重组人干扰素生产工艺

第十五章重组人干扰素消费工艺

2021.4.12主要内容干扰素概述基因工程假单胞杆菌的构建与保藏干扰素的发酵工艺过程干扰素的分别纯化工艺过程1.干扰素概述干扰素的种类干扰素的理化性质干扰素的生物学活性干扰素的临床运用干扰素的消费工艺道路1.1干扰素的种类概念：〔interferon，IFN〕干扰素是一种细胞因子，它是机体感染病毒时，宿主细胞经过抗病毒应对反响，而产生的一组构造类似、功能相近的低分子糖蛋白。英文称号为Interferon，简称IFN。发现：干扰素是1957年英国科学家Isaccs等发现的。他们把灭活的流感病毒作用于小鸡细胞，结果发现这些细胞产生了一种可溶性物质，这种物质能抑制流感病毒，并且能干扰其它病毒的繁衍，因此，他们将这种物质称为“干扰素〞。以后科学家们进一步发现，机体对入侵的异种核酸〔包括病毒〕都产生干扰素以进展防御。当机体细胞遭到病毒感染时，机体细胞产生干扰素，干扰病毒复制，它是机体抗病毒感染的防御系统。

天然干扰素分类1.根据来源、基因序列和氨基酸组成分类

I型干扰素：IFNα、IFNβ、IFNτ、IFNω来源：白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织细胞等功能：抗病毒感染、抗肿瘤生长

免疫调理(较弱〕

其中IFN-α为多基因产物，有23种以上的亚型。II型干扰素：干扰素γ〔IFN)来源：活化的T细胞和NK细胞产生功能：免疫调理提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈才干加强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性抑制TH2细胞构成，下调体液免疫应对趋化作用抗病毒和抗肿瘤作用〔次要〕2.根据动物来源确定分类，例如人干扰素〔HuIFN〕，小鼠干扰素〔MuIFN〕。

