基因修饰生物学特性及免疫调控作用研究

缩略词ethanesulfonicN-2．羟乙基哌嗪-N’，2一乙hydroxyethylgrowth次黄嘌呤转磷酸核糖基hypoxanthinephosphofibosyl-异丁基甲基黄嘌L-L—L．谷氨酰分mixedlymphoc”es混合淋巴细胞反M_M莫洛尼氏鼠白血病感染强stern缩略词ethanesulfonicN-2．羟乙基哌嗪-N’，2一乙hydroxyethylgrowth次黄嘌呤转磷酸核糖基hypoxanthinephosphofibosyl-异丁基甲基黄嘌L-L—L．谷氨酰分mixedlymphoc”es混合淋巴细胞反M_M莫洛尼氏鼠白血病感染强stern间充质干humanstem人间充质mousemesenchymalstem小鼠间充质干细thiazolyl噻唑optical光密osteogenic骨分化添plaqueforming噬斑形成外周血淋磷酸盐缓冲碘化丙P—磷酸对硝基苯酚二钠p“。5i87。p1‘‘8“‘。rs‘8。“”‘。8”e1)衄氧化增子的，22rotationperribonucleie核糖核RT-chain逆转录reverse订秒干细胞抗原stemcellantigen-scarer扩散因三羟甲基氨基甲Tyrode’sBSSTyrode’sbalancedsaltTyrode’s平衡盐溶TGF-transforminggrowthfactor—转化生长因子中文摘HGF基因修饰的MSC生物学特性及免疫摘间充质干细胞(Mesenchymalstemcell，MSC)可通过细胞中文摘HGF基因修饰的MSC生物学特性及免疫摘间充质干细胞(Mesenchymalstemcell，MSC)可通过细胞间作用及分泌细因子(HGF、TGF．B等)抑制淋巴细胞增殖，与造血于细胞共移植能够减低的发生。肝细胞生长因子(Hepatocytegrowthfactor,HGF)在小鼠异基因骨髓植模型中具有免疫抑制和修复损伤作用，从多环节减轻GVHD的发生，同时保GVL效应。为明确MSC和HGF基因两者联合是否具有免疫协同效应，我们开YHGF基因修饰MSC免疫调控作用的研究。期望为HGF基因修饰骨髓间充质干胞防治GVHD提供实验基础我们利用Percoll密度梯度离心与贴壁培养扩增人骨髓来源的MSC，化后骨片培养的方法分离纯化小鼠骨来源的MSC。上述细胞均呈贴壁生长的成维细胞样形态，表型特征分析显示细胞为非造血非内皮细胞群，分化试验证明胞具有体外成骨和成脂肪能力，说明获得的细胞符合MSC的确认“标准”在此基础上，我们观察了HGF基因转染对MSC生物学特性的影响。首先，用携带GFP基因的腺病毒载体(Ad．GFP)感染MSC，以GFP为报告基因，确了重组腺病毒对MSC的感染效率。流式检测结果表明，腺病毒感染强度MOI为时，感染效率几乎达到了100％；我们利用相同MOI的Ad。HGF感染MSC，用法检测HGF的分泌表达，结果表明感染后HGF可在短期内高效表达。提示腺病可以有效介导HGF在MSC中表达为确定HGF基因转染对MSC生物学特性的影响，我们检测了转HGF基MSC(MSC—HGF)的细胞表型，结果表明转HGF基因不影响MSC表型基因细胞相似，MSC—HGF仍表达CD29、CD73、CDl05、CDl66和不表达CD3l、CD34、CD45以及HLA—DR。我们进一步检测了MSC—HGF的分性能，诱导脂肪分化后油红。染色显示MSC．HGF体外成脂肪能力正常；诱导骨分化后进行ALP活性染色和定量以及Ca沉积定量均表明MSC．HGF成骨能力；用地塞米松诱导后，在mRNA水平检测到成骨、脂肪和软骨分化相基因的表达；另外，不诱导时MSC-HGF与MSC成骨、成软骨和成脂肪标志分表达无差异，说明HGF基因修饰本身不引起间充质干细胞分化，并且不影响4中文摘体外多向分化潜能，从以上两方面可以认定中文摘体外多向分化潜能，从以上两方面可以认定HGF基因修饰不改变MSC固有MSC表达HGF受体C．Met。我们研究表明重组HGF可以明显诱导MSC的迁移而且存在剂量依赖关系。应用低血清饥饿的细胞损伤模型，我们观察到进入S期的细胞百分比明显高于对照组，说明HGF基因转染增强MSC在低血境中的存活能力，表明MSC—HGF自分泌HGF有可能调节Msc的归巢我们进一步观察了MSC．HGF在体内外的免疫调节作用。在体外混合淋巴应中，MSC。HGF可显著抑制由异基因淋巴细胞或有丝分裂原刺激引起的淋巴胞增殖，并呈现剂量依赖关系，与MSC组间差异有显著的统计学意义，说明基因修饰显著增强MSC体外免疫抑制功能。在此基础上，我们按5×105cells／只雌性C57BU6J的MSC．HGF(或者MSC)由尾静脉输注至BALB／c受体小鼠体内之后建立异基因小鼠 rBALB／c)皮肤移植模型，以评价MSC—HGF内免疫调节作用。结果证实：与MSC组比较，MSC—HGF输注可以明显延长异基因皮肤移植物存活时间；组织病理分析也提示MSC—HGF减轻了异基因免反应引起的病理变化，对组织有一定的保护作用，上述结果表明MSC—HGF可制体内正在进行的免疫反应过程，从而促进移植皮肤存活和减轻病理损害通过以上结果，可以得出：1)HGF基因转染MSC功能特性；2)HGF基因修饰可增强MSC抵抗低血清损伤的能力，促进细胞活及归巢；3)转染HGF基因的MSC在体内外具有免疫抑制作用。本研究为基因修饰MSC在干细胞移植和免疫疾病中的应用提供了实验基础关键词：间充质干细胞，肝细胞生长因子，腺病毒载体，免疫调节，混合淋巴胞反应，异基因皮肤移英文摘studiesoncharacteristicsstemcellsactivitiesfactorhepatocyteproliferationdirectcell—cellcontactcytokinesecretion．Theco—ofculturedandtreatmentandstemcellsispotentiallyfortheGVHD．Previousdatahavealsodemonstratedhepatocytepeliotropiccytokineofmesenchymaloriginpromotingsurvivalinacells．Thus，HGFthematurationintodevelopmentthymus英文摘studiesoncharacteristicsstemcellsactivitiesfactorhepatocyteproliferationdirectcell—cellcontactcytokinesecretion．Theco—ofculturedandtreatmentandstemcellsispotentiallyfortheGVHD．Previousdatahavealsodemonstratedhepatocytepeliotropiccytokineofmesenchymaloriginpromotingsurvivalinacells．Thus，HGFthematurationintodevelopmentthymusinhibitalloimmunereactioninthealleviationofseveritywhile andidentifyiftheimmuneeffectofGVLinvestigatedfunctionofAd—behaviorMSC—ofof thestrategy．Then，wefunctionMSC—HGFbotll加vitroandinvivo．TheresultsshowedthatMSC—HGFexhibitthanMSConsuppressivecellularimportantly,MSC—survival MSCthe(C57--MSC—HGFincontrollinginthesettingsofallogeneicmarrowwereisolatedMSCandgradientculture—expandedadherencetoplasticflasks．