第一章绪论(酶工程)

第一章绪论教学重点

:酶工程的概念、固定化酶活性测定、酶的生产方法。讲授要点：1、酶工程概念

2、酶工程发展概况

3、酶的基本知识（复习）

4、酶的生产方法

一、酶工程(enzymeengineering)概念酶是具有生物催化功能的生物大分子。酶工程又称酶技术，是围绕着酶所特有的生物催化性能使其在工农业、医学和其他方面发挥作用的应用技术，是酶学基本原理与化学工程技术、基因重组技术及微生物学技术有机结合的产物。第一节酶工程概念、研究内容和主要任务二、酶工程的主要内容包括：1、酶的生产和分离纯化；2、酶分子改造与化学修饰、遗传修饰；3、酶、细胞和原生质体固定化；4、酶反应器；5、酶的非水相催化；6、核酸酶、抗体酶的研究7、模拟酶、合成酶以及酶分子的人工设计、合成的研究8、酶的应用。三、酶工程的主要任务

通过预先设计，经过人工操作控制而大量所需的酶，并通过各种方法使酶发挥其最大的催化功能。对酶及生物催化剂的认识的发展

……生物催化剂（Biocatalyst）蛋白质类：天然酶（Enzyme）极端酶（extremozyme）抗体酶（abzyme）

生物工程酶核酸类：Ribozyme

模拟生物催化剂

克隆酶

遗传修饰酶

蛋白质工程新酶

采用生物体生产酶剂是从19世纪末开始的。

1894年，日本的高峰让吉首先从米曲霉中制备得到高峰淀粉酶，用作消化剂，开创了近代酶的生产和应用的先例。

1908年，德国的罗姆（Rohm)从动物胰脏中制得胰酶，用于皮革的软化；

第二节

酶工程发展概况1908年，法国的波伊登制备得到细菌淀粉酶，应用于纺织品的退浆；

1911年美国的华勒斯坦制成木瓜蛋白酶，用于除去啤酒中的蛋白质浑浊。此后，酶的生产和应用逐步发展。

1949年，用液体深层培养法进行细菌α-淀粉酶的发酵生产，揭开了近代酶工业的序幕。50年代以后，随着生化工程的发展，大多数酶制剂的生产已转向微生物液体深层发酵的方法。

1960年，法国的雅各和莫诺德提出操纵子学说，阐明了酶生物全面的调节机制。使酶的生物合成可以按照人们的意愿加以调节控制。通过酶的诱导和解除阻遏，可以显著地提高酶的产量。

20世纪80年代迅速发展起来的动、植物细胞培养技术。植物细胞、动物细胞都可以如同微生物细胞一样，在人工控制条件的生物反应器中进行培养，通过细胞的生命活动，得到人们所需的各种产物，其中包括各种酶。例如，通过植物细胞培养可以获得超氧化物歧化酶、木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、过氧化物酶、糖苷酶、糖化酶等。通过动物细胞培养可以获得血纤维蛋白酶原活化剂、胶原酶等。

1953年，德国的格鲁布霍费和施来斯首先将聚氨基苯乙烯树脂重氮化，然后将淀粉酶、胃蛋白酶、羧肽酶和核糖核酸酶等与上述载体结合，制成固定化酶。

1969年，日本的千烟一郎首次在工业上应用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸生产L-氨基酸。学者们开始用“酶工程”这个新名词来代表有效地利用酶的科学技术领域。1971年第一次国际酶工程学术会议在美国召开，当时压倒的主题是固定化酶。

此后，为了省去酶的分离纯化过程，出现了固定化菌体（固定化死细胞）技术。

1973年日本在工业上成功地利用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。现在已经有多种固定化酶用于大规模工业化生产。例如，利用固定化葡萄糖异构酶由葡萄糖生产果葡糖浆；利用固定化青霉素酰化酶生产半合成青霉素或头孢霉素；利用固定化β-半乳糖苷酶生产低乳糖奶等。

