生化实验操作

实验一人类细胞中巴氏小体的观察实验目的1•了解X染色体失活假设及剂量补偿效应的机制。学习人类性染色质的检查方法。实验原理1949年Barr等在雌猫的神经元细胞中发现一种浓缩小体，而雄猫无。而且在其他物种的雌性个体组织细胞核中都有。因此X染色质又称Barr小体。异固缩的X染色体随机失活。♦:♦胚胎发育第16天，出现失活；卵子与精子受精后，其中失活的X染色质变为常染色质恢复活性。♦:♦相关概念：心剂量补偿效应：指在xy性别决定的生物中，使性连锁基因在两种性别中有相等或近乎相等的有效剂量的遗传效应。主要类型：X染色体的转录速率不同（果蝇）。2•雌性体细胞中有一条x染色体是失活的。（人、哺乳类）Lyon假说：1961年由Lyon提出，又称单个活性X染色体假说。正常雌性哺乳动物的体细胞中，两条X染色体中只有一条有活性（activationX,Xa），另一条失活（inactivationX,Xi）；失活是随机的；失活发生在胚胎发育的早期；4•杂合体雌性在伴性基因的作用上是嵌合体（mosaic）。实验步骤取口腔上皮细胞涂于载玻片上，自然干燥甲醇，冰醋酸（3：1）固定15分钟，干燥 依次放入95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇，蒸馏水中，每次2-3分钟 5NHcl分化5秒钟蒸馏水漂洗3次，每次2-3分钟硫堇染色10分钟冲洗干净，电吹风吹干镜检（油镜）实验结果的观察X染色质的识别方法：一般位于核膜内侧缘，形状多样，多为半圆形，三角形。♦可计数细胞的标准：a：核较大，轮廓清除完整，无缺损、皱褶，染色清晰。b：核质呈细网状或均匀的细颗粒状，无深染大颗粒及细菌污染♦★X—染色质的形态：结构致密的浓染小体，轮廓清楚；大小约1u左右，常附着于核膜边缘或靠近内侧；其形状有微凸形、三角形、卵形、短棒形及双球形；实验二植物染色体组型分析实验目的：

学习并掌握植物染色体组型的方法；了解染色体组型分析的意义。实验原理：各种生物染色体的数目、形态和结构都是恒定的。染色体组型，也称为核型，指一个个体或物种的特有的染色体构成，包括染色体数目以及每一条染色体所特有的形态特征（染色体的长度、着丝粒的位置、臂比值、随体的有无、次级缢痕的数目及位置、异染色质的分布等）。核型是物种最稳定的性状和标志，通常在体细胞有丝分裂中期时进行核型的分析鉴定，也可利用减数分裂期的染色体进行分析鉴定。染色体组型分析就是通过对染色体标本和其照片进行测量、对比分析、配对、分组、排列，对各染色体的形态进行分析。在细胞遗传学、现代分类学、生物进化和遗传育种学等研究中，是重要的研究手段。发展历史1920年提出三项技术促进：低渗处理秋水仙素应用植物凝激素应用（PHA）染色体分带技术：Q带、G带、C带、R带、T带、N带等FISH技术（荧光染色体原位杂交技术）染色体的特征数目长度（绝对长度、相对长度）数目长度（绝对长度、相对长度）2n=？）着丝粒位置 （M\SM\ST\T）随体与次溢痕的数目、大小和位置带型分析应用意义染色体组型分析iaia染色体水平上的表型可确定物种的特征，确定种属亲缘关系分析生物物种的变异和进化过程识别单条染色体、基因定位临床应用（染色体疾病、产前诊断）着丝粒位置 （M\SM\ST\T）随体与次溢痕的数目、大小和位置带型分析实验说明：染色体数目：一般以体细胞染色体数目为准。染色体绝对长度：绝对长度（pm）=放大的染色体长度F放大倍数染色体组总长度=该细胞单倍体全部染色体长度（包括性染色体）之和相对长度（％）=每条染色体长度十单倍染色体组总长度X100（精确到0.01）臂比值=长臂长度十短臂长度（精确到0.01）随体：带随体的染色体用SAT或者“*”标记实验材料：洋葱、大麦、玉米、黑麦、蚕豆等。本实验选用蚕豆（2n=12）。实验用品：用具：蚕豆有丝分裂中期照片（6x8cm）、剪刀、镊子、铅笔、直尺、计算器、胶水、白纸等实验步骤1测量：测量每条染色体的总长度及长臂长度和短臂长度。对于有随体的染色体，随体的长度可以计入也可以不计入染色体长度之内，需要注明。每条染色体的着丝粒应平分为二，计入两条臂长度之内。（单位：mm）。2计算：根据测量结果，计算出：相对长度=某染色体的长度/染色体组内全部染色体总长度臂比值=长臂长度（q）/短臂长度（p）根据计算结果确定染色体类型。配对：根据测量、计算的数据进行同源染色体的配对。排列和剪贴：将配对的染色体按由大到小的顺序进行排列并编号。等长的染色体短臂长的排在前面，特殊的染色体（如性染色体）排在最后。排列、剪贴时，让各对染色体的着丝粒排在一条直线上，短臂在上，长臂在下。完成表格。