过滤常用培养基：

3

％大豆胰蛋白肉汤（

TSB

）厌氧培养基仅在特殊情况下使用

培养温度

FDA

-

20-35

℃

，目标值

±2.5

℃

，不少于

14

天；如选择两个温度，则每一温度下至少培养

7

天，从低温开始。PIC

-

20-25

℃

下至少

14

天，或，先

20-25

℃

下

7

天，

然后30-35

℃

下

7

天。149/17/2022

灌装体积与数量灌装体积

每只容器的灌装体积不少于总容积的

1/3

同样，灌装体积也不宜过大

既要考虑到瓶倒转或旋转时，培养基能充分接触到容器

和密封件的内表面，又要保证容器内有足够的氧气支持

微生物生长。灌封数量

综合考虑统计学要求和实际生产批量。

FDA

(>5000

瓶

)

：如果正常生产的批次量低于

5000

瓶，

则培养基灌封至少应为实际生产线的最大批次量。

PIC

(>3000

瓶

)

：如果正常生产的批次量低于

3000

瓶，则

培养基灌封至少应为实际生产线的最大批次量。159/17/2022

灌封时间与批次量控制灌装时间

对于初始性验证，培养基灌封实验应安排在一周内的不同

时间进行。

对于再验证，可选择在一周结束或其它最差条件下进行。灌封时间要涵盖实际生产班次。

批次量控制

初次验证，至少要连续成功灌封

3

个批次。

再验证至少需要成功灌封

1

个批次。16 培养基灌封实验的合格标准FDA指南（2022版）与EU

GMP

附件1标准统一1.灌封量<5000瓶时，若有1瓶污染，需彻底调查， 并重新验证(3批)。2.灌封量为5000-10000瓶时，若有1瓶污染，视调 查结果决定是否需要重新进行1批培养基灌封试 验；若有两瓶污染，必须重新验证（3批），同 时进行彻底调查。3.

灌封量

>10000

瓶时，若有

1

瓶污染，需彻底调查；

4.9/17/2022若有两瓶污染，必须进行彻底调查，并重新验证（3批）。注：欧盟标准将自2022年3月起执行。 17污染瓶数01234567891095%置信限值34.746.37.759.1510.5111.8413.1514.4315.7116.969/17/2022

培养基灌封实验的合格标准 2022年3月以前欧盟通用标准：污染率低于0.1% 计算公式：实际污染率=(95%置信限值)/(灌封容器数)×100%污染瓶数与95%置信限值间的关系18批量（瓶）3000475063007760允许污染的数量（瓶）0≤

