医院检验科培训课件：《飞行质谱在临床微生物检验领域的应用》

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飞行质谱在临床微生物检验领域的应用2质谱技术MALDI-TOFMS简介及工作原理CONTENTS目录010203MALDI-TOFMS拓展应用新进展临床微生物检验现状04MALDI-TOFMS病原菌鉴定的应用301临床微生物检验现状人员少、自动化技术与其他专业发展有差距。为临床提供信息慢：2-4天报告结果。鉴定的菌谱窄:就是几种常见的细菌，几乎难见到少见菌。对丝状真菌、诺卡菌、非结核分枝杆菌、厌氧菌的鉴定常感到很困惑。微生物的人员要求有丰富的专业工作知识。

对困惑的思考，如何解决？

现有方法或者实验成本高，或者耗时长，或者敏感性、准确度不够所以有必要引入全新的微生物鉴定技术有个细菌培养能加急出结果吗？无能为力...友谊的小船说翻就翻o(╥﹏╥)o实验室效率微生物实验室效率有待提升1.提高微生物检验水平2.积极探索快速诊断技术，提高感染性疾病诊断效率2020年7月20国家卫健委抗菌药物管理工作通知梅里埃VitekMSMALDI-TOF质谱为什么检测速度这么快又准？检测的是细菌的核糖体蛋白，而不是细菌代谢的各类酶。省却了做生化反应的培养过程，大大缩短了检测时间。细菌核糖体蛋白

产生多高保守受培养条件影响小

与rRNA基因相关质谱仪用于临床微生物检测2015版《抗菌药物临床应用原则》中提到抗菌药物治疗性应用的基本原则1.诊断为细菌性感染者，方有指征应用抗菌药物2.尽早查明感染病原，根据病原种类及细菌药物敏感选用抗菌药物3.按照药物的抗菌作用特点及其体内过程特点选择用药4.抗菌药物治疗方案应综合患者病情、病原菌种类及抗菌药物特点制定文件解读：快速确定病原种类、用药需确定病原菌种及耐药机制微生物的准确鉴定为进一步选择合适的药物和方法进行药敏试验提供依据。做药敏前，准确鉴定是基础！02质谱技术MALDI-TOFMS简介及工作原理固有耐药定义为固有的或先天的（非获得的）抗微生物药物耐药性，反映一个种所有或几乎所有代表的野生型菌株抗菌谱。由于方法学差异、突变或低水平耐药表达，有很少百分比（1%~3%）菌株可出现敏感。固有耐药附录B.固有耐药11

附录B.固有耐药12附录B.固有耐药13质谱技术、MALDI-TOFMS简介及工作原理CONTENTS目录010203MALDI-TOFMS拓展应用新进展临床微生物检验现状04MALDI-TOFMS病原菌鉴定的应用质谱技术检验医学在临床诊断和治疗监测方面发挥着至关重要的作用，基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等多组学研究成果促进了全新诊断标志物的研究发现和临床应用。质谱技术以其高灵敏度、高特异度和高通量的能力满足组学对复杂的生物标本分子组成及相互关系研究的需求14国际检验医学杂志2021年1月第42卷第1期02质谱技术MALDI-TOFMS简介及工作原理15质谱分析法（Massspectrometry）是将化合物形成离子和碎片离子，按质荷比的不同进行分离测定，来进行成分和结构分析的一种方法。所得结果用质谱图表示。16中华检验医学杂志,2019,42(6):395-398.常用质谱的类型液相色谱-质谱联用技术（liquidchromatography-massspectroscopy，LC-MS）气相色谱质谱技术（gaschromatography-massspectroscopy，GC-MS）电感耦合等离子体质谱技术（inductivelycoupledplasmamassspectrometry，ICP-MS）基质辅助激光解吸飞行时间质谱（matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometry，MALDI-TOFMS）17135762481942年第一台商品质谱仪1960年代末气相色谱-质谱联用仪1981年出现了快原子轰击质谱仪1987年田中耕一发明了MALDITOFMS2002年获诺贝尔奖。1950年代高分辨率质谱仪1970年代液相色谱-质谱联用仪1984年第一台电喷雾质谱仪诞生2002年电喷雾电离质谱和基质辅助激光解析电离质谱开始应用1919年第一台质谱仪弗朗西斯·阿斯顿荣获1922年诺贝尔化学奖18根据离子在飞行管内的飞行速度与M/Z平方根成正比，不同M/Z值的样品离子到达检测器的时间不同，从而实现对不同M/Z值的样品分子的鉴定。18TOFMSMALDI+++++++++++++++++20kvdesolvation+++激光器(337nm/355nm)+20kvTargetelectrodeExtractionelectrodeDrifttube检测器Im/zm1>m2>m3GroundelectrodeIrradiationProtontransfer-2kvPulseHighVacuum(10-5Pa)19常见细菌的鉴定：以16SrRNAMALDI-TODMS基因测序结果为标准，质谱仪正确鉴定率为90.0％～95.0％，远高于以往的商业自动化鉴定系统。酵母菌的鉴定：数据库中已经包含大量的临床酵母菌参考谱图，使其可以用于常规鉴定酵母菌。难以培养或需特殊前处理的菌种20