见实验指导表16-2雄果蝇在前肢先端第二节具有性梳野生型：体色灰，翅膀呈圆卵型，静止时平放交叉重叠，长度约为腹部长度的两倍果蝇为双翅目昆虫，具完全变态。果蝇是遗传学教学实验及研究的非常好的材料，其优点有：容易饲养，生活周期短；繁殖能力较强，利于遗传学分析；突变类型多，且便于观察；染色体数少；具唾腺染色体等。实验四植物细胞微核技术检测一、 实验目的••1、了解细胞微核形成的机理及其形态特点；2、学习植物根尖细胞的微核检测技术。二、 实验原理•微核（micronucleus）简称MCN，是真核类生物细胞中的一种异常结构，往往是细胞经辐射或化学药物的作用而产生的。在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3以下。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具合成DNA的能力。•一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片产生的，在有丝分裂后期不能向两极移动，所以游离于细胞质中，在间期细胞核形成时，即可在它附近看到一到几个很小的圆形结构，直径大约是细胞直径的1/20~1/5，这就是微核。微核率的大小是和用药的剂量或辐射累积效应呈正相关，因此，微核是常用的遗传毒理学指标之一，指示染色体或纺锤体的损伤。微核测试已用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各方面。三、 实验材料：大蒜、大豆、蚕豆等。四实验仪器设备显微镜、恒温培养箱、恒温水浴锅、镊子、载玻片及盖玻片。五、实验步骤：1、浸种催芽：将实验用的蚕豆按所需要量放入盛有自来水的烧杯中，浸泡24h,此间至少换水两次。种子吸涨后，经36〜48h，大部分初生根长至1〜2cm。2、 处理根尖：阳性检测采用1.0~2.5MCrO3，0.5~1.5MNaN3，150〜250mMEMS,对照用自来水处理，处理时间24h。3、 恢复培养：处理后的根尖用自来水浸洗3次，每次2-3min，洗净后在水中恢复培养24h。4、 固定：用甲醛：冰醋酸（3：1）固定液固定24h后弃去固定液，或换入70％酒精中保存。5、 酸解：弃去固定液，用清水漂洗2-3次，吸净水，加入6M盐酸，于室温解离10min，弃去盐酸，漂洗根尖2-3次，彻底洗净盐酸。6、 染色：截下1-2mm长的根尖，滴加石炭酸品红染液，染色10min，加盖玻片，压片观察。固定是借助于物理方法或化学药剂的作用，迅速透入组织和细胞将之杀死，并且使其结构和内含物如：蛋白质，脂肪，糖类以及核物质与细胞器等，在形态结构上尽可能保持生活时的完整和真实状态，同时更易于染色，可以较清楚的显现细胞在生活时不易看清的结构。•酸解的作用是去除未固定的蛋白质,同时使胞间层的果胶类物质解体，细胞分散而易于观察。实验结果1、 首先在低倍镜中找到分生组织区细胞分散均匀，分裂相较多的部位，再转高倍镜观察，找到微核。2、 微核识别标准：（1）在主核大小的1/3以下，并与主核分离的小核。（2）小核着色与主核相当或稍浅。（3）小核形态为圆形、椭圆形或不规则型。3、每一处理观察3个根尖，每个根尖计数100个细胞，统计其中含微核的细胞数，计算平均数，即为该处理的MCN%。，即微核千分率。污染指标（PI）=样品实测MCN%平均值/对照组（标准水）MCN%平均值植物减数分裂的观察、实验目的掌握花粉母细胞染色体制片技术；了解减数分裂各时期染色体的变化特征二、实验原理减数分裂是性母细胞在形成配子时发生的一种特殊的细胞分裂方式。两次分裂均包括前期、中期、后期和末期。前期I细分为细线期、偶线期、粗线期、双线期和终变期等5个时期。三、实验材料、器具及试剂玉米幼穗镊子、载玻片、盖玻片、解剖针、吸水纸卡诺氏固定液（95%乙醇：冰乙酸=3：1）丙酸洋红四、实验步骤1、取材：选取适宜的小花或小穗是实验的关键。玉米：在喇叭口期前一周左右水稻：叶枕距为-2cm-0cm2、固定：12-24h。经95%、80%乙醇中各停留 30min后，于70%的乙醇中保存备用。3、 制片：1%醋酸洋红染色2min-3min，盖片。4、 烤片：细胞质颜色减退，使染色体得到充分鲜明的着色。5、 置换：45%的冰醋酸，使细胞质背景颜色变浅。6、 压片：用拇指均匀用力垂直压下7、 镜检五、注意事项显微镜托住底盘拿放转开物镜拿放玻片显微镜不用时，要把电源电压调至最低使用完显微镜要登记前期I(prophaseI)1、 细线期(leptonema)。核内出现细长如线的染色体，由于染色体在间期已经复制，这是每个染色体都是由共同的一个着丝点联系的两条染色单体所组成。2、 偶线期(zygonema)。各同源染色体分别配对，出现联会现象。2n个染色体经过联会而成为n对染色体。