在此基础上，70年代后期，出现了固定化细胞（又称固定化活细胞或固定化增殖细胞）技术。固定化细胞是指固定在载体上，在一定的空间范围内进行生命活动（包括生长、增殖、新陈代谢）的细胞，可以反复或连续使用在发酵生产上。

1978年，日本的铃木等人用固定化细胞生产α—淀粉酶研究成功。此后用固定化细胞生产蛋白酶、糖化酶、溶菌酶、天冬酰胺酶、果胶酶等的研究蓬勃展开。然而，固定化细胞只能用于生产胞外酶等容易分泌到细胞外的产物。对于胞内酶及其他胞内产物的生产必须采用80年代中期才发展起来的固定化原生质体技术。

1986年开始，华南理工大学生物工程研究所用固定化原生质体发酵生产碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、谷氨酸脱氢酶等的研究相继取得成功，为胞内酶的连续生产开辟了崭新的途径。

20世纪80年代以来，酶分子修饰技术发展很快，修饰的方法主要有：酶分子主链修饰，酶分子侧链基团修饰，酶分子组成单位置换修饰，酶分子中金属离子置换修饰和物理修饰等。通过酶分子修饰，可以提高酶活力，增加酶的稳定性，消除或降低酶的抗原性等，尤其是20世纪80年代中期发展起来的蛋白质工程，已把酶分子修饰与基因工程技术结合在一起。通过基因定位突变技术，可把酶分子修饰后的信息储存于DNA之中，经过基因克隆和表达，就可以通过生物合成的方法获得具有新的特性和功能的酶。

1984年，克利巴诺夫（Klibanov)等人进行了有机介质中酶的催化作用的研究，发现脂肪酶在有机介质中不但具有催化活性，而且还具有很高的稳定性。改变了酶只能在水溶液中进行催化的传统概念。与水溶液中酶的催化相比，酶在有机介质中的催化具有提高非极性底物或产物的溶解度、进行在水溶液中无法进行的合成反应、减少产物对酶的反馈抑制作用、提高手性化合物不对称反应的对映体选择性等显著特点。

近20多年来，在酶和细胞固定化技术发展的同时，其他的酶分子修饰技术也不断发展。此外，核酶、抗体酶、酶的化学合成、人工模拟，以及各种酶的应用技术的研究，使酶工程已经成为生物工程的主要内容。今后将不断地向广度和深度发展，显示出广阔而诱人的前景。

一、酶作用的特点

极高的催化效率

高度的专一性

酶催化作用的条件温和

酶活性可调控

有的酶需辅助因子第三节酶的基本知识（一）、酶的专一性酶催化作用的专一性是酶是最重要的特性之一，是酶与其他非酶催化剂的最主要的不同之处。酶的专一性是指一种酶只能催化一种或一类结构相似的底物进行某种类型的反应。

酶的专一性可以按其严格程度的不同，分为下列两大类：1、结构专一性

概念：酶对所催化的分子（底物，Substrate）化学结构的特殊要求和选择

类别：绝对专一性和相对专一性2、立体异构专一性

概念：酶除了对底物分子的化学结构有要求外，对其立体异构也有一定的要求

类别：旋光异构专一性和几何异构专一性绝对专一性和相对专一性

绝对专一性

有的酶对底物的化学结构要求非常严格，只作用于一种底物，不作用于其它任何物质。

相对专一性有的酶对底物的化学结构要求比上述绝对专一性略低一些，它们能作用于一类化合物或一种化学键。

1）键专一性有的酶只作用于一定的键，而对键两端的基团并无严格要求。

2）基团专一性另一些酶，除要求作用于一定的键以外，对键两端的基团还有一定要求，往往是对其中一个基团要求严格，对另一个基团则要求不严格。

锁钥学说：将酶的活性中心比喻作锁孔，底物分子象钥匙，底物能专一性地插入到酶的活性中心。

诱导契合学说：酶的活性中心在结构上具柔性，底物接近活性中心时，可诱导酶蛋白构象发生变化，这样就使使酶活性中心有关基团正确排列和定向，使之与底物成互补形状有机的结合而催化反应进行。3、有关酶专一性的学说酶专一性的“锁钥学说”