上市重组干扰素:α2a、α2b、α1b、β1b，γ1992年我国第一个基因工程药物IFN-α1b获得国家一类新药证书。研发中的重组干扰素：IFNω，临床阶段1.2干扰素的理化性质143-166aa；MW:18-40ku；pI:6.5-7.5；乙醚、氯仿敏感容易吸附玻璃、淀粉、醋酸纤维膜、琼脂和塑料等介质。Ⅰ型干扰素具有广谱的抗病毒活性，对多种病毒如DNA病毒和RNA病毒均有抑制造用；但这种效应不是直接的，而是经过对宿主细胞的作用引起的。①对干扰素敏感的细胞外表存在于干扰素受体，核内有“抗病毒蛋白〞基因，受干扰素作用后该基因活化，产生的抗病毒蛋白可阻止病毒mRNA翻译，并促进病毒mRNA降解。②干扰素能提高细胞外表MHCⅠ类分子的表达程度，遭到病毒感染的细胞外表MHCⅠ类分子的添加有助于向Tc细胞递呈抗原，引起靶细胞的溶解。③干扰素可加强NK细胞对病毒感染的杀伤才干。1.3干扰素的生物学活性正常情况下组织或血清中不含干扰素，只需在某些特定要素的作用下才干诱使细胞产生干扰素。1.3.1广谱抗病毒活性机制病毒复制抑制病毒复制信号转导IFN-aIFN-诱导蛋白诱导刺激胞核胞核抗肿瘤作用机制Ⅰ型干扰素能抑制细胞的DNA合成，减慢细胞的有丝分裂速度；这种抑制造用有明显的选择性，对肿瘤细胞的作用比对正常细胞的作用强500～1000倍。另外，Ⅱ型干扰素也可经过增强机体免疫机制、加强免疫监视功能来实现其抗肿瘤效应。免疫调理活性机制免疫调理作用表如今对宿主免疫细胞活性的影响，如对巨噬细胞、T细胞、B细胞和NK细胞等均有一定作用。对巨噬细胞的作用：IFNγ可使巨噬细胞外表MHCⅡ类分子的表达添加，加强其抗原递呈才干；此外还能加强巨噬细胞外表表达Fc受体，促进巨噬细胞吞噬免疫复合物、抗体包被的病原体和肿瘤细胞。对淋巴细胞的作用：干扰素对淋巴细胞的作用较为复杂，可受剂量和时间等要素的影响而产生不同的效应。在抗原致敏之前运用大剂量干扰素或将干扰素与抗原同时投入会产生明显的免疫抑制造用；而低剂量干扰素或在抗原致敏之后参与干扰素那么能产生免疫加强的效果。在适宜的条件下，IFNγ对B细胞和CD8+T细胞的分化有促进作用，但不能促进其增殖。IFNγ能加强TH1细胞的活性，加强细胞免疫功能；但对TH2细胞的增殖有抑制造用，因此抑制体液免疫功能。IFNγ不仅抑制TH2细胞产生IL-4，而且抑制IL-4对B细胞的作用，特别是抑制B细胞生成IgE。对其它细胞的作用：IFNγ对其他细胞也有广泛影响：①刺激中性粒细胞，加强其吞噬才干；②活化NK细胞，加强其细胞毒作用；③使某些正常不表达MHCⅡ类分子的细胞〔如血管内皮细胞、某些上皮细胞和结缔组织细胞〕表达MHCⅡ类分子，发扬抗原递呈作用；④使静脉内皮细胞对中性粒细胞的粘附才干更强，且可分化为高内皮静脉，吸引循环的淋巴细胞。1.4重组干扰素的临床运用广谱抗病毒活性〔rhuIFNα〕慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎。直接抗肿瘤活性〔rhuIFNα〕毛细胞和慢性髓样白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。免疫调理活性——治疗慢性肉芽肿瘤〔rhuIFNγ〕多发性硬化症rhuIFNβ1.5.干扰素消费工艺道路〔1〕体外诱生干扰素制备工艺：Sendai病毒诱导人白细胞1989年：IFNα-n3/Alferon，同意上市产量低：1gIFNα，需求3亿ml人血白细胞来源困难，工艺复杂，收率低，价钱昂贵潜在的血源性病毒污染的能够性干扰素消费工艺道路〔2〕人源转化细胞系培育消费工艺：1999年：IFNα-n1/Wellferon,同意用于临床。优点：初次实现大规模商业化消费。缺陷：活性低，退出临床运用。干扰素消费工艺道路〔3〕上市产品：重组人干扰素rhuIFN1986，rhuIFNα-2a，rhuIFNα-2b；1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b；2001－2002：PEG化IFN，PEG-Intron,Pegasys表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。基因工程大肠杆菌发酵消费工艺:干扰素消费工艺道路〔4〕上市产品：rhuIFNβ-1a1996，Avonex(Biogen)；2002，Rebif(Serono)表达产物：166aa糖基化蛋白，22.5ku工艺特点：分泌表达，产量低，本钱高,过程严厉动物无限细胞系培育消费工艺：干扰素消费工艺道路〔5〕•宿主：腐生型假单胞杆菌〔Pseudomonasputida〕•上市产品：IFNα-2b/安福隆•表达产物：无糖基化可溶性蛋白质，具有天然分子构造和生物活性•工艺特点：发酵周期短：几个小时无需变性、复性过程，获得有活性产品纯化过程：淘汰抗体亲和层析基因工程假单胞杆菌发酵消费工艺2.基因工程假单胞杆菌的构建与保藏

基因工程假单胞杆菌菌种建立基因工程假单胞杆菌菌种特性菌种库的建立与保藏2.1、基因工程假单胞杆菌菌种建立第一步：干扰素α-2b基因的克隆第二步：表达载体的构建第三步：工程菌的构建第一步：干扰素基因的克隆(RT-PCR)

制备白细胞，病毒诱导，分别mRNA,反录酶合成cDNA,PCR，基因衔接质粒,转化E.coli,挑选鉴定克隆。测序：编码人IFNα-2b基因序列,501bp，165aa。第二步：表达载体构建•IFN基因与表达载体衔接•转化大肠杆菌•挑选阳性克隆•获得序列正确表达载体第三步：工程菌构建转化假单胞杆挑选高表达、稳定遗传的工程菌获得原始菌种2.2基因工程菌的特性〔1〕具有宿主菌的特征：细菌：革兰氏阴性菌，有荚膜，无芽孢，杆状。菌落：直径2.5-3.0mm，灰绿色半透明状,粘稠。生化特性:Ser-，L-Val、D/L-Arg和L-Thr为〔2〕工程菌的特征：SmR、TcR、ApR〔3〕具有消费干扰素才干：放射性免疫学效价不低于2.0×109IU/L。2.3菌种库的建立与保藏•QC：菌种特性、消费才干、质粒稳定性•菌种检查合格后，方可投产。