各对染色体的对应部位相互紧密并列，逐渐沿着纵向连结在一起，这样联会的一对同源染色体，称为二价体(bivalent)。一般在这时出现多少个二价体，即表示有多少对同源染色体。根据电子显微镜的观察，同源染色体经过配对在偶线期已经开始形成联会复合体(synaptonemalcomplex)。3、 粗线期(pachynema)。二价体逐渐缩短加粗，因为二价体实际上已经包含了4条染色单体，故又称为四合体或四联体(tetrad)。在二价体中一个染色体的两条染色单体，互称为姊妹染色单体；而不同染色体的染色单体，则互称为非姊妹染色单体。一般认为同源染色体的联会复合体的形成是在粗线期完成的。此时非姊妹染色单体间出现交换(crossingover)，因而将造成遗传物质的重组。4、 双线期(diplonema)。四合体继续缩短变粗，各个联会了的二价体虽因非姊妹染色体相互排斥而松懈，但仍被一二个至几个交叉(chiasmata)联结在一起。这种交叉现象就是非姊妹染色体之间某些片段在粗线期发生交换的结果。在电子显微镜下观察，这时的联会复合体的横丝物质脱落了，只是在交叉处还未脱落。5、 终变期(diakinesis)。染色体变得更为浓缩和粗短，这是前期I终止的标志。这时可见到交叉向二价体的两端移动，并且逐渐接近于末端，这一过程叫做交叉的端化(terminalization)，这时，每个二价体分散在整个核内，可以一一区分开来，所以是鉴定染色体数冃的最好时期。中期I(metaphaseI)核仁和核膜消失，细胞质里出现纺锤体。纺锤丝和各染色体的着丝点连接。从纺锤体的侧面观察，各二价体不是像有丝分裂中期那样各同源染色体的着丝点整齐的排列在赤道板上，而是分散在赤道板的两侧，即二价体中两个同源染色体的着丝点是面向相反的两极的，并且每个同源染色体的着丝点朝向哪一极是随机的。从纺锤体的极面观察，各二价体分散排列在赤道板的近旁。这时也是鉴定染色体数冃的最好时期。后期I(anaphaseI)由于受附着在各个同源染色体着丝点的纺锤丝的牵引，各个二价体各自分开，这样二价体的二个同源染色体分别向两极拉开，每级只分到每对同源染色体中的1个，实现了2n数目的减半。这时每个染色体还是包含两条染色单体，因为它们的着丝点并没有分裂。末期I(telophaseI)染色体移到两级后，松散变细，逐渐形成两个子核；同时细胞质分为两部分，于是形成两个子细胞，称为二分体(dyad)。在末期I后大都有一个短暂停顿时期，称为中间期(interkinesis)，相当于有丝分裂的间期；但有两点显著不同于有丝分裂的间期：一是时间很短，二是DNA不复制，所以中间期的前后DNA含量没有变化。在很多动物中几乎没有中间期，二是在末期I后紧接着就进入下一次分裂。前期11(prophaseII)每个染色体有两条染色单体，着丝点仍连接在一起，但染色单体彼此散得很开。中期II(metaphaseI)每个染色体的着丝点整齐的排列在各个分裂细胞的赤道板上。着丝点开始分裂。后期11(anaphaseII)着丝点分裂为二，各个染色单体有纺锤丝分别拉向两极末期11(telophaseII)拉到两极的染色体形成新的子核，同时细胞质又分为两部分。这样经过两次分裂，形成四个子细胞，这称为四分体(tetrad)或四分抱子(tetraspore)。各细胞的核里只有最初细胞的半数染色体，即从2n减数为n。细胞生物学实验实验二细胞主要化学成分的检测实验目的1、掌握生物大分子在细胞内的存在部位；2、学习细胞内主要化学成分的检测方法；3、掌握血涂片的制片方法。实验原理■根据不同生物大分子的结构特征，采用不同的染色剂对实验材料进行染色，不同的生物大分子被染成不同的颜色，以利于显示和观察。■细胞的化学成分■细胞的组成：无机物和有机物，有机物主要是四类生物大分子：■多糖■脂肪（脂质、膜）■蛋白质■核酸实验用品■1、器材：显微镜，酒精灯（或电炉），刀片，小烧杯，剪刀，镊子，吸管，火柴，解剖针，棉签，消毒棉球，玻片，染色缸■2、试剂：革兰氏碘液，甲基绿—派洛宁，食用醋，过氧化氢，乙醇，丙酮糖类的检测与观察■1、糖类的观察：糖类是生物有机体生命活动能量的主要来源。■（1）淀粉：淀粉几乎存在于所有绿色植物的多数组织中，有直链和支链淀粉之分，直链淀粉不溶于冷水，略溶于热水，遇碘液显蓝色反应，加热时蓝色消失，冷却时又重新出现。蓝色的产生是由于直链淀粉遇碘液形成不稳定的化合物——碘化淀粉之故。支链淀粉不溶于水，但吸水后膨胀或成糊状，遇碘呈紫红色。■糖类的检测与观察马铃薯徒手切片，取一薄片放在载玻片上，加一滴革兰氏碘液，可见标本立即染成蓝色。盖上盖玻片，置于低倍镜下观察，可见在多角形的薄壁细胞中，有许多椭圆形蓝色的颗粒，即为淀粉。