MousecompactbonederivedweregainedIIdigestedbonecollagenasethemselvesasfibroblast-likecytometric6英文摘cellstheabilityinadipogenesis，revealingthatthecellsgainedbythesemethodsmeetthewell-criteriaforMSCefficiencyoftransfectionbytheadenovirusvectorwasassessedandWas GFPasamountof Ad—HG-modifiedMSCevaluatedwithELISA．TheresultSindicatedthatefficiencyto100％whentheM01英文摘cellstheabilityinadipogenesis，revealingthatthecellsgainedbythesemethodsmeetthewell-criteriaforMSCefficiencyoftransfectionbytheadenovirusvectorwasassessedandWas GFPasamountof Ad—HG-modifiedMSCevaluatedwithELISA．TheresultSindicatedthatefficiencyto100％whentheM01wasinfection．Thus，Ad-toinfectisover-expressedofMSCinfectedbyAd—HGFFurther,thebiologicalindicatedthathumanMSC—HGFincytometry CD29，CD73，CDl05，CDl66，HLA—ABCandCD45wassimilartothatofHLA—profileoftransfectedcellswasunaffected．InvitrodifferentiationthathumanMSC—HGFcouldbeinducedrevealedbyOilRedinofcellularanddepositionextracellularMSC—possessmRNAlevelschondrogeneic—relateddetectedafterdexumethasonetreatment．TheresultsdemonstratedthatofMSC—HGFwerethesameasthosegeneCannotinduceAD—HGFtodifferentiateandthedifferentiationthistreatmenthaslittleoftheintrinsicfeaturesofMSCwereunaffectedbyAd—HGFFurthermore，trans—migrationMSCtomigrateindose-dependentmanner．And，whenMSC-HGFMSCtolow-ofMSC—HGFinstarvation，themarkedlyhie3erthanthatofprotectthatHGFisable7英文摘injuryelicitedbylownutrientofMSC—invitro．MSCimmunoregulatoryLater,weMSC-- concentrationswereCO·-culturedsimultaneouslystimulatedbyallogeneiclymphocytesmononuclearcellswas3H-non—specificmitogen，ConA．LymphocyteshowedthatMSC-HGFcouldexhibitincorporationassay．Theofdose—functionof英文摘injuryelicitedbylownutrientofMSC—invitro．MSCimmunoregulatoryLater,weMSC-- concentrationswereCO·-culturedsimultaneouslystimulatedbyallogeneiclymphocytesmononuclearcellswas3H-non—specificmitogen，ConA．LymphocyteshowedthatMSC-HGFcouldexhibitincorporationassay．Theofdose—functionofMSC—HGFenhancementthereof,sex-matchedtail—skingraftingwasconductedinamousemodeltoobserveMSC—HGFcouldinvivo．Full—thicknesstail—(around0．5×0．5cm2)fromC57／BL(allo—grafting)orBALB／c(syngeneicwhichanwastransferredtothesidesoftherecipient’Samountskinhadbeenremoved．MSC．HGFfemaleC57／BLresultsdemonstratedBALB／cthesurvivalMSC—HGFtreatmentofofexaminationconfirmedMSC—HGFCanalleviatepathologicalchangesproducedbyt11atMSC—response．Thesefindingsstronglymightdown—regulateimmuneresponseprocessinstudies frominjuriescausedbyserurumodificationprotectsMSCmigrationthatmayresultinthechemotaxisintothesitesoftissuedamagevitro ofMSCbothenhancesimmunomodulatoryfindingsmightprovidenovelcuesfortheontheapplicationofMSCandimmune-relatedstemseRingsKeywords：mesenchymalgrowthfactor，adenovirus8日吾日舌异基因造血干细胞移植已成为治愈多种造血和非造血系统良、恶性日吾日舌异基因造血干细胞移植已成为治愈多种造血和非造血系统良、恶性疾病以versus自身免疫性疾病主要的治疗手段，但是，移植物抗宿主病Disease，GVHD)是影响移植效果及长期存活率的主要因素，即使在HLA相合骨髓移植病例中发生率也高达40％一85％。国内外学者不断探索防治GVHD径，其中间充质干细胞(Mesenchymalstemcell，MSC)的应用是一个新方向MSC具有低免疫原性和较低的抗原递呈能力【1。31。在体外，MSC能够不明，MSC在体内能够逃脱异基因反应性T细胞的识别【4、5】。给狒狒输注6x107MSC并同时进行异基因皮肤移植，MSC肤的存活时间，表明MSC对活体内的同种异基因反应同样具有抑制作用【6】，并MSC的抑制效应与细胞来源无关，除了来自供、受者之外，包括第三者同种异MSC或异种MSC均能延长皮肤移植物存活时间[_MSC免疫调节作用机制还未完全阐明，但是相关研究结论大致包括以下几方面。Krampera等[8]关于Msc作用的体外研究认为MSC通过细胞间相互接触，非同源的方式阻止T细胞与抗原递呈细胞(APCs)接触，同时抑制幼稚T细胞和抗原特异性记忆T细胞的免疫应答能力。在静脉输注MSC之后进行的植研究中，MSC能够通过与细胞的直接作用阻止APCs的成熟，诱导T细胞对异因抗原的无反应性，抑制由APCs间接介导的T细胞应答，诱导移植物耐受【9、10】另外，MSC自身可以对细胞毒性T淋巴细胞(cTL)前体细胞表面抗原发生作从而抑制其功能【ll】。DiNicola等㈦提／iIMSC通过分泌可溶性分子如HGF、以及MSC间接触，对T细胞增殖产生抑制效应，而且MSC量越多抑制效果越强多项研究已经考察了MSC潜在的治疗性应用价值。动物实验证明，MSC造血干细胞共移植具有促进植入和阻止GVHD的作用[”】，为临床实验提供了理依据。临床研究初期结果来自于接受第三者MSC移植的一小组病人，尽管在造恢复方面没有改善，但是患者生存率提高【14】。