透明质酸发酵工艺优化

透明质酸发酵工艺优化姓名：杨兴旭学号：060516211一、 实验目的1、通过查阅资料并结合所学知识，了解并完成实验方案设计及过程。2、熟悉培养基制备、种子培养、发酵过程控制及菌种制备。3、掌握透明质酸理化性质、纯化及含量测定方法。二、 实验原理透明质酸又名玻璃酸（Hyaluronicacid，简称HA）,是一种高分子量的线性大分子粘多糖，广泛存在于生物体的结缔组织及部分细菌中的高聚物。1934年Meyer等首先从牛眼玻璃体中分离得到HA,1937年Kendell等从菌株中提取到HA。微生物发酵法，所需的原料易得，大大降低了生产成本。同时由于透明质酸存在于菌体英膜上,易于与菌体分离,因而减少了提取成本。此后,人们对于HA的生理作用、化学结构、理化性质、分布、制备工艺及其在医疗、化妆品和美容保健品方面的应用进行了广泛深入的研究。HA是由N-乙酰葡萄糖胺和葡萄糖醛酸通过8-1,4和”-1,3糖苷键反复交替连接而成的一种高分子聚合物，由分子中的二种单糖（8-D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-氨基葡萄糖）按等摩尔比交互连接而成。HA在空间上呈刚性的螺旋柱构型，柱的内侧含有大量的羟基，因而产生强烈的亲水性，HA分子间这种特定的构型，使其具有很高的润湿和粘度作用。目前，随着微生物发酵法生产HA技术成为新的研究热点，本实验通过对发酵条件温度、碳源、氮源、接种量pH等条件进行优化，探究如何更好发酵生产HA,因为发酵液HA以游离状态存在所以易于HA的分离纯化。能够产生HA的链球菌有A群和C群两类，其中A群主要有化脓链球菌，因为其致病性较高,一般不用作生产菌种；C群有兽疫链球菌、马疫链球菌、类马链球菌等均属于非人体致病菌，所以可以用作HA的生产菌种，链球菌属的大部分细菌都能够像胞外分泌以HA为主要成分的荚膜。发酵法生产HA就是利用微生物在生长繁殖过程中向胞外分泌以HA为主要成分的荚膜，然后通过分离纯化而制备得到HAHA白色、无固定形态、无臭无味，具有较强的吸湿形、溶于水，不溶于有机溶剂。透明质酸的合成途径葡萄糖经糖酵解(EMP)途径形成6-磷酸果糖，然后在酶的作用下形成6-磷酸葡萄糖胺，进而合成UDP-GlcNAc；而UDP-GlcA是通过糖醛酸途径合成的。菌体的HA分子链的延长是从内源HA的非还原端进行的，HA合成酶交替地将尿苷二磷酸-N-酰基-氨基葡萄糖和尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸以每分钟约100个糖单位的速度快速添加到HA分子链上，同时逐渐增长的HA链会穿过质膜被送到胞外基质中。HA的发酵生产主要工艺流程如下：斜面种子——摇瓶种子——接种——发酵培养——补料——放罐——发酵液（加乙醇粗提）——粗提液（加助滤剂、活性炭，调pH）——过滤（去除杂质）——滤液（乙醇沉淀）——沉淀物（脱水干燥）——成品透明质酸三、 实验材料、试剂及仪器发酵菌种（实验室保藏）、磷酸缓冲溶液：87.7mL0.2mol/L的KHPO与12.3mL0.2mol/L24的KHPO混合，配置成100MlpH6.0的溶液。24亚硝基胍溶液：需在通风橱中配制，准确称取40mgNTG,将其置于棕色瓶中，加1mL丙酮，溶解，随后添加磷酸盐缓冲液19mL,配制成2mg/mLNTG溶液番红染液：准确称取番红2.59，将其溶于95%乙醇中，定量100mL，取该配置好的溶液10mL与80mL蒸馏水混匀，即为番红溶液。硼砂硫酸溶液：将4.77g四硼酸钠溶于500mL浓硫酸中培养基配方：斜面培养基种子培养基：发酵培养基：培养基再生固体培养基：葡萄糖0.2%，蛋白胨0.5%，酵母粉0.2%，琼脂2%，磷酸氢二钾0.25%，硫酸镁0.15%，pH=7.0种子培养基：葡萄糖1%，蛋白胨1.5%，酵母粉0.6%，磷酸氢二钾0.25%，硫酸镁0.15%，谷氨酸0.1%，pH=7.0发酵培养基：葡萄糖4%，蛋白胨0.6%，牛肉膏0.6%，酵母粉0.6%，磷酸氢二钾0.2%，硫酸镁0.2%，，pH=6.9以上pH值用氢氧化钠调节，121°C湿热灭菌20min蒸汽发生器、发酵罐及控制系统、空气压缩机、紫外分光光度计，1、 透明质酸含量测定：CTAB浊度法取1mL标准液或样液于试管中，准确加入2mLCTAB试液自加入时开始计时，轻轻振摇，然后静置10min，于400nm波长下测定吸光度（A400。