酶专一性的“诱导契合学说”4、酶的专一性的确定确定某种酶的专一性有好几个步骤。（1）首先要选择一种酶可催化的物质作为该酶的作用底物，通过试验确定其最适的pH值、温度等反应条件；（2）其次是试验底物浓度对反应速度的影响，确定其米氏常数Km和最大反应速度；（3）然后用其他有可能是该酶作用底物的物质，在相同的条件下逐个进行试验，有时要在不同的条件下逐个试验，观察是否有催化反应发生，从而确定该酶是属于绝对专一性还是相对专一性。

（4）对于相对专一性的酶，可作用于一类物质。可以选择几种有代表性的底物，求出各自的Km值。在某些情况下，不同的底物有不同的最适pH值，而pH值对Km有一定的影响。此时必须作出不同底物各自的pH曲线。然后再在各自的最适pH值条件下进行试验，以确定各底物相应的Km值。（5）在进行酶的专一性试验时，所使用的酶和各种底物都要尽可能地纯。对于有不对称碳原子的物质，应分别对不同的光学异构体进行试验。（二）酶具有很高的催化效率酶的催化效率可比一般催化剂高106～1020倍。如：H2O2→H2O+O2H2O2酶为5×106

mol；Fe2+

为6×10-4

mol（三）反应条件温和，酶易变性失活（四）体内酶活性是受调控的（五）酶的催化活性与辅基、辅酶和金属离子有关E+SP+EES能量水平反应过程

G

E1

E2酶（E）与底物（S）结合生成不稳定的中间物（ES），再分解成产物（P）并释放出酶，使反应沿一个低活化能的途径进行，降低反应所需活化能，所以能加快反应速度。酶催化的中间产物理论二、酶催化机理1、邻近效应和定向效应

邻近效应(proximityeffect)是指在酶促反应中，底物分子结合到酶的活性中心，底物在酶活性中心的有效浓度大大增加，有利于提高反应速度；

定向效应(orientationeffect)是指酶的活性中心的立体结构和相关基团的诱导和定向作用，使底物分子中参与反应的基团相互接近，并被严格定向定位，使酶促反应具有高效率和专一性特点。（二）底物形变（张力学说）

酶与底物结合，不仅使酶分子构象发生变化，同时也使底物分子发生扭曲变形，称为应变或形变效应（straineffect)。这是由于酶与底物结合之后,一部分结合能被用来削弱底物分子中的敏感键,产生键扭变,有助于过渡态的形成,降低了底物反应的活化能,从而使反应速度大大加快。（三）、共价催化

某些酶分子的催化基团可以通过共价键与底物分子结合形成不稳定的共价中间产物，这个中间产物极易变成过渡态，因而大大降低了活化能，使反应速度大为提高。这种催化称为共价催化（covalentcatalysis)。1、亲核催化（nucleophiliccatalysis)是指酶活性中心的亲核催化基团提供一对电子，与底物分子中的缺少电子具有部分正电荷的碳原子形成共价键，从而产生不稳定的共价中间物。酶分子中可作为亲核基团2、亲电子催化是指酶活性中心上的亲电子催化基团从底物分子的亲核原子上争夺一对电子，形成共价键，从而产生不稳定的共价中间物。（四）、酸碱催化

在酶活性中心上，有些催化基团是酸催化基团向底物分子提供质子；有些催化基团是碱催化基团从底物分子接受质子。当酸催化基团和碱催化基团共同发挥作用时，可以大大提高底物反应速度，这种催化就称为酸碱催化。His咪唑基就是许多酶的酸碱催化基团。酶分子中可作为酸硷催化的功能基团（五）活性部位疏水空穴的影响