LeBlanc等【15】相合MSC治疗一例重度(IV度)aGVHD的9岁男性患者，该病例常规免疫抑治疗无效，MSC输注后患者的GVHD症状及相关病理表现显著改善，并且在移后1年内保持这种状况。在一个I—II期临床研究中心的报道中，36名接受HSC9日舌骨髓MSC(1．0—2．5x106／kg体重)共移植同时应用CSA和MTX进行GVHD预防日舌骨髓MSC(1．0—2．5x106／kg体重)共移植同时应用CSA和MTX进行GVHD预防血液系统肿瘤患者，与以往病例比较，植入率上升，GVHD发生率减低【16随访资料表明，MSC与HSC共移植是安全的，无急性和远期的MSC相关毒性【17】这些初步结果给MSCI瞄床应用带来了希望肝细胞生长因子(Hepatocytegrowthfactor,HGF)，又称扩散因子factor，SF)，是由分子量69KD的重链(d链，465个氨基酸)和分子量34KD轻链(B链，234个氨基酸)通过二硫键连接成的异二聚体糖蛋白质。HGF种多功能的细胞因子，它能够刺激多种细胞的增殖、迁移、分化，参与血管再HGF在肝脏再生、血管生成、组织修复及肿瘤生长等多个环节发挥着重要作用外，已有的实验证明，肝细胞生长因子具有免疫调节作用。多种免疫细胞包括腺T淋巴细胞、活化的B淋巴细胞、树突状细胞等均表达HGF受体C—met，并且分泌HGF。KuroiwaT和ImadoT先后分别报道了人源HGF基因在小鼠异基因移植模型中的免疫抑制和修复损伤作用：HGF可抑制GⅧD靶器官中细胞凋淋巴细胞浸润，减轻组织损伤，抑制炎性因子表达，有助于建立宿主抗原免受，从而减轻aGVHD和cGVHD的发生；同时由于HGF对胸腺有保护作用进骨髓T细胞再生及其对异基因抗原应答能力，因而保留了GVL效应，可见对预防移植后GⅦD很有意基于以上MSC和HGF在免疫调节方面的研究进展，我们设想高表达HGFMSC应具有更好的免疫调节效应；为此，本研究分离扩增了人和小鼠的骨髓间质干细胞；并利用腺病毒介导的基因转移方法，使MSC高表达HGF；评价了基因转移对MSC表型和分化性能以及对MSC存活、迁移等生物学行利用体内外研究模型，确定了高表达HGF基因的MSC免疫调节作用，该研大MSC的应用并提高其效率第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴第一部分：人和小鼠第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴干细胞是具有自我更新和多向分化能力的细胞，从发育级系上看，干细胞分为全能干细胞、胚胎千细胞和成体干细胞等。骨髓中存在造血干细cells，HSCs)、间充质于细胞cells，MSCs)造血血管母细胞(Hemangi【oblasts)及内皮祖cells，EPC)等多种干／祖细胞。间充质干细胞具有向多种中胚层组织细胞分化能力，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞、心肌细胞和骨髓基质细等。MSC作为基因治疗的靶向载体既可以发挥治疗基因的作用，又可以利用的组织修复及免疫调节功能，因此，在造血干细胞移植、器官移植、各种组织床工作者的重视。此外，MSC在细胞和基因治疗中有其独特的优势从人骨髓中获得，来源相对方便，分离培养方法已相对成熟；2)体外易于扩增短期内可达到治疗所需数量；3)MSC是贴壁生长细胞，易于外源基因的导入表达，例如IL-3和GFP基因对人MSC转染效率可达80~90％【181；4)具有分化潜能，并且可以植入不同组织，局部损伤和应激更加刺激植入；5相关研究，我们首先进行了人骨髓来源MSC及小鼠骨来源MSC的分离培并对其表型和功能进行了鉴定11．1人骨髓样来源于空军总医院的健康献髓者，加肝素(100U／m1)抗凝C57BL／6J小鼠，雌性，2．3周龄，二级，由本院动物中心提供1．3主要试a—MEM培养基购自美国Hyclone公第一部分：人和小鼠间充质千细胞分离、培养及鉴Cell公筛选第一部分：人和小鼠间充质千细胞分离、培养及鉴Cell公筛选后胎牛血清购自美国胰蛋白酶购自美国Amresco公HEPES购自瑞典AmershamL一谷氨酰胺购自北京红星生化技术公Percoll原液购自瑞典Pharmacia公司II型胶原酶购自美国Sigma公鼠抗人单克隆抗体：CD29、CD31、CD34、CD45、CD73、CDl05、CDl66HLA-ABC和HLA—DR购自美国Becton—DickinsonSca一1购自美国Becton—DickinsonB．甘油磷酸钠盐和维生素C钠盐购自Fluka公TGF一131购自美国PeproTech公磷酸对硝基苯酚二钠盐购自美国Amresco公BCIP／NBT碱磷酶染色试剂盒购自北京中杉金桥生物公钙沉积检测试剂盒购自北京中生北控生物公Trizol试剂购自美国Invetrogen公RT-PCR所需试剂：M-MLV逆转录酶购自美国Promega公司；RnasinDNA聚合酶和dNTPs购Oligo(dT)15购自日本TaKaRa公司ToYoBo公司。DL2000marker购自北京天为时代生物公RT-PCR引物序YU．-人ALP、OCN、CollagentypeII、PPARr2和B—小鼠OCN、CollagentypeII、PPAR72和HPRT由Invetrogen英骏生物公司琼脂糖粉购自美国Boiwest公肝素、青链霉素、油红。染料及其他分析纯化学试剂均为国产第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴1．4位置确定互补序列，一般为15—20碱基；G+C含量最好在45．55％左右11m=4(G+c)+2(A+T)估算Tm值，确定退火第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴1．4位置确定互补序列，一般为15—20碱基；G+C含量最好在45．55％左右11m=4(G+c)+2(A+T)估算Tm值，确定退火温度的大致范围，尽量使两引物的值相近；引物3’端不应该选A，因其容易引发错配；软件分析证明引物与非互区同源性低，引物内部及引物之间(尤其3’端)避免二级结构的形成。以下为和小鼠PCR引物序列Sense5’CTTCAAACCGAGATACAAGCACTCAnti5’CAGGCCCATTGCCATACASense5’GCGGTGCAGAGTAnti5’CCTCCTGAAAGCCGATGT CollagenSense5’AGGAGCAGAGCAAAGAGGSense5’GGGACC1AGCTAACTACCp—Anti5’CAGTGATCTc盯Forward5’一Reverse5’一GGAGCTGCTGTGACArCC-Forward5'-GCCTCGCGGTGAGCCTGATC一CollagentypeReverse5’一CTCCATCTCTGCACGGGGT一Forward5'-GCTGTIHrGGGTGAAACTCTG一Reverse5’．A：IAAGGTGGAGATGCAGGTTC一 5’一CACAGGACTAGAACACCTGC一第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴1．5主要仪C02气体培美国Thermoelectron公洁净工第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴1．5主要仪C02气体培美国Thermoelectron公洁净工作北京半导体设备一4。C中国海尔公一80℃超低温冰日本SanYo光学倒置显微日本Olympus公高速台式离心美国Heraeus公水平台式细胞离心法国Jouan公台式高速冷冻离心北京四环科学仪器磁力恒温搅拌上海曹行无线电元件FACSCalibur流式细美国Becton．Dickinson2．9流式数据分析软WinRAR公R450型酶美国Bio—Rad公DU640型紫外分光光度MastercyclerPCR美国Eppendorf琼脂糖凝胶水平电泳北京六一仪器紫外凝胶成像美国uvP公数码照像日本Olympus公上海精科仪器细胞培养板和培养美国Costar公1．6主要试剂及配第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴1．