以HA浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，作标准曲线。根据测定的吸光度值，计算出HA浓度。2、 菌体量测定：在波长640nm测定发酵液吸光值。3、 斜面摇瓶培养：取活化于斜面的菌种两环，接入装有50mL种子培养基的250mL的三角瓶中，摇瓶转速200r/min，培养温度37C，培养时间约14h。将培养好的种子接入装有25mL发酵培养基的250mL的三角瓶中，接种量为10%。4、 单因素实验测定：根据发酵条件温度、碳源、氮源、接种量、pH等条件进行单因素实验。5、根据单因素试验结果，确定各因素水平，以HA产量为检查指标，选用正交旋转组合设计进行研究，以确定最佳试验条件。6、根据单因素试验结果，确定各因素水平，以HA产量为指标,选用正交试验设计进行研究，以确定最佳摇瓶发酵条件。HA含量的测定：（Bitter-Muir氏法）原理：葡萄糖醛酸与沸腾的浓硫酸作用，经过脱竣反应形成戊搪，同时产生二氧化碳，二氧化碳与硼砂咔唑反应生成红色，在530nm处有最大吸收值，该吸收值与葡萄糖醛酸含量成线性关系。发酵液中残余葡萄糖的测定：（3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS）法）原理：在碱性溶液中，葡萄糖被氧化为糖酸和其他产物，3，5-二硝基水杨酸则被还原成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定的范围内,葡萄糖的含量和棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸的颜色的深浅成正比关系,利用分光光度计在540nm波长处测定OD值,查对标准曲线、计算,便可求出发酵液中葡萄糖的含量。五、实验步骤

HA的发酵生产主要工艺流程如下:斜面种子一摇瓶种子一接种一发酵培养一补料一放罐一发酵液（加乙醇粗提）f粗提液（加助滤剂、活性炭，调pH）f过滤（去除杂质）一滤液（乙醇沉淀）一沉淀物（脱水干燥）一成品透明质酸1、菌株活化取实验室-20°C保藏甘油管菌株,摇瓶进行活化（30°C,200rpm,12h）,涂布于平板，30C倒置培养24h,4°C保存。种子培养方法在装液量为100mL的锥形瓶（500mL）中接入已经活化好的单菌落菌种，放在摇床中设置温度30C、转速200r/min,培养至菌液ODnm为0.5~0.7，大约需要14h6002、摇瓶发酵2、摇瓶发酵按5%按5%（v/v）的接种量将种子液转移接到装50mL发酵培养基的250mL摇瓶中，接种后的摇瓶置于30C下200rpm培养，9h后用4MNaOH或4MHPO调节pH为6.0左右。343、发酵培养基成分和发酵条件对HA的影响采用单因素方式筛选适合HA合成的最佳碳源、氮源、无机盐的种类及添加量。若无特殊说明，每组单因素实验均设置3组平行实验。（1）温度对于菌体生长和发酵的影响在原始发酵培养基的基础上接种后选择温度条件分别为28C，30°C,32°C,34°C,36°C,38°C下，放在摇床中设置转速200r/min进行培养，考察温度对于菌体生长及透明质酸合成的影响，发酵结束取样品测定细胞密度,及产物含量。（2）接种量对于菌体生长及发酵培的影响在原始发酵培养基的基础上,用装有50mL发酵液的250mL三角瓶在最适温度下进行分别接种量为5%,6%,7%,8%,9%,10%的条件下,放在摇床中设置转速200r/min进行培养,考察接种量对于菌体生长及透明质酸合成的影响,发酵结束取样品测定细胞密度,及产物含量。3）pH对于菌体生长及发酵培的影响在原始发酵培养基的基础上,用装有50mL发酵液的250mL三角瓶在最适温度下接种量为5%条件下调节发酵培养基pH分别为6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5,9.0下,放在摇床中设置转速200r/min进行培养，考察pH对于菌体生长及透明质酸合成的影响,发酵结束取样品测定细胞密度,及产物含量。4）不同碳源对发酵的影响（葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖和木糖）将基础发酵培养基中的葡萄糖依次以相同质量分数的蔗糖、果糖、麦芽糖、半乳糖、木糖替换,其余组分及添加量均不变,在37C、200r/min条件下发酵24h。研究碳源类别对HA合成量的影响。