已知某些化学反应，在非极性（低介电常数）的介质中，其反应速度比在极性（高介电常数）介质中快得多。酶分子的活性中心是位于非极性的空穴中的，因此，非极性的空穴有利于提高酶促底物反应速度。与酶的高效率有关的主要因素——“邻近”和定向效应——张力学说——共价催化——酸碱催化——微环境影响三、影响酶催化作用的因素（一）底物浓度与酶反应速度的关系

Michaelis&Menten

于1913年推导出了上述矩形双曲线的数学表达式，即著名的米氏方程。

Vmax

•［Ｓ］ｖ＝

Ｋｍ＋［Ｓ］

米氏常数的意义（1）当ν=Vmax/2时，Km=[S]。因此，Km等于酶促反应速度达最大值一半时的底物浓度。

（2）Km可以反映酶与底物亲和力的大小Km越小，酶与底物的亲和力越大。（3）可用于判断反应级数：当[S]<0.01Km时，反应为一级反应；当[S]>100Km时，ν=Vmax，反应为零级反应.（4）.

Km是酶的特征性常数：在一定条件下，某种酶的Km值是恒定的，因而可以通过测定不同酶（特别是一组同工酶）的Km值，来判断是否为不同的酶。（5）.Km可用来判断酶的最适底物：当酶有几种不同的底物存在时，通过测定酶在不同底物存在时的Km值，Km值最小者，即为该酶的最适底物。（二）、抑制剂对反应速度的影响

凡是能降低酶促反应速度，但不引起酶分子变性失活的物质统称为酶的抑制剂(inhibitor)。

按照抑制剂的抑制作用，可将其分为不可逆抑制作用(irreversibleinhibition)和可逆抑制作用(reversibleinhibition)两大类。

1、可逆抑制作用：

抑制剂以非共价键与酶分子可逆性结合造成酶活性的抑制，且可采用透析等简单方法去除抑制剂而使酶活性完全恢复的抑制作用就是可逆抑制作用。

可逆抑制作用包括竞争性和非竞争性抑制两种类型。

竞争性抑制的速度方程与图形特征

竞争性抑制的双倒数图形特征

竞争性抑制的特点：⑴竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或反应产物；⑵抑制剂与酶的结合部位与底物与酶的结合部位相同；⑶抑制剂浓度越大，则抑制作用越大；但增加底物浓度可使抑制程度减小；⑷动力学参数：Km值增大，Vm值不变。

非竞争性抑制作用：抑制剂既可以与游离酶结合，也可以与ES复合物结合，使酶的催化活性降低，称为非竞争性抑制。

非竞争性抑制的速度方程与图形特征非竞争性抑制的双倒数图形特征非竞争性抑制的特点：⑴非竞争性抑制剂的化学结构不一定与底物的分子结构类似；⑵底物和抑制剂分别独立地与酶的不同部位相结合；⑶抑制剂对酶与底物的结合无影响，故底物浓度的改变对抑制程度无影响；⑷

动力学参数：Km值不变，Vm值降低。

竞争性抑制作用非竞争性抑制作用竞争性非竞争性抑制作用机理示意图底物与酶专一性结合2、不可逆抑制作用

抑制剂与酶分子的必需基团共价结合引起酶活性的抑制，且不能采用透析等简单方法使酶活性恢复的抑制作用就是不可逆抑制作用。酶的不可逆抑制作用（如有机磷农药对胆碱酯酶的抑制和重金属、碘乙酰胺对巯基酶的抑制）。

专一性不可逆抑制剂

这类抑制剂选择性很强，它只能专一性地与酶活性中心的某些基团不可逆结合，引起酶的活性丧失。实例：有机磷杀虫剂-Ser-OH-Ser-OPO-RO-ROPO-RO-ROX非专一性不可逆抑制剂

抑制剂作用于酶分子中的一类或几类基团，这些基团中包含了必需基团，因而引起酶失活。类型：（三）、激活剂对反应速度的影响

能够促使酶促反应速度加快的物质称为酶的激活剂。酶的激活剂大多数是无机离子，如K+、Mg2+、Mn2+、Cl-等。

（四）、酶浓度对反应速度的影响

当反应系统中底物的浓度足够大时，酶促反应速度与酶浓度成正比，即ν=k[E]。（五）、温度对反应速度的影响

一般来说，酶促反应速度随温度的增高而加快。但当温度增加达到某一点后，由于酶蛋白的热变性作用，反应速度迅速下降，直到完全失活。酶促反应速度随温度升高而达到一最大值时的温度就称为酶的最适温度。