MALDI-TOFMS主要性能指标质量分辨率灵敏度质量检测范围质量精精度与重复性ppm性鉴定准确率质谱仪的质量分辨率约为1ｋ，更高的分辨率能够使谱图更精细，带来更多的谱图信息量，这对提高检索准确率是有利的。核糖体蛋白分子的质量主要集中在2～20kDa，所以仪器的质量检测上限为30kDa就能满足鉴定需要。线性模式灵敏度一般为ｆｍｏｌ级，实际微生物检测时的灵敏度除了受到仪器本身的限制，还与基质类型、病原种类、样品处理和样品靶表面性质等许多因素有关。MALDI-TOFMS质量检测精度与重复性主要依赖于仪器设计，以及电学系统的精度和稳定性，一般为数百ppm。质量检测精度与重复性是影响微生物鉴定率的关键指标。取决于前面介绍的4个硬件指标，检索算法和数据库等软件系统也是至关重要的。另外，在实际应用时，由于病原种类和样品前处理等因素也会影响最终的鉴定准确率。中华医院感染学杂志，2016，26（10-11）.21质谱技术、MALDI-TOFMS简介及工作原理CONTENTS目录010203MALDI-TOFMS拓展应用新进展临床微生物检验现状04MALDI-TOFMS病原菌鉴定的应用传统生化鉴定(目前常用)质谱鉴定(以EXS3000MS为例)鉴定方法细菌80%左右真菌20%菌种库<550种细菌95%以上、真菌90%以上临床菌>1000种检出率1-2天2-5天直涂约1-2分钟；提取法15~20分钟；上机后10秒内单个样品出鉴定结果花费时间约50元<30%(传统生化鉴定)花费成本不能能溯源分析质谱法与传统生化反应法鉴定临床微生物的比较中元汇吉质谱仪用于临床微生物检测03MALDI-TOFMS病原菌鉴定的应用MALDI-TOFMS可用于对核酸、蛋白质、有机物等的快速分析，包括目前临床应用最为广泛的微生物鉴定、核酸分析等。微生物鉴定核酸分析常见细菌胎儿RHD基因型鉴定难以培养或需特殊理的菌种24丝状真菌丝：状真菌由于所需培养时间长、传统鉴定方法具有局限性，使用MALDI-TOFMS进行丝状真菌鉴定更能体现该方法的快速和准确的优势。分枝杆菌：致病分枝杆菌的慢生长（6周～5个月），使其分离及鉴定难以满足临床需要。随着分枝杆菌种类的增加和机会感染率的增长，急需快速的鉴定方法。MALDI-TOFMS提供了选择。厌氧菌：目前MALDI-TOFMS已能实现对临床常见厌氧菌及许多少见厌氧菌菌种的准确鉴定，并且结果优于传统生化试验方法。一些生化反应相似，不易区分的厌氧菌也可以通过质谱技术进行区分。其他：奴卡菌、巴尔通体、贝纳柯克斯体。难以培养或需特殊前处理的菌种：25一、样本培养条件二、不同类型微生物前处理方法三、上机鉴定流程四、结果报告和解释五、鉴定结果的报告原则六、性能验证、质量控制及日常维护

中华检验医学杂志，2019，42（4）2627282936EXS3000日常鉴定流程中元汇吉EXS3000数据库菌种检索待测菌株本地：>2000种，10000株云端：>4000种，20000株美国CDC

MicrobeNet(超过2600种菌株图谱）传承卓越，性能全面提升形态学参考信息同步呈现质量控制自建谱库对所有建库菌株使用公认的“金标准”方法进行准确鉴定。目前较为常用的方法包括细菌的16SrRNA基因测序、真菌的ITS区测序等。检测中，设置好质谱仪参数。建议每个建库菌株进行不少于3个靶点的平行测试，收集不少于24张有效谱图，最后通过软件进行建库。同型半胱氨酸与甲硫氨酸本地指纹图谱库的建立及质量控制44质谱技术MALDI-TOF

MS简介及工作原理CONTENTS目录010203MALDI-TOFMS拓展应用新进展临床微生物检验现状04MALDI-TOFMS病原菌鉴定的应用病原菌分型、毒力因子直接检测药物的敏感性血培养标本尿液标本脑脊液、胸腹水、胆汁超广谱B内酰胺酶碳青霉烯酶拓展应用耐甲氧西林金黄色葡萄球菌04质谱在临床微生物领域的拓展应用中华医院感染学杂志2016年第26卷第11期性能验证综合效益莫拉菌4月1日用甲酸法的鉴定结果。查看结果后立马查找资料。分数：1.33结果不置性虽然查到了相关资料，但发现实际菌落形态与参考资料上的菌落形态不一致后期发现培养基上还有一明显的菌落，看似污染菌，但为了确认，将两种形态的菌都进行鉴定。案例4月2日鉴定结果白色、菌落较大EXS3000鉴定结果为“里拉微球菌”。透明、细小、扁平的菌落EXS3000鉴定结果为“亚特兰大莫拉菌”。通过分析，目标菌应该是透明、细小的菌落。卫生部给出的正确名称为“亚特兰大莫拉菌”。分数：1