6．1Percoll将Percoll原液用1．5MNaCI溶液稀释10倍，作为第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴1．6．1Percoll将Percoll原液用1．5MNaCI溶液稀释10倍，作为贮液。将Percoll贮液和×PBS按0．56：O．44II型胶原酶消化液取II型胶原酶0．Ig，完全溶解于d—MEM培养基中，过滤除菌，加lOml(20％)胎牛血清，充分混匀即可1．6．3细胞培养液(完全培养基(100U／m1)+链霉素(100ug／m1)，4℃放置1．6．4成骨分化诱导培养液(Osteogenic9】(1)1)1000xDex(Dexamethasone；地塞米松C22．H29F05，MW：392．46购自取25mg溶于去离子水成64ml，即得10。3M溶液，过滤除菌，EP管分装一20℃冻存，使用时稀释10倍即可2)IOOXp—GP(D—Glycerophosphatedisodium；B一甘油磷酸钠盐C3H706PNa25H20，Mw：306．12购自取3．069溶于a—MEM成10ml，过滤除菌，EP管分装，一20。C冻存Salt；维生素C钠盐3)1000XAsAP(2-phospho—L-C6H806，MW：176．1购自取0．1619溶于去离子水成10ml，过滤除菌，EP管分装，．20。C冻存(2)标准诱导剂(工作液Dex：lOOnmol／L；B—GP：10retool／L：AsAP：0．05mmol／L(3)配制标准诱导培养液100ml：在88．7mla—MEM培养基中添加10ml胎血清(10％)，加入1000xDex0．1ml，100x[3一GPIml，1000xAsAP第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴1000x青链霉素0．1ml，混匀，4℃保存1．6．5ALP显色BufferlII缓冲液"Iris—HCl(PH=9．5)：100mM；NaCh100mM；MgCl2：50mM。取Tfis—NaCl0．58449，MgCl2第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴1000x青链霉素0．1ml，混匀，4℃保存1．6．5ALP显色BufferlII缓冲液"Iris—HCl(PH=9．5)：100mM；NaCh100mM；MgCl2：50mM。取Tfis—NaCl0．58449，MgCl21．01659，用蒸馏水稀释至100ml1)Tyrode’S平衡盐溶液(Tyrode’SbManced成MgCh．6I-1NaI-D一葡萄糖充分混匀，过滤除菌，4。C2)溶液I：10mlVl磷酸对硝基苯酚二钠盐口-ni仃ophenylphosphate，c出斜购自Alllresco，使用终浓度5mM，配制浓度10配制100ml水溶液：需固体O．3719，溶于100ml蒸馏水，棕色瓶4。C保存3)溶液II：125mM甘氨酸水溶液甘氨酸3．1ml调节pH至10．5，补水至100ml，4。C保存氯化镁使用终浓度lmM，配制浓度10第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴配制50ml水溶液：需固体0．1029，溶于50ml蒸馏水中，4"C保存第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴配制50ml水溶液：需固体0．1029，溶于50ml蒸馏水中，4"C保存碱性磷酸酶检测试剂工作液：按照溶液I：II：III=10：8：25)ALP检测终止液(3NNaOH)：6．OgNaOH溶于水成50ml1．6．7脂肪分化诱导培养液(Adipogeniesupplements)‘1(1)1)100xDex(Dexamethasone；地塞米松)(10qM)：(同1．6．4中2)100XIBMX(3一isobutyl-1-methylxanthine；异丁基甲基黄嘌呤取100mg溶于DMSO成9ml，EP管分装，．20。CC19H16C1N04，MW：357．79，购自取200mg溶于DMSO成5．5891ml，EP管分装，一20。C冻(2Dex：lumol／L；IBMX：0．5retool／L；Indomethacin：100umol／L(3)配制标准诱导培养液100ml：在87．7mla—MEM培养基中添加10ml胎lml，500xIBMX0．2ml，100xIndomethacin血清(10％)，加入青链霉素O．1ml，混匀，4"COilRedO染O粉末溶于99％异丙醇100ml中，滤纸过滤，即得取0．59贮液；贮液与蒸馏水按照3：2比例在使用前混合即得工作液1．6．9三系非特异分化诱导培养液配制诱导培养液100ml：在ft．一MEM培养基中添加10ml胎牛血(10％)，加入10ul，1000x青链霉素0．1ml，混匀，4"C保存DEPC处理在1L蒸馏水中加入 DEPC原液，充分混匀，置于37"C浸泡处理之后高压蒸气灭菌15rain质量数分子量=1微摩尔数第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴需要配制成50nmol／ml(50uM即0．25ug／u1)终浓度溶液，需加入PCR引用双蒸水配制第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴需要配制成50nmol／ml(50uM即0．25ug／u1)终浓度溶液，需加入PCR引用双蒸水配制成25uM终浓度溶液，EP管分装，一20。C保存XTAE57．1ml，0．5M100ml，调pH值至7．0，补加蒸水至1升取琼脂糖粉1．29，充分溶于1×TAE电泳缓冲液，加入7．5ulEB混即可2．1人间充质干细胞分离培取肝素抗凝的正常人骨髓5ml，用lml注射器过滤后，加入PBS以1：1比稀释骨髓，充分混匀，计数后调整有核细胞浓度为1x107cells／ml，按照1：1比将骨髓细胞悬液小心加于Percoll(1．0739／m1)工作液液面离心30min：吸出单个核细胞层，用两倍体积的PBS稀释，混匀，2000rpm离8min；用PBS再洗细胞1次；用完全培养基(ct-MEM+10％筛选FBS)重胞计数后按2×105cells／cm2密度分瓶培养；72h后换液，去除未贴壁细胞。以每3-4天换液。原代培养第4天可见分裂中的形态为纺锤形的贴壁细胞，第6可见明显细胞克隆形成，第10天可见细胞呈多向螺旋生长达80％汇合，将细用0．05％胰蛋白酶EDTA消化传代，按3000—6000cdls／cm2瓶，记为第1代(P1)，第3代细胞用于本实验研2．2小鼠间充质干细胞分离培C57BL／6小鼠(雌性，2．3周龄)断颈致死，75％酒精浸泡5min消毒；剪腿部皮肤肌肉，分别取出股骨和胫骨，剪去残留骨骺端和肌肉，浸泡于完全基中；用注射器冲出骨髓后彻底冲洗骨髓腔；将骨段剪成大约lmm3大小的放入含有O．2％(1mg／m1)II型胶原酶的n．MEM+10％FBS完全培养基中，37。C200rpm振摇消化2h；终止消化后，用a—MEM冲洗骨片3遍，加入完全培养第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴(it．MEM+10％筛选FBS+双抗)，置于37"C，5％C02培养第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴(it．MEM+10％筛选FBS+双抗)，置于37"C，5％C02培养箱中；第3骨片周围形成明显的细胞克隆，此时更换培养基，以去除未贴壁细胞和骨5天可见克隆生长达80％左右汇合，将细胞用O．05％胰蛋白酶．0．53raMEDTA化传代，按1500cdl“cm2接种新培养瓶，记为第1代(P1)，第3代细胞用实验研究第3代处于对数生长期的培养细胞用O．05％胰蛋白酶消化后进行计数，每反应取细胞1×106，加入冰冷的PBS后1200rpm离心8rain，重悬细胞于中，在人源细胞中加入饱和浓度的FITC或PE标记的鼠抗人CD29、CD31、CD34胞中加入饱和浓度的F1TC或PE标记的大鼠抗小鼠CD29、CD31、CD34、CD44BSA(或FBS)彻底洗涤细胞2遍，用FCMbuffer(含1％多聚甲醛+O．