3.干扰素α-2b的发酵工艺过程3.1摇瓶培育取保管任务种子批菌种，室温融化摇瓶培育：30℃，pH7.0，250r/min，18±2h检测：OD值和发酵液杂菌检查。3.2种子罐培育接种：接入50L种子罐，接种量10%。培育：30℃，pH7.0。控制：级联调理通气量和搅拌转速DO为30%，3～4h，OD>4.0。检测：显微镜和LB培育基划线检查，控制杂菌。

3.3发酵罐培育接种：通入300L培育基的发酵罐，接种量10%。控制：级联调理通气量和搅拌转速。前4h：30℃，pH7.0，DO为30%。4h后：20℃，pH6.0，DO为60%，5～6.5h。终点控制：OD值达9.0±1.0，5℃冷却水快速降温至15℃以下。检测：发酵液杂菌检查3.4．菌体搜集延续流离心机：冷却的发酵液，16000r/min离心搜集。菌体保管：－20℃冰柜，不超越12个月。检测：干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体枯燥失重、质粒构造一致性、质粒稳定性。4干扰素的分别纯化工艺过程4.1、干扰素分别工艺过程4.2、干扰素的纯化工艺过程4.1干扰素α-2b分别工艺过程菌体裂解预处置初级分别(1)菌体裂解

裂解缓冲液：纯化水配制，2℃～10℃〔pH7.5〕运用维护剂：EDTA，PMSF。破碎－20℃菌体：2厘米以下的碎块搅拌：加裂解缓冲液，2℃～10℃，2hr冻融:细胞完全破裂，释放干扰素。(2)预处置-沉淀加絮凝剂聚乙烯亚胺:2℃～10℃，搅拌45min，对菌体碎片进展絮凝。加凝聚剂醋酸钙溶液:2℃～10℃,搅拌15min，对菌体碎片、DNA等进展沉淀。(3)离心

延续流离心机：2℃～10℃，16000r/min搜集上清液：含有重组干扰素蛋白质杂质沉淀：121℃、30min蒸汽灭菌,熄灭处置。〔4〕初级分别

盐析:4M硫酸铵，2℃～10℃，搅匀,静置过夜。离心：延续流离心机，16000r/min保管：搜集沉淀，粗干扰素，4℃保管。4.2、干扰素纯化工艺过程溶解粗干扰素沉淀与疏水层析阴离子交换层析与浓缩阳离子交换层析与浓缩凝胶过滤层析无菌过滤分装(1)溶解粗干扰素

配制纯化缓冲液：超纯水，pH7.5磷酸缓冲液，0.45μm滤器和10ku超滤系统，百级层流下搜集。冷却至2℃～10℃。检查:缓冲液的pH值和电导值。溶解：2℃～10℃，匀浆，完全溶解。(2)沉淀与疏水层析

等电点沉淀〔1〕：磷酸调理至pH5.0，沉淀杂蛋白，离心搜集上清液。疏水层析：干扰素吸附在疏水层析柱中

除非疏水性蛋白洗脱与搜集：0.01M磷酸缓冲液〔pH8.0〕。等电点沉淀〔2〕：磷酸调理pH4.5，调理电导值40ms/cm，2℃～10℃，静置过夜超滤：1000ku超滤膜过滤，除去大蛋白。透析除盐：调整溶液pH8.0，电导值，10ku超滤膜，0.005M缓冲液。(3)阴离子交换层析与浓缩0.01M磷酸缓冲液〔pH8.0〕平衡树脂。盐浓度线性梯度5～50ms/cm进展洗脱，配合SDS搜集干扰素峰。浓缩：调整溶液和电导，10ku超滤膜，0.05M醋酸缓冲液〔pH5.0〕中透析。〔4)阳离子交换层析与浓缩用0.1M醋酸缓冲液〔pH5.0〕平衡树脂。上样，一样缓