单克隆抗体的纯化

单克隆抗体的纯化一、腹水型单抗的纯化在单抗纯化之前，一般均需对腹水进行预处理，目的是为了进一步除去细胞及其残渣、小颗粒物质、以及脂肪滴等。常用的方法有二氧化硅吸附法和过滤离心法，以前者处理效果为佳，而且操作简便。1、 二氧化硅吸附法新鲜采集的腹水（或冻存的腹水），2000r/min15分钟，除去细胞成分（或冻存过程中形成的固体物质）等；取上层清亮的腹水，等量加入PH7.2巴比妥缓冲盐水（VBS；0.004mol/L巴比妥，0.15mol/LNaCl，0.8mmol/LMg2+，0.3mmol/LCa2+）稀释；然后以每10ml稀释腹水中加150mg二氧化硅粉末，混匀，悬液在室温孵育30分钟，不时摇动；2000g离心20分钟，脂质等通过该法除去，即可得澄清的腹水。2、 过滤离心法用微孔滤膜过滤腹水，以除去较大的凝块及脂肪滴；用10000g15分钟高速离心（4°C）除去细胞残渣及小颗粒物质。3、 混合法即上述两法的组合，先将腹水高速离心，取上清液再用二氧化硅吸附处理。二、单抗的粗提1、硫酸铵沉淀法（1） 饱和硫酸铵溶液的配制500g硫酸铵加入500ml蒸馏水中，加热至完全溶解，室温过夜，析出的结晶任其留在瓶中。临用前取所需的量，用2mol/LNaOH调PH至7.8。（2） 盐析吸取10ml处理好的腹水移入小烧杯中，在搅拌下，滴加饱和硫酸铵溶液5.0ml；继续缓慢搅拌30分钟；10000r/min离心15分钟；弃去上清液，沉淀物用1/3饱和度硫酸铵悬浮，搅拌作用30分钟，同法离心；重复前一步1-2次；沉淀物溶于1.5mlPBS（0.01mol/LPH7.2）或Tris-HCl缓冲液中。（3） 脱盐常用柱层析或透析法。柱层析法是将盐析样品过SephadexG-50层析柱，以PBS或Tris-HCl缓冲液作为平衡液和洗脱液，流速每分钟1ml。第一个蛋白峰即为脱盐的抗体溶液。透析法是将透析袋于2%NaHCO3，1mmol/LEDTA溶液中煮10分钟，用蒸馏水清洗透析袋内外表面，再用蒸馏水煮透析袋10分钟，冷至室温即可使用（并可于0.2mol/LEDTA溶液中，4°C保存备用）。将盐析样品装入透析袋中，对50-100倍体积的PBS或Tris-HCl缓冲液透析（4C）12-24小时，其间更换5次透析液，用萘氏试剂（碘化汞11.5g，碘化钾8g，加蒸馏水50ml，待溶解后，再加20%NaOH50ml）检测，直至透析外液无黄色物形成为止。（4） 蛋白质含量的测定（Pr）（mg/ml）=（1.45XOD280-0.74XOD260）X稀释倍数；或（Pr）=OD280X稀释倍数/1.3（5） 分装冻存备用2、 辛酸-硫酸铵沉淀法该法简单易行，适合于提纯IgG1和IgG2b，但对IgG3和IgA的回收率及纯化效果差。其主要步骤如下：取1份预处理过的腹水加2份0.06mol/LPH5.0醋酸缓冲液，用1mol/LHCl调PH至4.8；按每毫升稀释腹水加11ul辛酸的比例，室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30分钟内加完，4°C静置2小时，取出15000g离心30分钟，弃沉淀；上清经尼龙筛过滤（125um）,加入1/10体积的0.01mol/LPBS，用1mol/LNaOH调PH至7.2；在4°。下加入饱和硫酸铵至45%饱和度，作用30分钟，静置1小时；10000g离心30分钟，弃上清；沉淀溶于适量PBS（含137mmol/LNaCl，2.6mol/LKCl，0.2mmol/LEDTA）中，对50-100倍体积的PBS透析，4C过夜，其间换水3次以上；取出10000g离心30分钟，除去不溶性沉渣，测定蛋白质含量后，分装，冻存备用。3、 优球蛋白沉淀法该法适用于IgG3和IgM型单抗的提取，所获制品的抗体活性几乎保持不变，对IgG3单抗的回收率高于90%,对IgM单抗的回收率为40-90%不等。其操作步骤如下：取一定量的预处理过的腹水，先后加入NaCl和CaCl2,使各自的浓度分别达0.2mol/L和25mmol/L，随之可见纤维蛋白的产生；经滤纸过滤后，滤液对100倍体积的去离子水透析，4°C8-15小时（若是IgG3单抗，也可室温2小时），其间换水1-2次；取出后22000g离心30分钟，弃上清；将沉淀溶于PH8.01mol/LNaCl，0.1mol/LTris-HCl溶液中，重复上述的透析与离心；将沉淀的优球蛋白