1％叠氮化Calibur流式+O．5％BSA的PBS液)固定细胞。应用Becton．Dickinson公司胞仪以及WinMDI2．9软件对抗体标记的细胞进行检测和分析2．4将对数生长期培养细胞接种于24孔细胞培养板(1．5×104cells／：fL)，继续用完全培养基培养，诱导组培养液中加入标准诱导剂(Dex10raM+AsAP应用邻甲酚酞络合酮比色试剂盒检测钙沉积培养细胞成骨分化诱导第14天，进行碱磷酶染色。BCIP／NBT染色试剂操作步骤：BCIP(100x)、NBT(100x)显色液与Bu船rIII按照1：100比例制工作液并充分混匀，用PBS冲洗细胞后将工作液滴加在细胞上，0．5一lh观察结果第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴培养细胞成骨第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴培养细胞成骨分化诱导第14天，进行ALP定量。用BBS洗涤细空白孔作对照)；在96孔细胞培养板中预加NaOH终止液25“l／孔，从24板移取100Ill／孔至96孔板相应孔中，405ilnl酶联仪测定光密度值，即OD4052．4．3钙沉积定培养细胞成骨分化诱导第21天，进行钙沉积定量。用PBS洗涤细胞2遍加入O．5NHCL0．4ml／孑L，振摇4．6h；将Kit中R1、R2液按1：1混合配制工液；在96孔板中预先加入工作液200111，孔；从振摇后的24孔板移取4uF孑L至孔板相应孔中，室温放置5min，570nm酶联仪测定光密度值，即OD5702．5脂肪分化诱导及检将对数生长期培养细胞接种于24孔细胞培养板(1．5x104cells／j：L)导组继续用完全培养基培养，诱导组培养液中加入标准诱导剂(Dexo．5mM+消炎痛100uM)进行脂肪分化诱掣1吼，每3天换液，第8天进O染色色1—2h，70％酒精洗去过多染料，再用蒸馏水清洗，镜下观察2．6软骨分化诱导及检应用微滴培养方法进行软骨分化诱导[2012”。简言之，将浓缩的细胞悬液(8×106cells／m1)滴至6孔细胞培养板中心处，置于6C贴壁2h，将软骨分诱导液(0【一MEM+1％FBS+6．25u∥ml胰岛素+50nM维生素C磷酸盐TGF—B1+1％抗生素)轻轻覆盖于细胞团上，诱导维持2周2．6．1文献表明在PH值曼1时，一种特殊染色可以检测存在于软骨基质中的硫酸第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴蛋白聚糖【”。软骨分化第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴蛋白聚糖【”。软骨分化诱导2周时，用4％多聚甲醛室温固定细胞团洗涤数次，在含1％(w／v)阿辛蓝的0．1MHCL(PH1．0)溶液中染色30min，O．1MHCL清洗以去除多余染料2．7非特异分化诱导及检将对数生长期培养细胞接种于25cm2中培养瓶(1000cells／cm2)，非诱组继续用完全培养基培养，诱导组培养液中加入Dex进行三系非特异分诱导渊，每3天换液，第14天提取细胞总RNA，进行RT-PCR，分别用13-(人)和HPRT(小鼠)作为mRNA定量的参照2．7．1半定量RT-PCR检测三系分化基因表首先提取细胞总RNA：用PBS溶液洗细胞两次，按lml／5x106cells比例培养瓶中加入Trizol试剂，反复吹打以充分裂解细胞；将细胞裂解液移入Triz01)，剧烈管中120009离心lOmin；取上清加入0．2ml氯仿(每荡15s，室温放置2min；4℃120009离心15min，使水相和有机相分取上层水相，移至另一新EP管中，加入O．5ml异丙醇(每 Tfiz01)，混匀室温放置120009离心10mira弃上清，用75％的乙醇在空气中自然干燥5～lOmin；用含RNA酶抑制剂的DEPC水溶解RNA，可55。C．60"C温育10min。利用紫外分光光度计测RNA的纯度，计算浓度，样品于一70逆转录反应体系为25ul，反应过程为：RNA样品2ug，OligodT引物lug，DEPC处理水补足14ul，混匀后70。C水浴5min，立即放于冰上，离心后加入下试剂：M-5ul，M-MLVRTlul，2．5mMdNTPs5ul，Rnasin(25U)；40"C水浴中反应1h分别取eDNA样品lul和0．1ul作为模板，用下述PCR反应体系扩增参照因13-actin和HPRT第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴O．5BlendO-Blend模板模板依据参照基因扩增结果，进行样品mRNA定量，之后在25ulPCR反第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴O．5BlendO-Blend模板模板依据参照基因扩增结果，进行样品mRNA定量，之后在25ulPCR反应中，应用前述引物序列，按照下述反应条件扩增目的eDNA，1．2％琼脂糖泳和紫外凝胶成像分析结果PCR反应参H1．1mall942min_÷(94℃40see-÷58．2。cycles_÷72℃1094。40sec-94℃2min_÷(94。C94"C2min-÷(94。C40sec_÷72℃29see)x32cycles-95"C2min_÷(94"CB—cycles-PCR反应参Mouse940C2lnin_(94"C40sec-÷50℃40sec-÷72℃24sec)×32cycles_÷72℃1094℃2min_÷(94。94。C2rain-÷(94℃40see_÷55℃40see_÷72℃21see)×32cycles_÷72℃1094。C2rain_÷(94"C40sec-÷52℃40see_÷72℃15see)x22cycles_÷72℃10第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴2．8统计学分实验数据用平均值士标准差表示，应用学生t检验对成骨分化碱磷酶和钙形成进行统计学显著性分析。P值<O．05则差异具有显著的统计学意义3．结3．1人间充质干细胞生长形人MSC不同生长阶段形态如图1．1所示。经Percoll密度梯度分离出人骨单个核细胞培养，72h后换液去除未贴壁细胞。原代培养第4天可见分裂中的纤维样贴壁细胞(A)，第6天可见多个细胞克隆形成(B)，第10天可见细均～的成纤维样细胞形态，呈多向螺旋生长，80％克隆汇合形成单细胞层(C)CAB图1-1人MISC原代培养各生长时期A：+4d可见单个细胞分裂B：+6d细胞克隆形成C：+10d单细胞层形成3．2人MSC免疫表我们利用流式细胞仪检测了本实验分离培养的细胞表面抗原表达情况。其达细胞黏附分子：CD29、CD73(SH一3，4)、CDl66及HLAI类分子(HLA-第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴性间第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴性间充质标志的培养细胞比例高，因此这一结果从FCM对细胞表型检测角度实了我们获得的细胞符合间充质干细胞性质(图l一2畦kk．虻HLA-亡忙t虻图l-2人MSC表型分收集第3代细胞，以相应抗体进行标记，流式细胞仪进行检测，采_【流式数据分析软件进行分析3．3体外诱导人MSC脂肪分化潜能是问充质干细胞的基本生物学特性之一，我们采用MF报道的方案对分离培养的细胞进行体外诱导，诱导第8天光镜下观察可见与未诱导组相比细胞形态发生改变，胞内布满圆形透亮脂质空泡，应用OilRed原位染色检测脂质沉积，染色后可见脂滴均呈红色深染，说明有大量脂肪细胞成，因此这一结果从脂肪分化潜能角度证实了我们获得的细胞符合间充质干细性质(图l一3)第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴BA图1．3人MSC细胞进第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴BA图1．3人MSC细胞进行脂肪分化诱导培养，第8天时可见胞内出现脂肪滴，进行Red染色，在显微镜下观察可见大量A：未诱导细胞中没有脂肪滴出现B：诱导后细胞内脂肪滴形成3．4体外诱导人MSC成骨分化潜能也是问充质干细胞的基本生物学特性之一，我们采用MF报道的方案对分离培养的细胞进行体外诱导，诱导第14天光镜下观察可见与未诱导组相比细胞形态发生改变，大量扁平状细胞形成，成骨指标检测结果图1-4A、4B所示，其中ALP活性定量MSC诱导组OD405为未诱导组为0．1742±0．0366，两组问存在显著性差异(p<O．01)；钙沉积定量诱导组OD570为1．4594±0．068，未诱导组为O．306±0．028，著的统计学意义(p<0．01)，由此可知成骨指标均为阳性表达，提示有大量成细胞生成，因此这一结果从成骨分化潜能角度证实了我们获得的细胞符合间充干细胞性第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴露图1-4人MSC成骨分细胞进行成骨分化诱导培养，第14天时进行ALP定量检测(A)，第21天进行沉积定量检测(B)，+与未诱导相比，p<0．01，n=5，差异有显著的统计学意义A：诱导第14天进行ALP定量检B：诱导第21天进行钙沉积定量检第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴3．5体外诱导人MSC三系非特第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴3．5体外诱导人MSC三系非特异分问充质干细胞在含有10。8M地塞米松的诱导液中培养2周，可诱导其向脂肪成骨和软骨三系非特异分化。我们也对分离培养的细胞进行体外非特异诱导导第14天提取细胞总RNA，应用RT-PCR检测分化相关基因的表达。当诱后参照基因Dactin的表达量相等时，诱导后细胞mRNA水平ALP、OCN、II的表达量明显高于未诱导细胞(图1—5)，而它们分别是成骨和脂肪和软骨分化的分子标志物。因此这一结果从非特异分化潜能角度证实了我获得的细胞符合间充质干细胞性质图1-5特异性分化基因的表地塞米松诱导分化第14天，Trizol试剂裂解细胞后提取总RNA，应用RT-II的表达。D-actin作为参照基因方法检测ALP、OCN、PPARy2、3．6小鼠间有研究证实小鼠骨密质中的问充质干细胞含量比骨髓更丰富‘241，本实采用ZK[251等报道的小鼠间充质干细胞分离培养方法，将消化后骨片接第一部分：人和小鼠间充质干细胞分第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴于培养瓶中，培养第3天可见骨片周围出现成纤维样细胞形成的细胞克隆[1—6A]，第5天约80％细胞克隆汇合，形成单细胞层[图1—6B]BA图1-6小鼠MSC形A：小鼠股骨骨片培养+3d骨片周围形成细胞克隆B：muMSC．P1单细胞层3．7小鼠MSC免疫表我们应用流式细胞仪检测了从小鼠骨密质中分离培养的细胞表面抗原，如l一7所示，95％以上的细胞表达Sca—l(干细胞抗原．1，(endoglin)表达阳性率约50％，同时其不表达CD34(小鼠造血系、内皮系问充质系祖细胞的非特异标志)，CD45(血细胞标志)和CD31(内皮细胞标志这一结果从细胞表型角度证实了我们获得的细胞群符合问充质干细胞性质第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴％一卜艇妊怪CDl5Ca-第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴％一卜艇妊怪CDl5Ca-图1-7流式细胞仪检测小鼠MSC表收集第3代细胞，以相应抗体进行标记，流式细胞仪进行检测，采用流式数据分析软件进行分析我们采用PittengerMF报道的方案对分离培养的细胞分别进行体外脂肪、成RedO染色，第10天和第14天分别进行和软骨分化诱导。于第8天进行和blue染色。图1-8A和8B显示脂肪分化诱导细胞内形成脂肪滴，未导细胞内则无；图l一8C和8D显示成骨分化未诱导和诱导细胞ALP活性，诱后ALP显著增多；另外，当用Dex、TGF一口等诱导问充质细胞向软骨分化时可形成细胞外基质富集硫酸化蛋白聚糖的细胞团，在酸性环境下能够应用阿辛特异性检测硫酸化蛋白聚糖，如图1．8E和8F所示，在软骨分化诱导液中培养细胞呈现出阿辛蓝染色阳性，表明在其胞外基质中存在硫酸化蛋白聚糖，相对第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴未经分第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴未经分化诱导的细胞无明显染色。因此，我们肯定此群细胞能够特异性分化为肪、成骨和软骨细胞，这一结果从多向分化潜能角度证实了我们获得的细胞图l-8小鼠MSC多向分A、B：细胞进行诱导脂肪分化培养，第8天时可见胞内出现脂肪滴0色显示细胞内脂滴(B)，未诱导组中没有脂肪滴形成(A)c、D：细胞进行诱导成骨分化培养，第10天进行ALP活性染色，诱导后细胞显ALP染色阳性(D)，未诱导组没有被染色(cE、F：细胞进行诱导软骨分化培养，第14天进行阿辛蓝染色，诱导后细胞显示蓝染色阳性(F)，未诱导组阴性(E)第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴根据文献第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴根据文献报道，我们采用Dex作为诱导剂诱导培养细胞的体外非特PPAR72和CollagenII。当诱导前后参照基因HPRT的表达量相等时，诱导后胞三种系列特异性基因均呈阳性表达，未诱导细胞呈阴性表达或低水平表达(l一9)。因此这一结果从非特异分化潜能角度证实了我们获得的细胞符合问充质细胞性质未诱导组诱导图1-9系列特异性分化基因的表地塞米松诱导分化第14天，Trizol试剂裂解细胞后提取总RNA，应用RT-PCR方检测OCN、 II、PPARy2的表达。HPRT作为参照基因4、讨1960s至1970s期间，Friedenstein等[26-29克隆的基质细胞，研究表明这些细胞不仅可形成CFu—F，而且在特定的培养条第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴下体外可向成骨细胞、成软骨细第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴下体外可向成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞分化，之后许多资料均证实能性和可塑性。1999年cells，MSC)的概念33】、胎盘【34】、羊水[35】、心脏‘361、骨骼肌【37】、脂肪组织【38滑液组织【391和胰腺【40】。从现有的研究结论看，我们可以推断基本上所有包缔组织的器官均存在MSC。各组织中MSC含量均低，例如骨髓中MSC}=L1／100000【4“。在移植免疫以及其它研究中最常用的细胞来源仍是骨髓MSC分离方法主要有：贴壁培养法、流式细胞仪分选法、免疫磁珠法和基技术。应用贴壁法分离人骨髓MSC已十分成熟也得到了肯定，但普通贴壁法却法成功分离和培养出性质均一的小鼠MSC群，主要因为小鼠骨髓贴壁细胞成分杂，含有的MSC数量较少而造血细胞较在分离人骨髓来源MSC时，我们把密度梯度离心与贴壁培养相结合。根据度差别，用比重为1．0739／ml的Percoll_=E作液进行各细胞组分的分离，经梯度离后能有效地除去绝大部分红细胞、粒细胞、血小板和脂肪细胞，获得较高纯度单个核细胞群，然后根据MSC与造血细胞贴壁性能差别，贴壁培养过程中随换去除未贴壁的造血细胞。贴壁细胞主要是MSC，但也混有少量的单核或巨噬细以及成纤维细胞，利用这些细胞与MSC对塑料培养瓶的贴壁性强弱不同，细胞代时用0．