糖类的检测与观察■（2）糖原：广泛存在于脊椎动物和细菌中，与淀粉在植物中的作用相同，又称为动物淀粉，是动物细胞内贮藏能量的多糖类物质，人体的糖原主要贮存在肝脏和肌肉组织中。糖原的结构类似于支链淀粉，为球形分子，溶于沸水，遇碘呈红色。可用过碘酸雪夫试剂反应，简称PAS反应进行检测。蛋白质的观察■2、蛋白质的观察：在生命活动中，蛋白质是一类极为重要的大分子，几乎各种生命活动无不与蛋白质的存在有关，蛋白质不仅是细胞的主要结构成分，而且更重要的是：生物专有的催化剂iaia酶是蛋白质，因此细胞的代谢活动离不开蛋白质，一个细胞中约有一万种蛋白质，分子的数量达一千亿个。蛋白质的观察糊粉粒（也叫蛋白体，呈圆球状，存在于植物种子子叶和胚乳中，在种子成熟后期形成，萌发前期消失，它具有动物溶酶体性质，含多种蛋白水解酶，为贮藏态蛋白质启动所必需。）是存在某些种子胚乳细胞液泡中的蛋白质，由于水分丧失而成蛋白质结晶。若碘液与糊粉粒中的蛋白质作用，则呈黄色反应。蛋白质的观察先将蓖麻（黄豆、菜豆、豌豆）种子放在40°C下水中浸泡3~4小时，剥去蓖麻（黄豆、菜豆、豌豆）种子外壳，做徒手切片。选一薄片于水中浸泡10分钟，然后取出置于载玻片上，加一滴革兰氏碘液，盖上盖玻片，置于低倍镜下观察，可见细胞中染成黄色的结晶，即糊粉粒。酶的检测与观察■3、酶的观察：■（1）唾液淀粉酶：唾液淀粉酶存在于人或高等动物的唾液中，能将淀粉分解为麦芽糖。淀粉的消化首先由口腔分泌的唾液淀粉酶进行，淀粉遇碘显蓝色反应，而麦芽糖遇碘不显色。此法可证明唾液中淀粉酶的存在。酶的检测与观察将口漱净，用吸管滴一滴食用醋在舌头上，唾液即开始分泌，把消毒棉球含入口中，待棉球湿透后取出，置小烧杯中，用少量水稀释。酶的检测与观察用刀片刮取煮熟的马铃薯少量，分别置于载玻片两端，一端加稀释唾液一滴，另一端加水一滴。15~20分钟后，再分别加碘液一滴，观察两端的颜色反应有何不同？若将唾液煮沸，重复上述实验，结果是否与上面的一致？酶的检测与观察■（2）过氧化氢酶在生物体内，细胞代谢过程会产生对机体有害的过氧化氢。存在于动植物组织中的过氧化氢酶能使过氧化氢分解，生成水放出氧气，对机体起到保护作用。过氧化氢酶系还能把许多胺类氧化为有色化合物。若用联苯胺混合液处理标本，细胞内的过氧化氢酶能把联苯胺氧化为蓝色或棕色产物。核酸的显示与观察■4、核酸的显示的观察：核酸是生物遗传信息的载体分子，所有生物均含有核酸，核酸可以分为核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸（DNA）。根据DNA、RNA聚合程度对碱性染料的亲和力不同，用甲基绿一派洛宁对被观察细胞进行染色，甲基绿分子有两个相对的正电荷，与聚合程度高的DNA分子有较强的亲和力，可使DNA分子染成蓝绿色，而派洛宁分子中仅一个正电荷，可与低聚分子RNA结合使其染成红色。细胞质和核仁被染成红色（RNA的存在部位），细胞核被染成蓝色（DNA的存在部位）。核酸的显示与观察■（1）洋葱表皮细胞DNA、RNA的显示：撕取洋葱表皮一小片，置于载玻片上，滴一滴甲基绿—派络宁染液，染色时间30~40分钟，用吸管吸一滴蒸馏水冲洗，立即用吸水纸吸干（因派洛宁易脱色）。盖上盖玻片，镜检观察结果：细胞质和核仁呈淡红色或红色，表示含RNA,而核质呈蓝色，表示含有DNA。核酸的显示与观察（2）牛蛙血涂片DNA、RNA的显示：先取蛙血进行涂片，室温晾干；用70%的乙醇固定5〜10分钟，室温晾干，再用甲基绿—派洛宁染色时间20分钟，用蒸馏水冲洗，用吸水纸吸去片上多余水分（不要吸得过干），然后在丙酮中沾一下，进行分化。观察结果：细胞核呈绿色，细胞质呈淡红色。■固定的目的：使材料内含物保存起来，且具有一定的硬度，便于染色。■固定的作用：快速杀死细胞，使其结构固定于某一阶段不再发生变化。实验四细胞膜的渗透性实验目的了解细胞膜的渗透性及各种物质进入细胞膜的速度。■实验原理细胞膜是细胞与环境之间进行物质与能量交换的一种选择性通透屏障，它既能保障细胞对基本营养物质的摄取、代谢废物的排出和细胞内离子浓度的调节，又能使细胞维持相对稳定的内环境。物质通过细胞膜的转运主要有三种途径：被动运输、主动运输、和胞吞与胞吐作用。一般认为，在简单扩散的跨膜转运中，涉及跨膜物质溶解在膜脂中，再从膜脂一侧扩散到另一侧，最后进入细胞质水相中。因此，其通透性主要取决于分子大小和分子的极性。实验原理■哺乳动物的成熟红细胞没有细胞核和内膜体系，所以红细胞的质膜是最简单最易操作的生物膜。质膜是由脂双层分子和蛋白质构成的，各种物质跨膜运输的方式是不同的，物质的通透性是由物质本身属性和膜的结构性质（如脂溶性、分子大小、所带电荷等）共同决定的；另外物质穿膜的通透性还要受到细胞生理状态和环境条件（如麻醉剂、热、辐射、pH值、盐不平衡等）的影响。