温度对酶促反应速度的影响（六）、溶液pH对反应速度的影响

观察pH对酶促反应速度的影响，通常为一“钟形”曲线，即pH过高或过低均可导致酶催化活性的下降。酶催化活性最高时溶液的pH值就称为酶的最适pH。

pH对酶促反应速度的影响

人体内大多数酶的最适pH在6.5～8.0之间。酶的最适pH不是酶的特征性常数。

pH对酶促反应速度的影响，其原因主要是由于pH的改变导致了酶的催化基团以及底物分子的解离状态改变或者导致了酶蛋白的变性。

四、酶的活力测定在酶的生产及应用过程中，经常要进行酶的活力测定，以确定酶量的多少及其变化情况。

酶活力是指在一定条件下，酶所催化的反应速度。反应速度越大，意味着酶活力越高。

酶催化反应速度，用单位时间内底物的减少量或产物的增加量表示。即：V=S/t或P/t

1、酶活力测定方法酶活力测定方法多种多样。总的要求是快速、简便、准确。酶活力测定均包括两个阶段。首先要在一定的条件下，酶与其作用底物反应一段时间，然后再测定反应液中底物或产物变化的量。一般采取如下步骤：（1）根据酶的专一性，选择适宜的底物，并配制成一定浓度的底物溶液。（2）根据酶的动力学性质，确定酶促反应的温度，pH值、底物浓度、激活剂浓度等条件。（3）在一定条件下，将一定量的酶液与底物溶液混合均匀，适时记下反应开始的时间。（4）反应到一定的时间，取出适量的反应液运用各种生化检测技术，测定产物的生产量或底物的减少量。为了准确地反映酶促反应的结果，应尽量采用快速、简便的方法，立即测出结果。若不能立即测出结果的，则要及时终止酶反应，然后再测定。终止酶反应的方法很多，常用的有：①反应时间一到，立即取出适量的反应液，置于沸水浴中，加热使酶失活；②立即加入适宜的酶变性剂，如三氯醋酸等，使酶变性失活；③加入酸或碱溶液，使反应液的pH值迅速远离酶催化反应的最适pH，从而终止反应；④将取出的反应液立即置于低温冰箱、冰粒堆或冰盐溶液中，使反应液的温度迅速降低至100C以下等等。

测定反应液中物质的变化量，可采用光学检测法，化学检测法等生化检测技术。例如，用分光光度法测定碱性磷酸酶催化硝基酚磷酸水解生成的对硝基酚的量；用化学滴定法测定糖化酶催化淀粉水解生成的葡萄糖的量等等。一种酶可能有多种测定方法，要根据实际情况选用。

2、酶活力单位活力单位（activeunit）

习惯单位（U）:底物(或产物)变化量/

单位时间国际单位（IU）:1μmoL变化量/

分钟

Katal（Kat）：1moL变化量/

秒比活力=总活力单位总蛋白mg数=U(或IU)mg蛋白量度酶催化能力大小量度酶纯度比活力（specificactivity）3.固定化酶的活力测定

与水不溶性载体结合，在一定的空间范围内起催化作用的酶称为固定化酶。固定化酶的性质与游离酶有一些区别。所以固定化酶的活力测定与游离酶活力测定方法也有一些不同。常用的固定化酶测定方法：（1）振荡测定：称取一定重量的固定化酶，放在一定形状，一定大小的容器中，加入一定量的底物溶液,在特定的条件下,一边振荡或搅拌,一边进行催化反应，经过一定时间，取出一定量的反应液进行测定。固定化酶反应液的测定方法与游离酶反应液的测定方法完全相同，振荡或搅拌速度对反应速度有很大影响。过大过小都对反应速度有明显影响。所以，在测定固定化酶的活力时，要在一定的振荡或搅拌速度下进行。