05％胰蛋白酶静置消化2—3分钟后，MSC开始迅速从培养瓶壁单核巨噬细胞和成纤维细胞由于贴附性强仍未脱落，通过掌握胰蛋白酶的消化时间分选MSC，使其得到纯化。经2—3次传代筛选后细胞形态均一，实明，我们所采用的分离方法能够达到分离纯化细胞的目的，并且不影响细胞生状态，可长期培养扩增为验证分离培养的细胞是否具有间充质干细胞特性，我们对其表型及功能当细胞培养扩增至第3代以后，其表现出比较均一的细胞形态，经流式细仪检测，此群细胞表面表达黏附分子：CD29、CDl66，间质细胞标志分子CD73[4”、CDl05[43】；但不表达内皮细胞标志CD31(PECAM一1)，血细胞标CD34和CD45；表达HLA—ABC(HLAI要提呈内源性抗原)而不表达HLA—II类分子，主要表达在抗原提呈第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴胞以及活化T细胞表面，参第一部分：人和小鼠间充质干细胞分离、培养及鉴胞以及活化T细胞表面，参与外来抗原提呈过程)。因此，我们培养的细胞不无造血细胞混杂，而且符合骨髓间充质干细胞的表型特征由于hMSC形态学与成纤维细胞相似，所以必须通过体外诱导分化的方法明确其是否具有多向分化的间充质干细胞特性。我们对培养细胞进行体外诱导骨分化、成脂肪分化和三系非特异分化，各项分化相关指标检测结果均证培养的细胞具有多向分化潜能，符合骨髓间充质干细胞的功能特征从小鼠骨髓中培养MSC的方法已有多例报道，但是这些研究旨在解决其中显存在的造血细胞混杂的问题，主要途径是免疫磁性分选除去血细胞[4”，在培液中添加成纤维细胞生长因子2(FGF．2)维持muMSC的干细胞性质[451，或者续传代培养刺激muMSC扩增【46】，然而这些操作效果有限。muMSC的另外一个源就是骨B等【24】曾经于2002年报道过在鼠骨密质中存在间充质干细胞干细胞样细胞，他们通过免疫手段去除Lin。造血干细胞，之后应用流式细胞仪择Sea-1+细胞的方法从酶消化骨片后的游离细胞中成功分离出muMSC。另外，文献报道一种从骨分离hMSC的相对简单的方法，即将酶消化后的进行贴壁培养【4”，然而用这种方法分离存在于小鼠骨密质中的MSC的结得到的细胞群是不均一的，仍然有CD45+细胞和成骨细胞混杂，其优势生长造muMSC生长受抑本实验采用了ZK等【”峙艮道的将Ⅱ型胶原酶消化后的小鼠骨片接种的方法分离培养muMSC。我们发现，这种方法分离出的贴壁细胞层形成为5天左右，早于hMSCt481；第3代后呈形态均一的成纤维样细胞形态。流式分显示细胞表面分子CD29、CD44(纤维粘连蛋白和透明酯酸盐受体)、CDl05(种血管特异性的TGF．B共受体，是间充质干细胞和长期造血重建细胞的标志性子)和Sca-1(是间充质系列或造血系列于／祖细胞的表面标志)阳性，而造血胞和内皮细胞标志女11CD34、CD45和CD31阴性，与文献报道的由鼠骨髓中得的MSC表型相符。基因敲除研究已经查明，CDl05对血管生成有重要作用【49】Sea-1N在间充质系列和造血系列干／祖细胞的自我更新中起到关键作用陬5”。后，我们检测了这群细胞在体外定向诱导条件下向成骨、软骨和脂肪分化的诱导成骨分化后细胞ALP形成以及成骨特异性基因OCN表达：在诱导软骨分化typeII基因微滴培养中可见小分子蛋白聚糖的分泌，并且成功扩增诱导脂肪分化后胞内生成的脂滴以及PEAR3,2基因的表达均说明大量脂肪细胞第一部分：人和小鼠问充质干细胞分离、培养及鉴成，从上述结果可见我们从消化后骨片培养中得到的细胞的确是muMSC骨来源的与骨髓来源的muMSC具有第一部分：人和小鼠问充质干细胞分离、培养及鉴成，从上述结果可见我们从消化后骨片培养中得到的细胞的确是muMSC骨来源的与骨髓来源的muMSC具有同样的生物学特性，包括贴壁生长、成纤样细胞形态、表面抗原的表达、体外诱导条件下的多向分化潜基因治疗靶细胞的选择往往倾向于干细胞，因其具有自我更新能力和多向化潜能，可将细胞治疗与基因治疗较好地结合应用。骨髓间充质干细胞是疗中应用非常广泛的一类干细胞，其相对容易分离培养，可在体外迅速扩备向成骨、软骨、脂肪、心肌、神经等多种组织细胞分化的潜能；动物研究已明MSC可以植入至不同组织中，并且局部损伤和应激会增强植入；其免疫原性不引起机体免疫反应；外源基因易于导入和表达等，因此间充质干细胞成为多治疗性分子在基因治疗中的靶向载体【52】。MSC与治疗基因联合作用，既能发功能性基因的治疗功能，又能促进损伤组织的修复与再生。例如，目前已经成将COLIAl基因导入MSC治疗成骨不全[53】；用携带显性负性突变体I型胶的腺病毒载体感染MSC成功修复脆骨病【5钔。HemeOxygenase一1基因转染可促新的研究显示向鼠恶性胶质瘤内注射MSC明显抑制肿瘤的生长；IL一2因修饰MSC明显增强抗肿瘤效果，延长带瘤动物的生存期【56】；IFN—B基因修MSC抑制肺部转移肿瘤的生长【57】，这些研究证明以MSC作为靶向载体的基因疗给难治性肿瘤的治疗带来希望，而且MSC可能具有直接限制肿瘤生长的功能此外，携带治疗基因的MSC已经应用在许多疾病模型中，如帕金森病【583以及总之，以上研究提示MSC在多种疾病治疗中潜在的应用价值。然而，越来多的资料证明，在具体实施过程中，必须考虑植入细胞体内存活、细胞迁分化专一性等诸多问题。为此，在以下的研究中，我们探讨了HGF基因修MSC多种生物学特性的影响第二部分：HGF基因修饰对人骨髓来源问充质干细胞生物学第二部分：HGF基因修饰对人骨髓来源问充质干细胞生物学特性的第二部分：HGF基因修饰对人骨髓来源生物学特性的影肝细胞生因子(Hepatocyte factor,HGF)是一种可引起多种细胞生学效应的细胞因子，目前普遍认为，HGF在细胞增殖、运动与迁移、血管生成造血、抗凋亡、抗纤维化、修复组织损伤和调节细胞免疫等方面发挥重要的生学功能。MSC表达HGF的受体c．met，外源性HGF对MSC迁移有很强的趋作用。有研究提出组织损伤明显增强MSC的植入能力，而在组织损伤时血中是驱动骨髓或组织中的MSC向损伤靶器官迁移和植入的因素之一。因此，在织再生过程中，HGF／c—met信号通路对MSC植入损伤的组织发挥重要作用。外，MSC分泌的HGF也是组织损伤修复时重要的作用因子之一HGF．MSC联合应用的可行性，在以下的研究中，我们应用携带HGF基因的病毒感染MSC，并观察了基因修饰是否会改变其固有的细胞特性以及对MSC11．1腺病毒基因表达载携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体(Ad—GFP)和携带人肝细胞生长因基因的腺病毒基因表达载体(Ad—HGF)由放射医学研究所三室通过细胞内质腺病毒。重组后携带HGF基因的腺病毒质粒线形结构示意图如下图A所示，第二部分：HGF基因修饰第二部分：HGF基因修饰对人骨髓来源问充质干细胞生物学特性的1．2一-MEM培养基购自美国Hyclone公Cell公筛选后胎牛血清购自美国胰蛋白酶购自美国Amresco公HEPES购自瑞典Amersham公第二部分：HGF基因修饰对人骨髓来源问充质干细胞生物学特性的L一谷氨酰胺购自北第二部分：HGF基因修饰对人骨髓来源问充质干细胞生物学特性的L一谷氨酰胺购自北京红星生化技术公RNA酶A购自美国Sigma公鼠抗人单克隆抗体：CD29、CD31、CD34、CD45、CD73、CDl05、CDl66HLA-ABC、HLA—DR购自美国Becton—Dickinson公细胞分化诱导和检测试剂见第一部RNA提取及逆转录反应试剂见第一PCR引物序列及反应参数见第一部其他试剂及分析纯化学试剂均为国产1．3美国electron公C02气体培洁净工作北京半导体设备一一80℃超低温冰日本Sanyo公光学倒置显微日本Olympus公荧光倒置显微镜IX-Tu。。C台式高速冷冻离北京四环科学仪器水平台式细胞离心法国Jouan公美国Heraeus公Biofuge高速台式离心R450型酶美国Bio—Rad公Calibur流式细美国Becton—Dickinson第二部分：HGF基因修饰对人骨髓来源间充质干细胞生物学特性的2．9流式数据分析软第二部分：HGF基因修饰对人骨髓来源间充质干细胞生物学特性的2．