实验原理如果将红细胞放置在各种溶液中，根据红细胞质膜对各种溶质的渗透性不同，有的溶质可渗入，有的溶质不能渗入。即使能渗入，速度也有差异。可通过观察红细胞溶血现象时间的不同来记录渗入速度。血红蛋白从红细胞中逸出的现象称为溶血现象。渗入红细胞的溶质能提高红细胞渗透压，使水进入红细胞，引起溶血及细胞膜破裂。此时光线较容易通过溶液，使溶液呈现透明即为溶血。由于溶质透入速度不同，溶血时间也不同。因此，可通过溶血现象来测量各种物质通透性的差别。影响物质穿膜的因素.1.脂溶性越大的分子越容易穿膜，物质的脂溶性大小是由物质分子的结构属性所决定的，非极性物质比极性物质更容易溶于脂类物质；.2.小分子比大分子容易穿膜，脂溶性与分子大小相比，前者的影响更大一些，小的非极性分子很容易溶于脂双层，穿膜快；.3.不带电荷的分子容易穿膜，同样大小的物质分子，电解质的穿膜速度要比非电解质慢，强电解质要比弱电解质慢；.4.亲水性分子和离子的穿膜要依赖专一性的跨膜蛋白。实验材料.兔血实验用品.1、器材：天平，载玻片，滴管，离心管，烧杯，移液管，试管，试管架，10ml量筒。.2、试剂：0.17mol/L氯化钠，0.17mol/L氯化铵，0.17mol/L醋酸铵，0.12mol/L草酸铵，0.32mol/L葡萄糖，0.32mol/L甘油，0.32mol/L丙酮，0.32mol/L乙醇等。实验步骤.1、兔血细胞悬液.取50ml小烧杯一只，加1份兔血和10份0.17mol/L氯化钠溶液，形成一种不透明的红色液体，此即稀释的兔血。实验步骤.2、低渗溶液.取试管一支，加入10ml蒸馏水，再加入lml稀释的兔血，注意观察溶液颜色的变化，由不透明的红色逐渐澄清，说明红细胞发生破裂造成100％红细胞溶血，使光线比较容易透过溶液。实验步骤.3、兔红细胞的渗透性.（1）.取不同的试管4支，分别在试管上贴上编号1、2、3、4，然后从有对应编号的试剂瓶中用量同量取溶液10ml，再加入lml稀释的兔血，轻轻摇动，注意颜色有无变化?有无溶血现象?为什么?若发生溶血，记下时间（自加入稀释兔血到溶液变成红色透明澄清所需时间）。.（2）.取不同的试管4支，分别在试管上贴上编号5、6、7、8，然后从有对应编号的试剂瓶中用量同量取溶液10ml，再加入lml稀释的兔血，轻轻摇动，注意颜色有无变化?有无溶血现象?为什么?若发生溶血，记下时间（自加入稀释兔血到溶液变成红色透明澄清所需时间）。注意事项：1、 离心机使用时，要将配平后的离心管对称放置在离心机内，禁止未配平就放入离心机和非对称放置离心管。2、 试管中有红细胞和测试溶液时，不应强力摇晃，以免造成人为的红细胞破裂。3、 观察时可将试管贴靠在书上，若发生溶血则文字可清楚地看见，若不发生溶血则看不清。.巨噬细胞吞噬现象的观察实验原理.细胞吞噬作用原来是单细胞动物摄取营养物质的方法，也是原始防御作用。随着动物界的进化，在高等动物中，则发展生成大小两类吞噬细胞（即巨噬细胞和嗜中性细胞），专司吞噬作用，成为非特异免役功能的重要组成部分。实验原理. 巨噬细胞由骨髓干细胞分化生成，然后进入血液到达各组织内，并进一步分化为各种巨噬细胞。当病原微生物或其它异物侵入机体时，能招引巨噬细胞，而巨噬细胞又有趋化性，能响应招引因子的招引，产生活跃的变形运动，主动向病原体和异物移行，在接触到病原体或异物时，即伸出伪足，将之包围并内吞入胞质，

形成吞噬体，继而细胞质中的初级溶酶体与吞噬泡发生融合，形成吞噬性溶酶体，通过其中水解酶等作用下，将病原体杀死，消化分解，最后将不能消化的残渣排出细胞外。实验目的■1、 通过对小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞活动的观察，加深理解细胞吞噬作用的过程及其意义；■2、 掌握小白鼠腹腔注射给药和颈椎脱臼处死方法。■1、 通过对小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞活动的观察，加深理解细胞吞噬作用的过程及其意义；■2、 掌握小白鼠腹腔注射给药和颈椎脱臼处死方法。实验材料小白鼠，1%鸡红细胞悬液（取无污染的鸡血1ml,放入盛有4mlAlsever溶液瓶中，混匀置4°C冰箱保存备用，一周内使用。使用前加入0.85%生理盐水以1500r/min离心10min,洗涤两次，再用生理盐水配成1%浓度悬液。实验用品显微镜，解剖盘，剪刀，镊子，离心机，注射器，吸管，玻片，吸水纸。试剂■（1）0.85%生理盐水■（2）Alsever溶液■葡萄糖■柠檬酸钠■柠檬酸■氯化钠■蒸馏水2.05g0.89g0.05g0.42g100ml调PH值至7.2,过滤灭菌或高压灭菌lOmin，置4°C冰箱保存。