十一哺乳动物骨髓细胞染色体畸变实验

十一、哺乳动物骨髓细胞染色体畸变实验InVivoMammalianBoneMarrowCellChromosomeAberrationTest1范围本标准规定了哺乳动物骨髓细胞染色体畸变实验的大体原那么、要求和方式。本标准适用于检测化妆品原料及其产品的遗传毒性。2标准性引用文件OECDGuidelinesforTestingofChemicals(No.475,April1997)3实验目的本实验是一项致突变性实验，检测整体动物骨髓细胞染色体畸变，以评判受试物致突变的可能性。4概念染色体型畸变(Chromosome-typeaberration):染色体结构损伤，表现为在两个染色单体的相同位点均显现断裂或断裂重组的改变。染色单体型畸变(Chromatid-typeaberration)：染色体结构损伤，表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组的损伤。染色体数量改变(Numerical-fypeaberration):哺乳动物细胞正常染色体数量的改变。5实验大体原那么使哺乳动物(如大鼠或小鼠)经口或其它适宜途径染毒，动物处死前用细胞割裂中期阻断剂处置，处身后制备骨髓细胞染色体标本，分析染色体畸变。6实验方式实验动物和饲养环境：选用健康成年大鼠或小鼠，每组每种性别至少5只。实验动物及实验动物房应符合国家相应规定。受试物受试物配制：固体受试物应溶解或悬浮于适合的溶剂中，并稀释至必然浓度。液体受试物

可直接利用或予以稀释。受试物应在利用前新鲜配制，不然就必需证明贮存不阻碍其稳固性。溶剂的选择：溶剂在所选用浓度下，不引发毒性效应，不与受试物发生化学反映。首选为水溶性溶剂。剂量设置：应进行预实验以选择最高剂量。当有毒性时，能够引发死亡或抑制骨髓细胞有丝割裂指数(50%以上)为指标确信最高剂量。在第一次搜集样品时，需设置3个可供分析的剂量，在第二次搜集样品时，那么仅需设置最高剂量组。若是一次剂量为2000mg/kg体重时仍未引发毒性效应，那么只设2000mg/kg体重剂量组。对照：在每项实验中，对每种性别均应设阴性对照组和阳性对照组。除不利用受试物外，其它处置与受试物组一致。阴性对照：除设溶剂对照(即仅含溶剂)夕卜，若是没有文献资料或历史性资料证明所用溶剂不具有有害作用或致突变作用，还应设空白对照组。阳性对照：阳性对照物应能引发染色体结构畸变率明显高于背景资料。染毒途径能够不同于受试物。所选用的阳性对照物最好与受试物类别有关。能够利用下述物质：三亚乙基密胺(triethylenemelamine)、甲磺酸乙酯(ethylmethanesulphonate)、乙基亚硝基月尿(ethylnitrosonrea)、丝裂霉素C(mytomycinC)和环磷酰胺(cyclophosphamide)。染毒方式：可采纳经口或其它适宜的染毒方式。一样情形下，染毒1次，但分两次搜集样品，即每组动物分两个亚组，亚组1于染毒后12h~18h处死并搜集第一次样品；亚组2于亚组1处身后24h搜集第二次样品。若是采纳多次染毒，于末次染毒后12h~18h搜集样品。于处死动物搜集样品前腹腔注射细胞割裂中期阻断剂(如用秋水仙素，于处死前4h，按4mg/kg体重给药)。实验步骤用颈椎脱臼法处死动物，掏出股骨，剔除肌肉等组织。剪去股骨两头，用注射器吸取5mL生理盐水，从股骨一端注入，用10mL离心管，从股骨另一端接取流出的骨髓细胞悬液。将细胞悬液以1000r/min的速度离心5min~7min，去除上清液。加入匚KCl溶液7ml，用滴管将细胞轻轻地混匀，放入37°C水浴中低渗处置7min，加A2mL固定液(冰醋酸：甲醇=1:3)，混匀，以1000r/min速度离心5min~7min，弃去上清液。加入7mL固定液，混匀，固定7min，以1000r/min的速度离心7min，弃去上清液。用同法再固定1~2次，弃去上清液。加入数滴新鲜固定液，混匀。用混悬液滴片，自然干燥。用姬姆萨染液染色。读片和结果处置确信有丝割裂指数：包括所有处置组、阳性和阴性对照组(每只动物计数1000个细胞)。计数畸变细胞：对每只动物选择100个分散良好的中期割裂相，在显微镜油镜下进行读片。在读片时应记录每一观看细胞的染色体数量，关于畸变细胞还应记录显微镜视野的坐标位置及畸变类型。所得各组的染色体畸变率用X2查验进行统计学处置，以评判实验组和对照组之间是不是有显著不同。结果评判当受试物引发染色体畸变数具有统计学意义，并有与剂量相关的增加或在一个剂量组显现染色体畸变细胞数明显增高，那么判定具有致突变性。当结果不能得出，应改变实验条件进一步进行测试。在评判时应综合考虑生物学意义和统计学意义。7实验报告报告应包括以下项受试物名称、理化性质、所用溶剂及配制；动物种属和品系、体重、数量、性别、来源(注明合格证号和动物级别)；实验动物饲养环境，包括饲料来源、室温、相对湿度、实验动物房合格证号；剂量和组别：选择剂量的原那么、剂量和组别、阴性和阳性对照物及剂量；实验条件和方式：染毒途径和染毒方案、细胞毒性测定方式、所用的细胞割裂中期阻断剂及其剂量和采样时