-核苷酸代谢(0002)课件

第十三章核酸的酶促降解和核苷酸代谢本章讨论核酸酶的类别和特点，对核苷酸的生物合成和分解代谢作一般介绍。第一节核酸的酶促降解返回第三节核苷酸的合成代谢第二节核苷酸的分解代谢第一节核酸的酶促降解

核苷酸酶核苷磷酸解酶

核酸核苷酸核苷碱基+核糖-1-P磷酸核酸酶核苷水解酶碱基+核糖脱氧核糖核酸酶(DNase)核糖核酸酶(RNase)非特异性核酸酶核酸酶

1、核酸酶的分类（1）根据对底物的专一性分为（2）根据切割位点分为核酸内切酶核酸外切酶2、核酸酶的特异性3、限制性内切酶外切核酸酶对核酸的水解位点5´

p

p

p

pOHB

p

p

p

p3´BBBBBBB牛脾磷酸二酯酶（5´端外切5得3）蛇毒磷酸二酯酶（3´端外切3得5）内切核酸酶对RNA的水解位点示意图5´

p

p

p

pOHPyPuPyPy1´

p

p

pGACU

p

p

pGA3´RNAaseIRNAaseIRNAaseT1RNAaseT1Pu：嘌呤Py：嘧啶

限制性内切酶

类型

命名和意义限制片段的长度限制图

原核生物中存在着一类能识别外源DNA双螺旋中4-8个碱基对所组成的特异的具有二重旋转对称性的回文序列，并在此序列的某位点水解DNA双螺旋链，产生粘性末端或平末端，这类酶称为限制性内切酶（ristrictionendonuclease）。限制性内切酶的命名EcoRI序号属名种名株名例：EcoRI，这是从大肠杆菌（Ecoli）R菌珠中分离出的一种限制性内切酶Hind例：流感Haemophilusinfluengaed（属名）（种名）（株系）I—特异性甲基化酶II—GTPyPuACIII—AAGCTT限制性内切酶的意义

限制性内切酶是分析染色体结构、制作DNA限制图谱、进行DNA序列测定和基因分离、基因体外重组等研究中不可缺少的工具，是一把天赐的神刀，用来解剖纤细的DNA分子。限制片段的长度

根据估算，识别六核苷酸顺序的的限制酶大约在4096（46）个硷基对长的DNA分子中有一个切点，而通常大多数肽链的不超过1000氨基酸残基。因此，由识别六核苷酸顺序的的限制酶产生的DNA片段接近一个原核生物基因的大小，这个性质使得这些限制酶可以用于建造和克隆有用的重组DNA分子。为了获取更大的DNA片段，可以采用限制酶部分降解的方法，也可以选用识别8～10个核苷酸顺序的限制酶。限制图的定义和构建

限制图（亦称物理图谱）是DNA的限制性内切酶酶解片断沿DNA分子的物理位置的排列顺序以及各片断的相对长度和绝对长度。由于限制性内切酶能在独特顺序切割双链DNA产生大的DNA片段，它们提供了一种以碱基对为单位距离给DNA分子作图的方法，在确定DNA分子一级结构的过程中，限制图的构建是一项必不可少的工作。

限制图制作方法示例：末端标记单酶切法SV-40基因组限制性酶谱SV-40病毒基因组限制性物理图谱末端标记法绘制物理图谱

将待测DNA分子的一端用放射性同位素标记，部分酶解；电泳分离，只有带同位素的片段出现在放射自显影图上；.分析：放射自显影图上谱线的数目相当于完全酶解片段的数目；相邻谱线碱基对数目之差就是两个相邻点之间这段DNA片段的大小。

例：某组蛋白基因片段共5900bp，末端标记后用HpaII部分酶解得到五个片段，分子量分别为：5900bp；4210bp；3260bp；2950bp；1020bp。画出该DNA分子的物理图谱。193010201020bp2950bp3260bp5900bp4210bp3101690950

+-

Mark限制性内切酶解法

部分酶解法将待测DNA用限制性内切酶完全水解，电泳后得完全酶解图谱.再将待测DNA进行部分酶解(限制酶量、降低温度、缩短反应时间),电泳后获得部分酶解图谱.对完全酶解和部分酶解片段长度进行比较分析，根据片段重叠原理组建物理图谱.

例：有一174经HindII酶解所得片段，分子大小为1030bp，其用AluI完全水解得四个片段：A750bp，B150bp，C80bp，D50bp；用AluI部分水解得三个片段：800bp，230bp，130bp。请推断A、B、C、D的排列顺序。CABD1508050750230130800+AluI酶解图谱BACDMark-完全部分第二节核苷酸的降解二、嘧啶的降解一、嘌呤的降解