0.4g（3）0.4%台盼蓝（trypanblue）染液台盼蓝染粉0.4g0.85%生理盐水100ml4）6%淀粉肉汤含台盼蓝染液）牛肉膏0.3g蛋白胨1.0g氯化钠0.5g蒸馏水100ml加热后加入可溶性淀粉6.0克，促使溶解，再煮沸灭菌，置4C冰箱保存。用时水浴融化，加入适量台盼蓝染液混匀，使呈蓝色。实验步骤■1、在实验前一天，给小白鼠腹腔注射6%的淀粉肉汤（含台盼蓝）1ml。2、 实验时，取一只注射过淀粉肉汤的小白鼠，腹腔注射1%的鸡红细胞悬液1ml,轻按小白鼠腹部，使悬液分■散。3、 20min后，用颈椎脱臼法处死小白鼠（用右手抓住鼠尾，左手拿一把剪刀或镊子按住颈椎，右手用力向后拉即可）。实验步骤4、 将小白鼠置于解剖盘中，把腹部剪开一小口子，把内脏推向一侧，用吸管吸取适量的生理盐水冲洗腹腔，并吸取腹腔液，吸时一吸一松，以免把内脏吸出。■.5、每人取一张干净载玻片，滴一滴腹腔液，盖上盖玻片，置显微镜下观察。6、每人取一张干净载玻片，滴一滴没有注射淀粉肉汤的腹腔液，盖上盖玻片，置显微镜下观察。观察与结果■■ 由于细胞未经染色，因此观察时视野亮度需要适当调低。巨噬细胞体积较大，呈圆形或者不规则形，表面有伪足，胞质中含有数量不等、大小不一的蓝色颗粒，为淀粉颗粒被吞噬后形成的吞噬体。鸡红细胞为椭圆形、淡黄色，细胞核也为椭圆形。在显微镜下可以观察到巨噬细胞吞噬鸡红细胞的过程：有的红细胞位于巨噬细胞的表面，有的被部分吞入，有的被完全吞入，形成吞噬泡。有的吞噬泡体积缩小、呈圆形，表明已与溶酶体发生融合，泡内物质正被消化分解。植物染色体标本的制备与观察实验目的■1、学习植物染色体标本的制各技术，字握染色体的计数；■2、了解染色体的生物学意义。实验用品■1.材料■洋葱根尖、蚕豆根尖、豌豆根尖■2.试剂■1．Carnoy固定液■2．0.1％秋水仙素溶液■卡宝品红染液■配方I■原液A：称取3g碱性品红，溶于lOOml70%酒精中（此液可无限期保存）。■原液B：取10ml原液A,加入90ml15%石炭酸（苯酚）水溶液（两周内使用）。■染色液:55ml原液B加6m1冰醋酸和6ml37%甲醛（此液适用于植物原生质体培养中细胞核和核分裂的染色）。■配方II:■取配方I中的染色液2—10m1，加90一98m145%醋酸和1.8g山梨醇（此液适用于核和染色体的一般形态观察，具有广泛的适用性）。实验方法■1.取材：切取o.5cm长的洋葱根尖部分。■2.预处理：将切下的根尖浸入o.1%秋水仙素液中，室温下处理3—4h。也可把根尖浸入小■烧杯内的自来水中，杯内加冰两小块，在0—4°C冰箱内低温处理24h左右。■3.固定；取出根尖，投入carnoy液中固定2—24h，换入70%酒精，暂时保存。■4•水解；把根尖投入预热的58—60Clm01/L热HCl中，恒温条件下水解14一15min。■5•染色：去HCl，加卡宝品红几滴，染色5—10min（也可在冰箱内染色12—24h）。■6漂洗：吸去卡宝品红，用漂洗液换洗2—3次，每次1—2min。■7.酶解；在载玻片上切取根尖着色深的部分，浸入小酒杯内1—2滴混合酶液中，室温下酶解40min左右或在28C温箱中酶解20min左右。■8.洗涤：吸去酶液，加蒸馏水，用吸管换洗几次，除去残留酶液后加入45%醋酸，使组织软化。■9.压片：用吸管从醋酸中吸取材料，置干净载坡片上，材料周围保留半滴45%醋酸.盖上盖玻片，其上放一片吸水纸。左手指压住吸水纸的左边，右手指从吸水纸的右端向右方轻轻抹去。再用铅笔擦头从盖片上轻轻敲打，使细胞均匀散开。镜检：把压好的片子放显微镜下，先观察细胞分散状况和中期分裂相的多少，再检查分裂中期细胞中的染色体是否完全散开。如若染色体分散不好而难以分辨和计数，可取下片子，平放桌面上，用手指隔着吸水纸在盖玻片上稍施压力，如果操作细心，用力适度，便可很容易得到染色体分散良好的压片标本，供观察，计数和照相用。封存：压好的片子如果来不及观察或照相，必须进行暂时封存。封存时先在盖坡片四周各放麦粒大石蜡一块，然后用烧热的解剖针迅速熔化石蜡，使盖片四周严密封闭。封好的片于可放培养皿内湿滤纸上的火柴棒支架上，盖上培养皿，可放冰箱内保存2—3天。实验六细胞核与线粒体的分级分离实验目的了解差速离心法分离细胞器的原理，以及练习使用差速离心法分离哺乳动物的细胞核与线粒体。实验原理用低渗匀浆、超声破碎或研磨等方法可使细胞膜破损，形成细胞核、线粒体、叶绿体、内质网、高尔基体、溶酶体等细胞器和细胞组分的混合匀浆，再通过差速离心，即利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分开。实验原理用组织匀浆的方法在悬浮介质中进行差速离心制备线粒体。