解放军307医院EGFR突变检测经验分享课件

解放军307医院EGFR突变检测经验分享刘毅解放军307医院全军肿瘤中心肿瘤学研究室&肺癌分子诊断中心开展EGFR突变检测面临的问题一、是什么和为什么二、怎么做及注意事项三、临床问题的解决：转化性研究一、是什么和为什么EGFR基因的基本情况EGFR：表皮生长因子受体EGFR的胞内信号传导途径

EGFR与肿瘤的生长及酪氨酸激酶抑制剂（TKI）——/肺癌靶向治疗的里程碑：IPASS研究肺癌靶向治疗的里程碑：IPASS研究——NEnglJMed2009;361:947-57肺癌靶向治疗的里程碑：IPASS研究EGFR突变状态指导TKI类药物的使用EGFR突变状态已成为患者能否在一线使用TKI药物的重要指标二、怎么做及注意事项目前较为常见的RGFR突变检测方法——EGFR突变检测中需要明确的几个基本概念2、基因突变是指DNA发生碱基序列的改变：须选择有针对性的检测手段，针对非DNA的检测手段如：RT-PCR（检测RNA表达），免疫组化（检测蛋白表达）以及针对非碱基序列的检测手段如：FISH（检测DNA的扩增、缺失、断裂、融合）等，均不适用。体细胞突变发生在非种系组织中不具有遗传性不会遗传给子代种系突变发生于精子或卵子中可以遗传子代子代所有细胞均带突变1、EGFR突变为体细胞突变：发生于肿瘤细胞中，正常细胞（癌旁或白细胞等）不含突变。要尽可能取到足量的肿瘤细胞进行检测，这是保证检测结果可靠的根本前提。肿瘤细胞内及与正常组织间的异质性片段化的DNA不容易进行扩增EGFR突变检测中需要明确的几个基本概念3、样品特性：异质性，突变细胞或DNA的含量一般较少，DNA经常会严重片段化4、关键是保证突变DNA有效扩增至可检测的范围：扩增效率及检测方法的敏感性1、TapMan探针法：边扩增边检测优势只检测突变的序列敏感性高且污染几率小不足探针费用较高只能针对已知突变正常DNA的扩增无限制NatureReviewsDrugDiscovery2004：3,749-761突变DNA有荧光信号野生型DNA无荧光信号特定的探针：只结合突变序列2、高分辨率溶解曲线（HRM）：扩增后再检测优势已知和未知突变序列敏感性高且污染几率小不足正常DNA的扩增无限制对仪器设备的要求较高阳性结果还需进一步确认3、变性高效液相色谱分析（dHPLC）：扩增后再检测优势敏感性高已知和未知突变序列不足仪器普及率低正常DNA的扩增无限制开盖检测增加污染几率阳性结果还需进一步确认检测环境需独立且通风良好4、直接测序法：扩增后再检测优势直观且相对成本低已知和未知突变序列不足工作量大且敏感性低开盖会增加污染几率正常DNA的扩增无限制Sanger测序法原理5、焦磷酸测序：扩增后再检测优势适合已知序列已知和未知突变均可测敏感性高、直观、能够定量不足需要专用仪器正常DNA的扩增无限制开盖会导致污染几率增加6、突变富集PCR：扩增后再检测（抑制正常DNA扩增）优势敏感性高（此消彼长）不足操作繁琐只针对已知突变开盖导致污染几率增加不好找合适的限制性内切酶——ClinCancerRes2006;12(1):43-487、扩增阻滞突变系统（蝎形探针）：边扩增边检测优势敏感性高且污染几率小只扩增并检测突变的序列不足只针对已知突变试剂盒费用较高72℃延伸94℃解链60℃自身杂交发光ARMS引物各种突变检测方法的综合比较——1、操作流程2、污染几率3、敏感性4、可实施性我们最初采用的方法：直接测序法选择的理由结果直观易懂大量文献支持、金标准实验室条件能够满足要求注意事项：DNA抽提部分新鲜组织体液（胸水或血浆）石蜡包埋组织提取过程约1小时提取过程约1小时提取过程约3小时1、DNA提取之前的病理质量控制非常重要，它决定了最终检测结果的可靠性2、尽可能使用认可程度高的试剂，以保证DNA的提取效率（TaKaRaDEXPAT®）3、严格按照说明书要求保存试剂（温度、湿度等），以免试剂失效4、可按自身需求对操作流程做适当修改，但要形成SOP操作规范（示例1、2）5、DNA提取区域与DNA扩增后的分析区域要完全分隔，以避免气溶胶污染注意事项：PCR扩增部分⑴1、DNA质量控制非常重要，可保证后续实验的顺利进行（模板过量、PCR抑制剂）2、设置好阴性对照（避免污染）和阳性对照（验证实验体系，必要时可取消）3、选用保真性较高的Taq酶，避免由实验体系带来的假阳性4、做好详细的实验记录，为以后的各种分析提供依据（示例）Marker百倍稀释原液空白Marker空白1921Marker空白1921注意事项：PCR扩增部分⑵原来的19号外显子巢式PCR引物原来的21号外显子巢式PCR引物——NEnglJMed2004;350:2129-39改进后的19号外显子巢式PCR引物改进后的21号外显子巢式PCR引物5、巢式PCR并非必须，如果DNA的质量足够好，可以选择一次PCR6、不必迷信权威文献中的实验条件，实践是检验真理的唯一标准注意事项：结果分析部分⑴早期的报告现在的报告报告力求简洁明了，不仅有检测结论还要有可靠的事实依据注意事项：结果分析部分⑵检测结果随时归档，以备日后查询、统计三、临床问题的解决：转化性研究转化医学转化医学：以患者为中心，建立临床治疗和基础研究间的双向通道，从临床工作中发现和提出问题，寻找或建立相应的解决方案，然后将其应用于临床，解决临床的实际问题测序法敏感性不足将导致假阴性结果FHirsch,etal.JCO2006CZhu,etal.JCO2008TMok,etal.DiscoveryMed2009ISELBiomarker1测序法阴性样本～200份ARMS法重新检测17(+)测序法复测7(+)BR21后续分析2测序法阴性样本n=148ARMS法重新检测11(+)ARMS法是灵敏度更高的方法，测序法的假阴性率约为8%3阿斯利康第四期EGFR突变检测培训班ADx-ARMS：边扩增边检测且保证突变序列的有效扩增ARMS引物第一轮扩增64℃退火保证特异性第二轮扩增60℃退火保证扩增效率扩增特异性由一轮引物保证突变荧光信号：FAM内控荧光信号：HEX或VIC外控荧光信号：FAM阳性对照：内含阳性质粒阴性对照：蒸馏水内外控均检测EGFR基因2号外显子体系中含特殊石蜡避免气溶胶污染ADx-ARMS试剂盒的判读流程是否污染实验体系DNA质量DNA含量结果判读参数设置ADx-AMRS和DxsARMS试剂盒的比较——阿斯利康中国创新研究中心与张绪超/吴一龙教授等合作共同完成测序法和ARMS法的比较我院已采用ARMS进行检测，提供测序法和ARMS两种方法供临床选择转化研究的理想模式：临床、实验室及企业间密切协作肺癌个体化诊断与治疗学术交流（2010年12月28日307医院)ARMS法检测EGFR突变已在我院临床正式开展，其