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文档简介

第九章DNA序列分析DNA双螺旋结构解明之后，研究基因组中每一个基因的作用就成为了生物科学工作者的主要课题。为此，首先必须设法知道目的基因的核苷酸排列顺序，即基因测序。DNA测序方法：

Maxam-Gilbert化学降解法双脱氧链终止法（Sanger酶学法）

第一节Maxam-Gilbert化学降解法1977年，A.M.Maxam和W.Gilbert首先建立了DNA片段序列的测定方法，由于该方法是用特定化学试剂修饰不同碱基，并在相应碱基处切断DNA片段而进行系列分析的，故称之为Maxam-Gilbert化学降解法。二、化学降解测序法的基本步骤对待测DNA片段的5’端磷酸基团作放射性标记；用化学修饰剂修饰特定碱基；凝胶电泳分离和放射自显影及读序。第二节Sanger双脱氧链终止法一、基本原理双脱氧核苷酸（ddNTP）分子的脱氧核糖的3’位置的羟基缺失，当它与正常核苷酸混合在同一个扩增反应体系中时，在DNA聚合酶的作用下，虽然它也能参与DNA合成，但由于其3’位置的羟基缺失，使其下面的核苷酸的5’磷酸基无法与之结合。也就是说，一旦双脱氧核苷酸整和到正在合成的DNA链中，该股DNA的合成就到此终止。以待测单链或双链DNA为模板，使用能与DNA模板结合的一段寡核苷酸为引物，在DNA聚合酶的催化作用下合成新的DNA链。正常情况下的DNA聚合酶催化反应在其反应体系中包含4种脱氧核苷酸，合成与模板DNA互补的新链。当向该反应体系中加入一种双脱氧核苷酸后，在DNA合成过程中ddNTP将与相应的dNTP竞争掺入到新合成的DNA互补链中。如果dNTP掺入其中，则DNA互补链将继续延伸下去；而如果ddNTP掺入其中，DNA互补链则到此终止。二、序列分析的基本步骤1、模板制备和引物设计

模板：单链或双链DNA，必须保证足够的浓度引物：18-22nt，55-60℃，尽量避免3个以上碱基重复，尽量减少发夹结构形成的可能性。多数情况采用通用引物测序。2、经典测序方法的反应步骤模板变性退火标记

掺入标记：[α-32P]dATP、[α-33P]dATP、[α-35P]dATP

末端标记：[γ-32P]rATP

延伸电泳分析和数据读取三、序列分析的工作模式手动测序缺点：工作强度大，操作人员要求技能娴熟。测序长度有限。

PCR测序全自动测序用4种不同的罗丹明荧光染料分别标记4种双脱氧核苷酸。第三节DNA片段序列测定的策略一次测序反应一般可读出500-800bp，若待测序的DNA片段较大，则需从多处不同的位置引导测序反应。通用引物指导未知序列的测定引物步移随机克隆测序缺失克隆测序3.缺失克隆测序随机克隆测序详细过程：http://smcg.cifn

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