-国家重点实验室电生理技术课件

离子通道的基础知识及其技术医学神经生物学国家重点实验室1.电生理学——生命科学中的信息科学组织的生物电场信息高级处理细胞的电脉冲信息整合和编码细胞膜的电流电信号发生和传递1.电生理学——生命科学中的信息科学之一离子通道：生物电发生的基本元件，也是重要的药物治疗靶点。组织的生物电场信息高级处理细胞的电脉冲信息整合和编码细胞膜的电流电信号发生和传递2.离子通道：重要的药物靶点2.1重要的生理功能细胞生物电现象的基础参与维持细胞正常形态细胞兴奋-收缩偶联和兴奋-分泌偶联细胞跨膜信号转导2.1重要的生理功能细胞生物电现象的基础——静息电位的形成2.1重要的生理功能细胞生物电现象的基础——动作电位的形成2.1重要的生理功能细胞兴奋-分泌-兴奋偶联2.1重要的生理功能细胞跨膜信号转导2.离子通道：重要的药物靶点2.2关键的药物治疗靶点2002年由FDA提供的分析报告指出，目前所有FDA认可的药品中涉及到的治疗靶点基因仅为273个，其中完全认定为药物靶点的7%为离子通道；2006年的调研表明，配体门控和电压门控的离子通道是第三和第四大现有的可治疗基因家族（仅排在G蛋白基因家族和核受体基因家族之后），分别占据7.9%和5.5%；经典的离子通道类临床用药见表1：药物类别药物靶点药物名称抗高血压药物钙通道硝苯地平西尼地平钾通道尼克地尔抗心律失常药物钠/钾通道奎尼丁钙通道地尔硫桌维拉帕米钾通道胺碘酮麻醉药钠通道利多卡因普鲁卡因氯通道/NMDA丙泊酚镇静/催眠/抗癫痫药物钠通道苯妥英钠卡马西平钙通道乙琥胺钾通道氯丙嗪氯通道苯二氮䓬缺血脑保护药物钙通道氟桂利嗪钠通道利法利嗪钾通道氟芬那酸糖尿病药物钾通道优降糖、达美康表1.离子通道：重要的药物靶点3.离子通道——分类分类方法具体类别电压门控性，voltagegated又称电压依赖性(voltagedependent)或电压敏感性(voltagesensitive)离子通道:因膜电位变化而开启和关闭，以最容易通过的离子命名，如K+、Na+、Ca2+、Cl-通道4种主要类型，各型又分若干亚型.配体门控性，ligandgated又称化学门控性(chemicalgated)离子通道，由递质与通道蛋白质受体分子上的结合位点结合而开启，以递质受体命名，如乙酰胆碱受体通道、谷氨酸受体通道、门冬氨酸受体通道等.非选择性阳离子通道(non-selectivecationchannels)系由配体作用于相应受体而开放，同时允许Na+、Ca2+

或K+

通过，属于该类.机械门控性，mechanogated又称机械敏感性(mechanosensitive)离子通道:是一类感受细胞膜表面应力变化，实现胞外机械信号向胞内转导的通道，根据通透性分为离子选择性和非离子选择性通道，根据功能作用分为张力激活型和张力失活型离子通道.基因相似性根据基因序列的相似性或同源性而归类的离子通道，例如TRP家族等。在1902年，Bernstein创造性地将Nernst的理论应用到生物膜上，提出了“膜学说”。他认为在静息状态下，细胞膜只对钾离子具有通透性，即细胞静息电位的钾离子学说；而当细胞兴奋的瞬间，膜的破裂使其丧失了选择通透性，所有的离子都可以自由通过。Hodgkin、Huxley、Katz等人在20世纪30—50年代做出了开创性研究。他们基于电压钳技术，提出并验证了所谓的Hodgkin—Huxley方程，数学模拟出和真实状况相符合的神经冲动的传导，由此建立了细胞动作电位的钠离子学说。离子通道的近代观念也由此产生。4.离子通道研究理论4.离子通道研究技术微电极电压钳-电流钳技术传统膜片钳技术ErwinNeher(1944-)KennethCole(1900-1984)4.离子通道研究技术3.平板膜片钳技术（膜片钳技术新趋势的关键）原创技术专利：表2.膜片钳技术的历史角色年份电生理学中标志性事件1786LuigiGalvani首次在蛙类体内发现生物电现象，电生理学的创始人，1887SidneyRinger发明了蛙心灌流试验用的溶液。1888WaltherNernst提出了Nernst方程。1902JuliusBemstein提出静息电位的K+学说。1937Renshaw首次使用微电极成功记录到了脊髓中间神经元的电活动。1946Gerard首次使用微电极测定了蛙肌细胞膜电位。1949Ling发明了微电极细胞内记录技术，Cole首创的电压钳技术问世，成为电生理学史上重要的里程碑，电生理研究进入细胞时代。1949Hodgkin和Katz提出了动作电位Na+学说。1952Hodgkin和Huxley分离出Na+、K+电流和漏电流。1953Fatt和Katz分离出了Ca2+电流。1964Deck、Kern和Trantwein在浦肯野氏纤维上进行电压钳研究。1976E.Neher和B.Sakmann创立了膜片钳技术，使电生理研究空前活跃，并作为重要的里程碑，标志着电生理分子时代的到来。1980~膜片钳技术、生物大分子技术以及生物光学技术的结合，使人们对生物电现象的认识水平在分子水平取得了重大的突破和丰富。5.传统膜片钳设备的组成电学部分信号放大器数据采集卡

PC周边设备控制器等光学部分：荧光显微镜

CCD照相机监视器激光器等机械部分防震台，气压泵或气瓶高精密微电极操作器灌流操作器显微镜移动平台或可移动载物台辅助部分：信号屏蔽罩微电极拉制仪药物灌流设备温度控制器6.全自动膜片钳设备的组成工作站平板芯片+即：德国Nanion公司Patchliner德国Nanion公司Syncropatch96美国MolecularDevices公司Ionworks7.不同膜片钳技术的比较1记录模式传统膜片钳平板膜片钳7.不同膜片钳技术的比较传统膜片钳高信息量：通道功能的各项指标、结合其他实验记录高灵敏度：pA级、单通道水平适用范围广：不受样本种类限制操作过程复杂，对实验者要求高实验数据量低，难以应用于药物筛选全自动膜片钳操作自动化，简单培训即可使用高效率、高通量实现某些传统膜片钳不具有的功能，例如全细胞模式内液灌流。保持传统膜片钳高信息量和高灵敏度方面程度不一，样本兼容性不一2各自的优缺