核苷酸酶

核苷磷酸化酶核苷酸核苷碱基+（脱氧）戊糖-1-P磷酸嘌呤的分解及“痛风症”产生和治疗尿囊酸尿素CO2+NH3腺嘌呤脱氨酶黄嘌呤氧化酶尿酸氧化酶黄嘌呤氧化酶鸟嘌呤脱氨酶腺嘌呤次黄嘌呤黄嘌呤鸟嘌呤尿囊素尿酸NCHHHONCH次黄嘌呤类似物别嘌呤醇黄嘌呤类似物别黄嘌呤嘧啶的分解胞嘧啶尿嘧啶胸腺嘧啶二氢尿嘧啶二氢胸腺嘧啶-脲基丙酸-脲基异丁酸-氨基异丁酸-丙氨酸第三节核苷酸的合成代谢一、核糖核苷酸的生物合成二、脱氧核糖核苷酸的生物合成三、各种核苷酸的相互转变核糖核苷酸的生物合成1、嘌呤核苷酸的生物合成(1)从头合成途径(2)补救合成途径(自学)2、嘧啶核苷酸的生物合成(1)从头合成途径(2)补救合成途径(自学)嘌呤环上各原子的来源来自谷氨酰胺的酰胺氮来自“甲酸盐”来自天冬氨酸来自甘氨酸来自CO2来自“甲酸盐”IMP的生物合成5-磷酸核糖焦磷酸5-磷酸核糖胺甘氨酸甘氨酰胺核苷酸甲酰甘氨酰胺核苷酸甲酰甘氨咪核苷酸5-氨基咪唑核苷酸5-氨基咪唑-4-羧核苷酸5-氨基咪唑-4-琥珀基-甲酰胺核苷酸5-氨基咪唑-4-氨甲酰核苷酸5-甲酰氨基咪唑-4-氨甲酰核苷酸次黄嘌呤核苷酸（IMP）甲酰THFAIMP转变为GMP和AMP嘌呤核苷酸合成补救途径（自学）

磷酸核糖转移酶嘌呤+PRPPA(G)MP+PPi嘌呤+1-P-核糖嘌呤核苷

A(G)MPATP

ADP嘧啶核苷酸从头合成途径

c、UMP转变为CTPCTPCTP合成酶

ATPGlnH2OUMPUDPUTP

a、嘧啶环上原子的来源b、UMP的从头合成嘧啶环上各原子的来源

天冬氨酸CO2NH3NNCCCC654321H2N-CO-P氨甲酰磷酸尿嘧啶核苷酸合成途径天冬氨酸氨甲酰天冬氨酸二氢乳清酸乳清酸乳清苷酸尿嘧啶核苷酸氨甲酰磷酸嘧啶核苷酸补救合成途径（自学）尿嘧啶+PRPP尿嘧啶+1-P-核糖尿嘧啶核苷+ATPUMP+PPi尿嘧啶核苷+PiUMP+ADP脱氧核苷酸的合成

2、脱氧胸腺嘧啶核苷酸的合成1、脱氧核苷酸的合成硫氧还蛋白参与的核糖核苷酸的还原反应核糖核苷酸还原酶NADP+NADPH+H+硫氧还蛋白还原酶FADATP、Mg2+硫氧还蛋白（还原型）SHSH硫氧还蛋白（氧化型）SSOP-P-CH2NOHOH核糖核苷二磷酸OP-P-CH2NOHH+H2O脱氧核糖核苷二磷酸核糖核苷酸的还原反应FAD核糖核苷酸还原酶ATP、Mg2+硫氧还蛋白SHSH硫氧还蛋白SS硫氧还蛋白还原酶核糖核苷二磷酸+H2O脱氧核糖核苷二磷酸FADH2谷氧还蛋白SS谷氧还蛋白SHSHNADP+NADPH+H+谷氧还蛋白还原酶OP-P-CH2NOHOHOP-P-CH2NOHHGSSG2GSH谷胱甘肽还原酶硫氧还蛋白参与的核糖核苷酸的还原反应核糖核苷酸还原酶示意图底物特异性调节位点酶活性调节位点催化部位B1亚基B2亚基脱氧胸腺嘧啶核苷酸的合成

胸腺嘧啶核苷酸合成酶NADPH+H++SerNADP++Gly

N5、N10—CH2—FH4

FH2二氢叶酸还原酶Ser羟甲基转移酶ONHNOdR-PCH3ONHNOdR-P核苷酸合成前体类似物与抗癌、抗菌药物

根据酶的抑制原理，在癌症的化学治疗或抗菌治疗中，往往选用一些底物类似物（抗代谢物）抑制胸苷酸合成酶或二氢叶酸合成酶的合成，使胸苷酸不能合成，例如：1、氨基蝶呤、氨甲蝶呤、三甲氧苄氨嘧啶为叶酸类似物，是二氢叶酸还原酶抑制剂，可抑制癌细胞和细菌生长；2、5ˊ-氟脲嘧啶、5ˊ

-氟脱氧脲嘧啶在体内可转化为5-氟脱氧脲嘧啶核苷酸为脱氧胸腺嘧啶核苷酸类似物，是脱氧胸腺嘧啶核苷酸合成酶的自杀性抑制剂（suicideinhibitor），可作为抗癌药物。

5-氟脱氧脲嘧啶核苷酸作为胸苷酸合成酶自杀性底物的机理FONHNOdR-PS-酶FONHNOdR-PHS-酶F

ONHNOdR-PHCH2-FH4胸苷酸合成酶、5-氟脱氧脲嘧啶核苷酸和亚甲基四氢叶酸三元复合物的形成叶酸和四氢叶酸（FH4）叶酸四氢叶酸HH105N5，N10-CH2-FH4N5-CHO-FH4CH2CHO一碳基团的来源与转变S-腺苷蛋氨酸N5-CH2-FH4N5N10-

CH2-FH4N5