1≤

2≤

39/17/2022

培养基灌封实验的合格标准

SFDA

化学药品注射剂基本技术要求（试行）培养基灌装试验的批量与判断合格的标准199/17/2022不同剂型的特殊要求209/17/2022

冻干制剂对培养基灌封的要求冻干制剂的典型生产流程

配制

→

灌装

→

冻干

→

加塞

→

轧盖

第一种方式，模拟装载

/

卸载过程，缩短放置时间（首选）

容器内灌封好培养基，以半压塞状态装入冻干机

冻干机内部分抽真空（

500mbar

），在室温放置一定的时间，

不得冷冻。

用无菌空气破真空（不使用惰性气体），全压塞

轧盖

注意，若所使用的容器透明度不高，应将内容物倒出进行检查。

冻干制剂培养基灌封试验的特殊性

对产品在冻干机内放置步骤的模拟219/17/2022

冻干制剂对培养基灌封的要求第二种方式，模拟冻干时间

半压塞产品在冻干机腔室内的放置时间同于正常工艺。缺点：耗时长

第三种方式，以经稀释的培养基模拟冻干过程

容器内灌封好经稀释的培养基（

diluted

medium

），以半压塞状态装入冻干机模拟冻干过程，直到容器内的培养基大致达到正常浓度（

full

strength

）为止。缺点：耗时长，需开发特殊的冻干程序，营养支持性不均一，影响微生物的存活力。22

粉针剂对培养基灌封的要求第一种方法

在灌装线上直接灌装液体培养基，灌装后压塞

-

轧盖或熔封。

9/17/2022第二种方法

先灌装干粉培养基，再加入注射用水第三种方法

先灌装惰性剂，再加入液体培养基要点

采用第二、三种方法时，所用惰性剂或干粉培养基需

事先经过辐射灭菌。

常用惰性剂有聚乙二醇

8000

、羧甲基纤维素、乳糖。

23

混悬剂

/

半固体制剂对培养基灌封的要求悬浮剂

需要模拟搅拌或循环流动的过程。

9/17/2022

如果有无菌添加过程，也应进行模拟。半固体制剂

需要将液体培养基增稠到适当粘度。

可选用琼脂或羧甲基纤维素作为增稠剂，也可选用其

它试剂，但要证明其没有抑制细菌或真菌的作用。

在培养结束后，需将培养基从塑料或金属管中挤出检

查其混浊度和真菌菌落，也可进行无菌检查实验。

如果选择显色培养基遇到污染物变色的方法，则需要

对其进行验证。

249/17/2022方案

与

报告259/17/2022制订培养基灌封实验方案的考虑因素（一）

生产线最长运行时间及其造成的相关风险干预的次数、类型和复杂程度是否有冻干工序设备的无菌装配总人数和所从事的操作无菌加入和无菌转移的次数班次更换、暂停和必要的更衣无菌设备的拆卸与连接环境监测269/17/2022制订培养基灌封实验方案的考虑因素（二）

生产线的配置和运行速度产品重量检查容器

/

密封系统与无菌操作相关的各种特殊规定总人数和所从事的操作总的原则

综合考虑生产线可能造成污染的各种因素尽可能模拟实际生产的无菌操作可能时，应包括最差条件的模拟测试279/17/2022

验证开始前的准备工作设备确认

通风系统（

HVAC

）的确认

设备的在线清洗和灭菌

CIP,SIP灭（除）菌工艺验证

湿热、干热灭菌工艺

除菌过滤

空气过滤器的完好性检测

容器

/

胶塞密封完好性测试人员培训洁净室环境达到设计要求28培养基灌封实验方案的内容举例

定义被模拟的工艺

定义使用的房间，灌封线和

设备

使用的容器和密封件的类型

灌装线的速度

灌封数量

模拟过程中的干扰和中断的

数目和类型

参与的人员数目

使用的培养基

9/17/2022

灌封到容器内培养基的体积选择的最差条件及其原理培养条件，培养温度，培养时间所进行的环境监测批记录复印件职责说明所有工作的合格标准列举最终报告中需要的文件本次模拟的持续时间299/17/2022

方案的执行与记录（一）培养基灌封的日期和时间使用的房间和设备容器胶塞的型号和尺寸培养基种类和灭菌方式每容器中的灌装体积灌装速度灌封的瓶数，灯检丢弃的瓶数和原因培养的瓶数，阳性的数量培养时间和温度309/17/2022

方案的执行与记录（二）环境监测的数据参与培养基灌封的人员培养基灵敏度检查的结果有无阳性结果。如有，要给出微生物鉴定的结果。如发生异常情况，需给出调查报告。319/17/2022

培养基灌封实验中的环境监测环境监测－按照相应的规程进行，包括：

空气粒子数沉降碟浮游菌表面监测人员监测•对无菌生产区环境的评估329/17/2022

培养基灌封实验中的灵敏度检查实验培养基灵敏度检查实验：

使用完成

14

天培养的灌封前期培养基样品

用枯草芽孢杆菌、金.葡萄球菌、白色念珠球菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉和环境菌作为阳性菌将每个菌种准备含<100cfu/0.1ml的菌液，每个菌种接种2支培养基样品，同时并平板计数（双份）对真菌在20-25C下培养，对细菌在30-35C下培养，每天检查，5天内需有生长迹象339/17/2022再验证与增补性验证的要求