在一给定的离心场中，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。在一均匀悬浮介质中离心一段时间后，组织匀浆中的各种细胞器及其他内含物由于沉降速度不同而停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其他更轻的细胞器和大分子可依次再分离。实验原理悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它属于等渗溶液，比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器结构和酶的活性，有利于分离，此外，该方法中采用的CaCl2有稳定核膜的作用。整个操作应注意使样品保持4°C,避免酶失活。线粒体的鉴定用詹纳斯绿B活性染色法。詹纳斯绿B对线粒体具有专一性的染色，是毒性最小的碱性染料，线粒体被詹纳斯绿B染成绿色实验原理甲苯胺蓝是常用的人工合成染料的一种,属于醌亚胺染料类,这类染料一般含有两个发色团,一个是胺基,一个是醌型苯环,来构成色原显色。染料除有发色团外,还要有能使色原对组织及其他被染物产生亲和力的原子团即助色团。助色团能促使染料产生电离成盐类,帮助发色团对组织产生染色力,使切片上的组织细胞着色。甲苯胺蓝不仅含有两个发色团,还含有两个助色团,为碱性染料,甲苯胺蓝中的阳离子有染色作用,组织细胞的酸性物质与其中的阳离子相结合而被染色。可染细胞核使之呈蓝色；肥大细胞胞质内含有肝素和组织胺等异色性物质遇到甲苯胺蓝可呈异染性紫红色，可用于尖锐湿疣的初筛及肥大细胞的检测，例如色素性荨麻疹。•离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差异进行分离、浓缩和提纯的一种方法。颗粒的沉降速度取决于离心机的转速及其自身与中心轴的距离。不同大小、形状和密度的颗粒会以不同的速度沉降。•悬浮在液体中的固相颗粒的运动速度取决于：•1．重力——液体中的颗粒处在重力场内时，如在一支平稳的试管内，将会受到地球的重力的作用而运动。2．固液相对密度的差别——相对密度小于液相的颗粒悬浮在上面，相对密度大于液相的颗粒则沉淀下来。•3．颗粒的大小、形状和密度。•4．沉降介质的粘滞力。•介质中颗粒沉降的速度取决于离心场G的大小。在离心技术中，离心场的大小一般用相对离心力RCF,即重力加速度g(9.8m/s2)的倍数来表示。RCF=l.llX10-5n2r其中：r为颗粒到旋转轴的距离，单位是cm；n为离心机的转速(转/分，r/m，rpm)。差速离心法•差速离心法：从低速到高速逐级沉淀分离，使较大的颗粒先在较低转速中沉淀，再用较高转速将原先悬浮在上清液中的较小颗粒分离沉淀下来，从而使各种亚细胞组分得以分离。但由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心时是均匀分布于整个离心介质中的，各级分离得到的第一次沉淀必然不是纯的最重颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。差速离心法主要用于分离细胞器和病毒。•其优点是：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清夜与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。•缺点是：①分离效果差，不能一次得到纯颗粒；②壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离心管一侧会出现沉淀；③颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变形、聚集而失活。为确保离心机的安全运转，使用时必须对称放置离心管，且平衡转子！！！！否则转轴及转子组件可能会损坏；严重时转子可能会停转，造成事故。记得绝对不可以用目测来平衡离心管——而要用天平。•一个35ml盛满液体的试管在3000gRCF的加速下旋转，其有效重量要大于一个大块头的成年男子。实验用品•仪器、用具：高速冷冻离心机、显微镜、天平、玻璃匀浆器、解剖剪刀、烧杯、量筒、离心管、高速离心管、玻璃漏斗、纱布、玻片。•材料：大白鼠•试剂：0.9%生理盐水、0.25mol/L蔗糖/3mmol/LCaCl2匀浆液、1%甲苯胺蓝溶液、0.02%詹纳斯绿B。方法与步骤•一、细胞核的分离提取1.实验前大鼠空腹12h，击头处死，迅速剖腹取肝，在冰浴的小烧杯中剪成小块（去除结缔组织），尽快置于冰冷的生理盐水中，反复洗涤，尽量除去血液，用滤纸吸去表面的液体。