9流式数据分析软WinRARDU640MastercyclerPCR美国Eppendorf公琼脂糖凝胶水平电泳北京六一仪器紫外凝胶成像美国UvP公Transwell细胞迁移美国Costar1．4主要试剂及配1．4．1胰蛋白酶．EDTA(1)O．25％胰蛋白酶配制：将D—Hanks液或Dulbeceo液(统称BSS)5．6％NaHC03调PH值至7．2左右，取胰酶粉末19，放入烧杯中，用少许BSS成糊状，再补足至100ml，搅拌均匀，置于室温4h或冰箱内过夜，并不时搅拌振荡。用滤纸过滤，再用无菌玻璃滤器(G6)或蔡氏滤器(EKS2、EKS3除菌，分装后．20℃冻存。此时为1％浓度贮液。临用时将其用BSS按1：4稀(即1份胰酶贮液加3份BSS)，即得O．25％胰蛋白酶溶液，其偏酸性，使用再用5．6％NaHC03调PH值至7．2左右(2)EDTA：化学螯合剂，其溶液又称Versene液(3)胰酶一EDTA消化液：用无钙、镁盐溶液溶解胰酶和EDTA，使其终浓度别为0．25％和0．02％，小瓶分装，一20用1MNaOH调PH值至7．0．8．0，粉末23．89充分溶解于100ml双蒸水中除菌，EP管分装，．20。C冻存。使用时在100ml完全培养基中加入lml贮液第二部分：HGF基因修饰对人骨髓来源间充质干细胞生物学特性的即使第二部分：HGF基因修饰对人骨髓来源间充质干细胞生物学特性的即使用终浓度为10mML-谷氨酰胺溶分子式：C5HIoN203，Mw；146．15。配制50x贮液(250mM)：取L．谷胺粉末3．6549充分溶解于100ral三蒸水中，过滤除菌，EP管分装，一20。C冻存使用时，在100ml完全培养基中加入2ml贮液，即使用终浓度为5mM1．4．4配制1000x贮液：取青霉素(钠盐)100万U，和链霉素(双氢万ug)溶于无菌三蒸水10ml中(每ml含青霉素10万u和链霉素10万EP管分装，．20。C冻存。使用时，在100ml完全培养基中加入100ul贮液，即用终浓度为青霉素100U／ml和链霉素100ug／ml1．4．54％多聚甲醛固定拌并滴加2NNaOH至清澈透明，冷却后补加0．1MPBS至100ml(pH7．4～7．6使用时稀释至浓度分别为1％和2％1％结晶紫染色取19结晶紫染料，充分溶于100ml蒸馏水中，滤纸过滤1．4．8细胞分化诱导及检测试剂见第一部2．2．1重组腺病毒构建、扩增纯化以及病毒滴度测实验室制备重组腺病毒Ad—HGF的过程如下：首先构建携带人肝细胞生长子基因的穿梭质粒pXCJLl一CMV／pA—HGF，然后用LipofeaAMlN介导该质第二部分：HGF基因修饰对人骨髓来源间充质干细胞生物学特性的Ad—HGF，并以噬斑分析法筛选单克隆重组第二部分：HGF基因修饰对人骨髓来源间充质干细胞生物学特性的Ad—HGF，并以噬斑分析法筛选单克隆重组腺病毒，PCR法鉴定阳性克隆之后行扩将293细胞接种于150mm平皿，生长至90％汇合状态时进行病毒感染，染强度(multiplicityofinfection，MOI)约为8-10个噬斑形成单位(plaqueunit，pfu)／细胞。感染36—48h细胞出现完全细胞病变效应时，收集细胞，冻存于．80℃。累计到50。60个平皿时统一纯化病毒氯化铯密度梯度离心法纯化病毒：将收集的293细胞于一80oc并反复冻融3次，2500rpm离心10min去除细胞碎片。依次将溶液、2．5ml1．359／mlCsCl溶液和2．5ml1．259／mlCsCl溶液加入12ml超速离心中，将冻融后的待纯化病毒加于CsCl梯度溶液之上。10*C离心2h，1．359／mlCsCl溶液和CsClCsCl溶液混合10℃离心18h。吸取白色雾状病毒带，与1-2倍体积的PBS稀释。以PBS为透析液于4。C透析病毒，每2h液，共换5次。取出纯化的病毒，加无菌甘油至终浓度为10％，分装，一80。C存紫外分光光度仪测定病毒颗粒数及纯度：根据光密度(opticaldensity,OD10％十二烷基硫测定病毒的颗粒数：取2rtl纯化的病毒加入97山PBS和l钠sulfate,SDS)，混匀；以99山PBS加1出10％SDS作为空白照。测定OD260nm和OD280nm，据此估算病毒的颗粒数和纯快速CPE分析、噬斑分析法测定病毒感染滴度(pfu／m1)：取10wl纯毒加入99CI山DMEM培养基(102倍稀释)，混匀后取100I_tl稀释于培养基中(103倍稀释)，以此类推进行倍比稀释，直至10”倍稀释。提前一天293细胞接种于6孔培养板，接种量为2x106细胞／孔。24h后细胞长至90％汇时，将各孔中培养液吸出，分别加入102一1012倍稀释的病毒液，培养1—2h。CPE分析：将102．106倍稀释的病毒液从各孔中吸出，每孔加入2ml含的DMEM培养基。36．48h后观察CPE，选出发生100％CPE下列公式l计算病毒的感染滴度。噬斑分析法：将107．1012孔中吸出，每孔加入3ml琼脂糖培养基，继续培养4．7d至噬斑形成。选出噬数在30-100的稀释倍数，根据下列公式2计算病毒的感染滴度。最后，采用第二部分：HGF基因修饰对人骨髓来源间充质干细胞生物学特性的感细胞病变法第二部分：HGF基因修饰对人骨髓来源间充质干细胞生物学特性的感细胞病变法检测有复制能力的腺病毒。检测分析结果显示制备的病毒纯度好滴度高，有复制能力的腺病毒存在(附)公式1：感染滴度(pfu／m1)=(2x106细胞／孑L)×稀释倍数×10／公式2：感染滴度(pfu／m1)=平均噬斑数×稀释倍2．2重组腺病毒感染人间充质干细将处于对数生长期的第3代人MSC按照具体实验所需的合适密度接种于养板或培养瓶中，生长24h后，根据实验室前期结论和预实验结果，将感染强(MOI)设为150pfu／细胞，用重组腺病毒Ad-HGF和Ad。GFP感染人MSC程如下：吸弃培养上清，加入含Ad—GFP或Ad．HGF病毒颗粒的无血清n—培养基孵育2h，然后换成含10％血清的完全培养基，继续培养并每天用荧光实验室前期研究认为腺病毒感染后48h时目的基因的表达水平最高此结论，本实验用腺病毒Ad．GFP感染人MSC后，每天观察细胞状态和GFP光强度，在感染48h时应用流式细胞仪检测GFP荧光蛋白表达率／感染效率，程如下：消化细胞后用PBS洗细胞两遍，重悬于含1％多聚甲醛的PBS液进行检测ELISA法检测感染后HGF基因表pftff细胞进行感染，每48h收集培养上清(．70。C冻存)更换新如下：将lOOpl一系列浓度梯度稀释的HGF标准品ng／ml，12．59．6)以将不同时间点收集的培养上清与包被液(0．5mol／1NaHC03缓冲液1的比例混匀，每孔100ul加入酶标板中，每个条件设2个复孔，4℃包被第二部分：HGF基因修饰对人骨髓来源间充质干细胞生物学特性的弃包被液，用第二部分：HGF基因修饰对人骨髓来源间充质干细胞生物学特性的弃包被液，用含5％小牛血清的PBS封闭过夜；加入HGF抗体，每孔100ul，37。孵育60rain；弃一抗，用含0．05％Tween一20的PBS洗去未结合的抗体加入二抗，每孔100ul，37。C孵育45min，用含0．05％Tween．20的PBS洗去未用腺病毒Ad—HGF以MOI=150pfu／细胞感染对数生长期第3代人MSC后时，将MSC和MSC—HGF细胞用0．05％胰蛋白酶消化后进行细胞计数，每个应取细胞1×106，加入冰冷的PBS后1200rpm离心8min，重悬细胞于室温避光放置30分钟，用冰冷的PBS+I％BSA彻底洗涤细胞2遍，用(含1％多聚甲醛+O．1％叠氮化钠+0．5％BSA的PBS液)固定细胞。应Becton—Dickinson公司FACSCalibur流式细胞仪以及WinMDI2．9软件进行检和分MTT测定细将处于对数生长期的人MSC按1×103cdls／孑L比例接种于96孔细胞培养中，每个条件设17个复孔，细胞生长24h后，用Ad-HGF或者Ad—GFPMOI=150pfu／细胞进行感染，感染后48h时应用MTT法检测细胞OD570MTT24小时1次，连续3d，具体步骤是：每孔100p1培养基中加入液10ul，37。5％C02饱和湿度继续培养4h，吸弃上清，每孔加入水平振荡10min溶解紫色结晶，利用酶联免疫吸附仪570nm波长测定各孔光度值。以时间为横坐标、OD570值为纵坐标绘制细胞生