再验证

对每条生产线，每年进行两次再验证，间隔时间为

5-7

个月。人员至少每年参加一次再验证，以进行资格再确认。每条生产线轮流使用最大和最小规格的容器，变换生产线的速度。

增补性验证

根据风险程度决定培养基灌封实验的批数。通常为

1-3

批。349/17/2022

培养基灌封实验的总结报告最终报告中应包括以下内容

模拟的最差条件

事件清单

环境监测结果

微生物鉴别结果

培养基的营养检查实验结果

培养条件、结果读取日、结果读取人、每位参与者的灌装瓶

数等信息。

结论（结果是否可以接受）合格证书

工艺验证

/

再验证合格证书

人员资格确认证书359/17/2022难点讨论369/17/2022

培养基灌封实验阳性结果的调查

(

一

)调查的范围应包括

环

境微生物

监测

数据，空气

悬

浮粒子

监测

数据CIP

设备

，清

洁

、消毒程序的

执

行情况培

养

基、

设备

和零件的

灭

菌工

艺

，

灭

菌釜的校正情况高效

过滤

器

检测

(

空气

悬

浮粒子水平，

过滤

器

检

漏，风

速

测

量，密封系

统检查

，使用年限等

)除菌

过滤

器完好性房

间

气流型式与

压

差人

员

操作技

术

培

训

情况379/17/2022

培养基灌封实验阳性结果的调查

(

二

)调查的范围还应包括

以往

产

品无菌

检查实验结

果

人

员卫

生状况

监测

数据培

养

基灌装

实验

中的干

预

方式分析该

区域近期是否有

过维

修活

动

，生

产线

的改造情况该

生

产线

培

养

基灌封

实验历

史数据已

灭

菌物品的

储

存条件培

养

基灌封

过

程中的异常事件阳性

污

染菌与

环

境

监测污

染菌的

鉴别38

培养基灌封实验阳性结果的调查

(

三

)调查结论与风险评估

培养基灌封实验结果有效

暂停生产，直至确定污染来源并采取有效的纠偏措施。再验证合格后，产品方可放行。对培养基灌封实验后和此前所生产的产品，进行风险评估

培养基灌封实验结果无效

→

重新进行培养基灌封实验

9/17/2022条件

1

无菌灌装区的物理条件不满足要求条件

2

人员未按照正常生产程序操作

399/17/2022

培养基灌封后的生产培养基灌封后可以进行生产，但要等培养基灌封合格后产品才能放行（产品有报废的风险）。无效的培养基灌封后可以进行生产，但所生产的批次要在成功培养基灌封后方可放行。培养基灌封失败生产线不能用来生产，根据调查结果决定培养基灌封的次数和数量，培养基灌封合格后，才能生产。409/17/2022

讨论：最差条件

Worst

Case最差条件

高于或低于正常范围的条件限度，与正常生产条件相比最有可能造成工艺或生产失败的条件。

注意

如果某些做法会带来污染的风险，则不允许用培养基灌封的结果为它的不合理的进行辩护419/17/2022

最差条件的设计（

1

）储存时间

Holding

time

灌封设备、灌封部件、储罐、无菌物料、药液在实际灌封

前能够放置的最长时间

1.

灌封设备、灌封部件、储罐、无菌物料需要再灭菌

（除菌）的时间间隔

Worst

case:

用超出保存时间的灌封设备、灌封部件、储罐、无菌物料参与培养基灌封2.

产品从无菌过滤到灌封加塞完成所需要的时间Worst

case

：无菌过滤后存放在储罐内的培养基模拟实际生产时产品的最大储存时间后再灌封

产品在灌装后的储存时间应在培养基灌封中验证429/17/2022

最差条件的设计（

2

）灌封的持续时间

Duration

of

runs

最保守的设计：在培养基灌封试验中，模拟用时最长的瓶

子满批量生产所需要的时间，其中包括正常的干扰时间

（换班、设备维修）。

其他的设计：

1.

在生产完成后接着进行培养基