（2）柱法测定：将一定量的固定化酶装进具有恒温装置的反应柱中，让底物溶液以一定的速度流过酶柱，收集流出的反应液。按常规方法测定底物的消耗量或产物的生成量。测定方法与游离酶反应液的测定方法相同。但在测定固定化酶活力要在固定的流速条件下进行。而且酶柱的形状和径高比都对反应速度有明显影响。所有这些条件都必须固定不变。（3）连续测定法：利用连续分光光度法等测定方法可以对固定化酶反应液进行连续测定，从而测定固定化酶的酶活力。测定时，可将振荡反应器中的反应液连续引起连续测定仪（例如，双束紫外光分光光度计等）的流动比色杯中进行连续分光测定。或者使固定化酶流出的反应液连续流经流动比色杯进行连续分光测定。酶活力的连续测定，可以及时并准确地知道某一时刻的酶活力变化情况，对利用固定化酶进行连续生产和自动控制有重大意义，这方面正在不断地研究发展之中。（4）

固定化酶的比活力测定：游离酶的比活力可以用每1ml酶蛋白所具有的酶活力单位数表示。在固定化酶中，一般要采用每1mg干固定化酶所具有的酶活力单位数表示，即为[单位/mg干固定化酶]。为此，测定固定化酶比活力时，首先用湿固定化酶测定其酶活力，然后将固定化酶在一定条件下干燥，称取一定量的干重，然后计算两者的商,才得到固定化酶的比活力。也可称取一定量的干固定化酶，让它在一定条件下充分溶涨后进行固定化酶活力测定，再计算比活力。对于酶膜，酶板或酶管等固定化酶，其比活力则以单位面积的活力单位表示。即为[酶活力（单位）/cm2]。（5）酶结合效率与酶活力回收率的测定：将一定量的酶进行固定化时，不是全部都成为固定化酶，而总是有一部分酶没有与载体结合在一起。为了确定固定化的效果，需要测定酶的结合效率或酶活力回收率。

酶结合效率一般由加入的总酶活力减去未结合的酶活力的差值与加入的酶活力的百分比来表示。未结合酶活力，包括固定化后滤出固定化酶后的滤液以及洗涤固定化酶的洗涤液中所含有的酶活力的和。

酶活力回收率是指固定化酶的总活力与用于固定化酶总活力的百分比。当固定化方法对酶活力没有明显影响时，酶结合效率与酶活力回收率的数值相近。然后固定化方法往往对酶活力有一定影响，两者的数值往往有较大的差别。所以，通常都通过测定酶结合效率来表示固定化的效果。（6）相对酶活力测定：具有相同酶蛋白量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力。固定化酶的相对酶活力与载体结构，颗粒大小，底物分子量大小及酶结合效率等有密切关系。相对酶活力的高低表明了固定化酶应用价值的大小。故此，在固定化酶的研制过程中，应从固定化载体，固定化技术等方面进行研究和改进，以提高固定化酶的相对酶活力。

第四节

酶的生产方法酶的生产是指经过预先设计，通过人工操作控制而获得所需的酶的过程。酶的生产方法可分为提取法、发酵法以及化学合成法等3种。其中，提取法是最早采用而沿用至今的方法，发酵法是50年代以来酶生产的主要方法。而化学合成法仍在实验室阶段。一、提取分离法提取分离法是指将酶从细胞或其他含酶原料中提取出来，再与杂质分开，而获得符合研究或使用要求的酶制品的过程。提取法分离法是最早采用的酶生产方法。酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程，也称为酶的抽提。酶提取时首先应根据酶的结果和溶解性质，选择适当的溶剂。根据酶提取时所采用的溶剂或溶液的不同，酶的提取方法主要有盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取和有机溶剂提取等方法。