持其他组分比例不变,初始葡萄糖添加量分别为20g/L、40g/L、60g/L、80g/L、100g/L、120g/L，设置温度为37°C、摇床转速为200r/min,培养时间为24h,发酵结束后测定HA的浓度，选择碳源为2.0%，酵母膏1.0%，蛋白胨1.0%，KHPO0.2%，NaCl240.2%,MgSO・7HO0.03%,pH=7.2,装量为10%；37C,100rpm培42养18h。5）不同氮源对发酵的影响氮源及其添加量对透明质酸合成的影响分别以牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、玉米浆、黄豆粉和硫酸铵为氮源,分析氮源对菌体合成HA的影响,当氮源为2.0%,葡萄糖2.0%,KHPO0.2%,NaCl0.2%,MgSO・7HO2 4 4 20.03%,pH=7.2，装量为10%,37C,100rpm培养18h。4、指标测定（1）HA含量的测定：（Bitter-Muir氏法）标准曲线的制备：精密量取100pg/mLHA标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL,分别置于20mL具塞试管中，各加水至1.0mL,混匀,冰浴中冷却,并在不断搅拌下缓缓加入硼砂硫酸溶液5.0mL,密塞,沸水浴中加热10分钟,放冷。精密加入咔唑溶液0.2mL,摇匀,沸水浴中加热15分钟,放冷。照紫外-可见分光光度法（中国药典2005年版二部附录WA）,在530nm波长处测定吸光度，以葡萄糖醛酸的Mg数（mg）对相应的吸光度计算回归方程（回归相关系数〉0.990）。（2）发酵液中HA待测样品液的制备：将10mL的发酵液加入其2倍体积的酒精中，室温下搅拌后静置30min,离心，弃上清液，再加入1同体积蒸馏水，溶解，即得供试样品液。在实际测定时，需要根据发酵液中HA含量稀释一定倍数，使分光光度计的读数在0.2-0.8之间。测定：精密量取供试溶液1.0ml置于具塞试管中，按照标准曲线制备自“冰水浴中冷却”起依照该法进行操作，测定吸光度，从标准曲线上查出相应的葡萄糖醛酸质量（mg）。计算：根据理论计算，HA分子中葡萄糖醛酸的含量为46.32%，故葡萄糖醛酸质量实验材料：3，5-二硝基水杨酸试剂（DNS）：将6.3g3，5-二硝基水杨酸和262mL加ol/L的NaOH溶液，加到500mL含有182g酒石酸钾钠的热水溶液中，搅拌完全溶解，再加5g重蒸酚和5g亚硫酸氢钠于其中，搅拌溶解，冷却后定容到1000mL,溶液为黄色，贮于棕色瓶中。lmg/mL葡萄糖标准溶液：准确称取经105°C烘至恒重的分析纯无水葡萄糖1g，置于干燥小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后在容量瓶定容至1000mL。混匀，4C冰箱中保存备用。测定方法：葡萄糖标准曲线的制作取6支25X250mm试管编号，按表3.1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。单因素实验结果进行响应面分析实验通过前面单因素试验，分别考查了各单因素对HA产量的影响，在此基础上，采用二次回归旋转组合设计对产HA发酵培养基进行优化，以获得适宜培养基组分，从而提高HA产量。根据单因素实验结果，选择酵母膏、蛋白胨、葡萄糖和MgSO・7H0四个因素，通过组试42验对自变量和因变量进行分析DNS法实验方法试管编号试剂012345葡萄糖标准液/mL—0.10.20.30.40.5相当于匍萄糖量/mg0.10.20.30.40.50.1蒸馏水/mL0.50.40.30.20.1—DNS试剂/mL0.50.50.50.50.50.5沸水浴5min，冷水冷却至室温蒸馏水/mL8.08.08.08.08.08.0A540将上述各管混匀，沸水浴5min,冷却至室温，于分光光度计波长540nm处进行比色。用0号管进行调零点，测出1-5号管吸光度（A）。以葡萄糖含量（mg）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。样品中还原糖的测定取发酵液适当浓度稀释液（测定OD值最好在0.2-0.8之间）0.5mL于25X250mm试管中，加入0.5mLDNS试剂，同葡萄糖标准曲线操作，测吸光值。根据测得的0D值在标准曲线上查出相应的糖量，并按下式计算出发酵液中葡萄糖的含量。计算葡萄糖含量——一A 由标准曲线上查得葡萄糖的质量，mg；0.5——