原核表达实验流程

原核表达流程：第一步目的基因获取DH5a感受态制备PCR扩增pGEM-T载体重组载体1DH5a感受态细胞转化转化细胞1抽取质粒进行电泳酶切验证检验阳性（阳性）转化细胞1酶切，获取目的基因Pet28a/DH5a载体重组重组载体2第二步重组载体2DH5a感受态细胞转化转化细胞2抽取质粒进行电泳酶切验证检验阳性（阳性）转化重组载体3BL21感受态细胞转化细胞3诱导表达蛋白质提取SDS电泳检测呈阳性目的蛋白一.感受细胞的制备体外连接的DNA重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖。为了提高受体菌摄取外源DNA的能力，提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出了不同的方法处理细菌，使其处于感受态。目前主要采用电转化法和CaCl2法将外源DNA导入受体细胞中，并需要相应地制备电转化感受态细胞和CaCl2感受态细胞。本实验制备的是电转化感受态细胞。实验原理：对于电转化法，因利用瞬间高压在细胞上打孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。(109～1010转化子/μgDNA)实验材料：LB培养基（根据需要确定配制的量）：10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/lNaCl，加水至1000ml，高压灭菌，保存在室温。无抗生素LB琼脂糖平板培养基（根据需要确定配制的量）：10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/lNaCl，15g/l琼脂粉，加水至1000ml，高压灭菌；铺平板，冷却后在37℃10％甘油：10ml甘油加入90mlddH2O其他：DH5α大肠杆菌，灭菌玻璃平皿若干，接菌环，加100mlLB液体培养基的500ml灭菌锥形瓶一个，灭菌50ml离心管若干，冰盒，移液器，灭菌移液器吸头，灭菌Eppendorf管等。实验仪器酒精灯，超净工作台，温控摇床，4℃实验方法(1)将大肠杆菌DH5a贮存菌液在无抗的LB平板划线，37℃培养箱过夜培养（培养好的平皿放入(2)从平板上挑取单菌落接种于5mL无抗生素LB培养基中，37℃振荡培养过夜；(3)按照1:50比例接种过夜菌液至50mLLB培养基中，37℃剧烈振荡培养3小时左右，至OD600达0.3-0.6，最好是0.4(4)当OD600值达到0.4左右时，迅速将菌液冰浴15~30分钟，不时缓慢摇匀以保证内容物充分冷却。将离心管置于冰上预冷，为下一步做准备。（为获得最大效率的转化，在整个操作过程中菌液的温度不超过4℃是关键，以下步骤务必在超净工作台和冰上操作）(5)将细菌培养物转移至冰冷的50mL离心管中，4℃用JA转头（或与之相当的转头）以2500rpm/min离心15min，以回收细胞。倒去培养液，用40(6)4℃用JA转头（或与之相当的转头）以2500rpm/min离心20min，以回收细胞。倒去培养液，用25mL冰冷的10%甘油重悬沉淀。(7)4℃(8)将细胞按40μL等份装入微量离心管，直接使用或-80℃(9)感受态细胞的检测：取感受态细胞分别涂布含有氨苄青霉素和卡那霉素抗性的LB平板，37℃(10)取1μg超螺旋质粒转化制备的感受态，检测转化效率(一般情况下，没有必要精确计算，可用根据经验估计)。略高于琼脂糖板，拨出样品梳。3）DNA样品10μl加5μlGEBS样本液，在腊面纸上混匀，全部加样于琼脂糖板的样品孔中。4）稳压电泳80V约2小时，使溴酚蓝指示剂泳动至适当位置，1-5V/cm。5）取出凝胶板置溴化乙锭溶液中染色20分钟。6）在凝胶成像仪观察结果。7）琼脂糖凝胶与聚丙烯酰胺凝胶的比较：不同浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp-50kb的DNA。聚丙烯酰胺凝胶分离小片段DNA（5-500bp）效果最好。聚丙烯酰胺凝胶与琼脂糖凝胶相比有三个主要优点：基因分子生物学实验指导（1）分辨力强，长度仅相差0.2%（即500bp中的1bp）的DNA分子即可分开；（2）装载DNA量大，一个样品槽可装载10ug的DNA；（3）从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA纯度很高。4．技术要点1）选择琼脂糖凝胶浓度取决于所鉴定DNA的大小，小片段DNA应用高浓度凝胶，大片段则用低浓度凝胶，在1%的琼脂糖凝胶中溴酚蓝的泳动速度与500bp的双链线状DNA一致。不同浓度琼脂糖凝胶及其可分离的线性DNA大小范围见下表1。表1不同浓度琼脂糖凝胶及其分离线性DNA分子的有效范围凝胶浓度（%）分离DNA的有效范围（kb）0.360～50.620～10.810～0.81.07～0.51.26～0.41.53～0.22.02～0.12）电泳中注意防止凝胶发热。3）将电泳仪置稳压档，电压设置小于5V/cm（电极间的最小路径）。随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围缩小。4）溴化乙锭有强烈的致癌作用，操作时注意防护。氨苄青霉素：用去离子水配成50mg/ml的储存液，过滤除菌，－20℃卡那霉素：用去离子水配成50mg/ml的储存液，过滤除菌，－20℃无抗生素LB琼脂糖平板培养基（根据需要确定配制的量）：10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/lNaCl，15g/l琼脂粉，加水至1000ml，高压灭菌；铺平板，