酶的分离纯化是采用各种生化分离技术使酶与各种杂质分离，达到所需的纯度，以满足使用的要求。酶的分离纯化方法主要有：

1、沉淀分离（1）盐析沉淀法（2）等电点沉淀法（3）有机溶剂沉淀法（4）复合沉淀法（5）选择性变性沉淀法

2、离心分离

3、过滤与膜分离

4、层析分离（1）吸附层析（2）分配层析（3）离子交换层析（4）凝胶层析（5）亲和层析（6）层析聚焦

5、电泳分离（1）纸电泳（2）薄层电泳（3）薄膜电泳（4）凝胶电泳（5）等电点聚焦电泳6、萃取分离（1）有机溶剂萃取（2）双水相萃取（3）超临界萃取（4）反胶束萃取7、结晶（1）盐析结晶法（2）有机溶剂结晶法（3）透析平衡结晶法（4）等电点结晶法8、浓缩与干燥选用酶的分离纯化的要点：

1、目标酶分子特性及其他物理化学性质；2、酶分子和杂质的主要性质差异；3、酶的使用目的和要求；4、技术实施的难易程度；5、分离成本的高低；6、是否会造成环境污染等

从动物、植物或微生物的组织、细胞中提取分离所需的酶，至今仍然使用。例如，从动物胰脏中提取胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶或这些酶的混合物——胰酶；从动物胃中提取胃蛋白酶；从动物小肠中提取碱性磷酸酶；从木瓜中提取木瓜蛋白酶；从菠萝中提取菠萝蛋白酶；从柠檬酸发酵的废菌体——黑曲霉菌体中提取果胶酶等。酶的分离提取技术不但在酶的提取分离法生产中使用，而且在采用其他生产方法生产酶的过程中也是不可缺少的技术，此外，在酶的结构与功能、酶的催化机制、酶催化动力学等酶学研究方面也是不可缺少的重要手段。二、生物合成法生物合成法是50年代以来酶生产的主要方法。它是利用微生物细胞、植物细胞或动物细胞的生命活动而获得人们所需酶的技术过程。

生物合成法产酶程序1、经过筛选、诱变、细胞融合、基因重组等方法获得优良的产酶细胞；2、在人工控制条件的生物反应器中进行细胞培养，通过细胞内物质的新陈代谢作用，生成各种代谢产物。3、再经过分离纯化得到所需的酶。经过预先设计，通过人工操作，利用微生物细胞的生命活动合成所需酶的方法又称为发酵法，根据微生物培养方式的不同，发酵法可分为固体培养发酵、液体深层发酵、固定化细胞发酵和固定化原生质体发酵等。

固体培养发酵的培养基,以麸皮、米糠为原料，加入其他必要的营养成分，制成固体或半固体的麸曲，经过灭菌、冷却后，接种菌株后在一定条件下进行发酵，已获得所需的酶。

其优点是：设备简单，操作方便，麸曲中酶的浓度较高，特别适合各种霉菌的培养和发酵产酶。其缺点是劳动强度较大，原料利用率较低，生产周期较长。

现在普遍使用的是液体深层发酵技术。是置于生物反应器中，经过灭菌、冷却后，接种产酶细胞，在一定条件下，进行发酵，生产所需的酶。例如，利用枯草杆菌细胞生产淀粉酶、蛋白酶，利用黑曲霉生产糖化酶、果胶酶，利用大肠杆菌生产谷氨酸脱羧酶、多核苷酸聚合酶等。其特点是：机械化程度较高，技术管理较严格，酶的产率较高，质量稳定，产品回收率较高。用固定化细胞生产胞外酶。固定化细胞是指固定在水不溶性的载体上，在一定空间范围内进行生命活动的细胞。例如，固定化枯草杆菌细胞生产α–淀粉酶，固定化黑曲霉细胞生产糖化酶、果胶酶等。其特点是：1、细胞密度大，可提高产酶能力；2、发酵稳定性好，可以反复使用或连续使用较长时间；3、细胞固定在载体上，流失较少，可以在高稀释率的条件下连续发酵，利于自动化生产；4、发