•2.剪碎的肝组织移入玻璃匀浆管中，加入适量匀浆液，进行匀浆（注意保持冰浴状态），快速匀浆20—30次后，用蔗糖/CaCl2预湿的用3层纱布过滤匀浆液于离心管中，然后制备一张涂片①，做好标记，自然干燥。•3•将装有滤液的离心管以2500g，4°C离心15min，取上清液，移入高速离心管中，并保存于冰浴中，待分离线粒体用，同时涂一张上清液片②做好标记，自然干燥。•4.收集的沉淀以少量蔗糖/CaCl2溶液重新悬浮，以2500g离心15min，弃上清液。•5•洗涤过的沉淀以少量溶液重新悬浮，制备成细胞核悬液，滴一滴于干净的载玻片上，做涂片③，自然干燥。•6.①、②、③涂片用1%甲苯胺蓝染色5min，在高倍镜下观察。•二、差速离心分离提取线粒体1•将装有上清液的高速离心管配平衡后，17000g离心20min，弃上清液，收集沉淀。•2.加入0.25mol/L蔗糖/3mmol/LCaCl2溶液1ml,用吸管吹打成悬液，17000g,4C离心20min，将上清液吸入另一试管中，沉淀加入0.1ml蔗糖/CaCl2溶液制成悬液。•3•取上清液和沉淀物悬液，分别滴一滴于干净载玻片上（涂片④、⑤），各滴一滴0.02%詹纳斯绿B染液，染色20min，镜检（为利于线粒体的有氧呼吸，不必加盖玻片）。可见有活性的线粒体进行活跃的运动，并且着色成蓝绿色。注意事项：•1.动物材料实验前可空腹过夜，以降低肝脏组织中的脂肪含量，便于实验操作。•2.实验中必须注意保持细胞器的完整性，避免过于剧烈的机械操作。尤其是线粒体在保持了呼吸氧化功能时才能经活性染色法检测。•3.由于核沉淀中可能依然存在大量因为粘连或缠绕而沉淀的线粒体，所以可酌情将步骤4中洗涤核沉淀后离心得到的上清液，与步骤3的上清液合并加以利用。•4.由于线粒体进行活性染色法的检测，所以样品制备好后应尽快染色，不要放置过久。•实验一细胞的形态观察和大小测量•实验目的•1、进一步熟悉显微镜的使用方法；•2、观察各种不同形态的细胞，从而对细胞的分类、进化及分化有所了解。•3、学习显微测微尺的使用方法，通过测微对细胞的大小有所了解。•4、掌握生物绘图的一般方法。•实验原理•细胞是生命活动的基本结构和功能单位，细胞靠表面接触外界的信息，并和外界进行物质交换；细胞形态多样，有球形、椭圆形、扁平形、长梭形、星形等，其形态与功能相适应。有机体的每种细胞都有其特定的尺寸和形态，这与它们发挥特定的功能有关，而一旦细胞不能保持固有形态，其功能就会受到损害，从而会给有机体带来一系列问题。•实验原理•光学显微镜的最高分辨率为0.2pm,而细胞器大部分在0.1pm和10pm之间，所以光学显微镜下可见到一般细胞器的外部形态。较大的细胞器和细胞核，质体等还可见到其细微结构。••细胞器往往由特殊物质组成，因而可通过对特异物质的区别染色把各种结构区分开来，每种细胞器都有特殊的形态、大小、分布位置及数目，这也是我们判断、识别细胞器的依据。而每种细胞器在不同细胞、不同发育时期和不同生理状态下的形态大小会有所不同。所以细胞器的观察可用来判断细胞的生理状和发育情况。•洋葱鳞茎表皮细胞•人口腔上皮细胞•人的红细胞•神经细胞•酵母菌细胞•实验用品•1、器材：普通光学显微镜，测微尺，刀片，剪刀，小镊子，玻片，擦镜纸•2、材料：洋葱，人口腔上皮细胞，蛙血细胞涂片，兔血细胞涂片，酵母菌涂片•3、试剂：碘液，番红染液，香柏油，二甲苯•显微测微尺的基本原理•镜台测微尺：镜台测微尺是长1mm，分成100小格，每小格为10pm,标尺的外围有一黑色的小环，以便在显微镜下寻找标尺位置，标尺的圆环上复有一圆形盖玻片以作保护。盖玻片是用树胶粘在在玻片上的，因此避免二甲苯与其接触。镜台测微尺是显微长度测量的标准，它并不被用来直接测量，而是用它来校正目镜测微尺，故其质量对所测微体影响极大。••目镜测微尺：分为线性目镜测微尺和网状目镜测微尺。线性目镜测微尺是一块比目镜筒内径稍小的有标尺的圆形玻璃片，标尺长10mm、分为100格（10：100）网状目镜测微尺上有数个正方格的网状刻度，经常使用网状目镜测微尺求面积。•••物镜测微尺•低倍镜•高倍镜•调换物镜至所需的倍数，调节焦距使至镜台测微尺的刻线最清晰。此时在视野内可以同时看到镜台测微尺和目镜测微尺。移动载物台将镜台测微尺标尺移至目镜测微尺的下方以避免后者标尺上的刻度妨碍视线。旋转目镜使目镜测微尺的标尺与镜台测微尺平行，移动载物台使镜台测微尺最左端的刻线与目镜测微尺最左端的刻线重迭，读出目镜测微尺最后端刻线镜台测微尺标尺上所在的位置。如目镜测微尺右端线不与镜台测微尺上任何刻线重合时，读出前者在所在之镜台测微尺刻度中所占的分数。移动镜台测微尺再重新使镜台测微尺左端刻线与目镜测微尺左端刻