微生物限度检查基本技术

微生物限制检查根本技术目录一、药品微生物限制检查…………3二、药品包装资料微生物限制检查法……………20三、问题解答………22一、药品微生物限制检查1、几个名词解释〔1〕微生物的概念所谓微生物是一群个体微小、构造简单肉眼不能直接看到，必需借助显微镜以及其它手段才干区分的微小生物。〔2〕菌落普通是指在固体培育基上，由细菌单细胞经过适宜温度培育在一个部分位置上，繁衍而成的可见菌体细胞群。〔3〕无菌技术无菌技术主要指在微生物实验任务中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施，其中包括无菌环境设备，无菌实验器材以及无菌操作等统称为无菌技术。〔4〕消毒消毒是指杀灭病因微生物的繁衍体，但杀不死芽孢等全部微生物。常用的清毒剂的种类75%乙醇、甲醛、碘酊、0.1%新洁尔灭、乳酸、过氧乙酸、3%来苏尔、过氧化氢等。〔5〕灭菌凡能杀灭物体中一切微生物繁衍体及芽孢或孢子的作用称为灭菌。常用的灭菌方法(5．1)干热灭菌法(5．2)湿热灭菌法〔6〕微生物限制检查法定义微生物限制检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查工程包括细菌数、霉菌数、酵菌数及控制菌检查。〔6．1〕操作环境微生物限制检查应在环境干净度10000级下的部分干净度100级的单向流空气区域内进展。检查全过程必需严厉遵守无菌操作，防止再污染。单向流空气区域、任务台面及环境应定期按<医药工业干净室〔区〕悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法>的现行国家规范进展干净验证。〔6．2〕培育温度和时间本检查法中细菌培育温度为30~35ºC；时间为48小时。霉菌、酵母菌培育温度为23~28ºC；时间为72小时。控制菌培育温度为35~37ºC；时间为48小时。眼用制剂微生物限制检查用薄膜过滤法，培育时间为7天。2、微生物限制检查方法学验证〔1〕验证采用的方法：①、常规法②、稀释法③、离心沉淀集菌法④、薄膜过滤法⑤、中和法⑥、离心和培育基稀释法⑦、离心和薄膜过滤法〔2〕、细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证〔2．1〕、菌种验证实验所用的菌株传代次数不得超越5代〔从菌种保管中心获得的冷冻枯燥菌种为第0代〕，并采用适宜的菌种保藏技术，以保证实验菌株的生物学特性。〔1〕大肠埃希菌(CMCC(B)44102)〔2〕金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26003)〔3〕枯草芽孢杆菌(CMCC(B)63501)〔4〕白色念珠菌(CMCC(F)98001)〔5〕黑曲霉(CMCC(F)98003)(2．2)、菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新颖培育物至营养肉汤培育基或营养琼脂养基中，培育18~24小时，接种白色念珠菌的新颖培育物至改良马丁培育基或改良马丁琼脂培育基中，培育24~28小时。上述培育物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1m1含菌数为50~100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新颖养物至改良马丁琼脂斜面培育基中，培育5~7天，参与3~5m10.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液〔用管口塞有适度疏松的无菌棉花或管口外包扎无菌纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管〕至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1m1含孢子数50~100cfu的孢子悬液

〔2．3〕、验证方法验证实验至少应进展3次独立的平行实验，并分别计算各实验菌每次实验的回收率。首先应进展预实验，做金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的回收率，然后再确定验证方法。〔1〕实验组平皿法计数时，取实验能够用的最低稀释级供试液1m1和50~100cfu实验菌，分别注入平皿中，立刻倾注琼脂培育基，每株实验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。薄膜过滤法计数时，取规定量实验能够用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中参与50~100cfu实验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。〔2〕菌液组测定所加的实验菌数〔3〕供试品对照组取规定量供试液，按菌落计数法测定供试品本底菌数。〔4〕稀释剂对照组假设供试液制备需求分散、乳化，中和、离心或薄膜过滤等特殊处置时，应添加稀释剂对照组，以调查供试液制备过程中微生物受影响的程度。实验时，可用相应的稀释液替代供试品，参与实验菌，使最终菌浓度为每1m1供试液含50~100cfu，按实验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。〔2．4〕、结果判别在3次独立的平行实验中，稀释剂对照组的菌回收率〔稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率〕应均不低于70%。假设实验组的菌回收率〔实验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌数的百分率〕均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；假设任一次实验中实验组的菌回收率低于70%，应采用培育基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或结合运用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进展方法验证。当最低稀释级的供试液含有抑菌活性，且采用上述消除抑菌活性的方法后实验菌的回收率还无法到达计数方法验证的要求时，根据供试品的微生物限制规范和菌数报告规那么，在不影响检验结果判别的前提下，可采用高一稀释级的供试液重新进展回收率的测定。假设实验菌的回收率符合计数方法验证的要求，应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进展实验。验证实验也可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进展。〔3〕、细菌、霉菌及酵母菌计数方法实验预备：〔干热灭菌、湿热灭菌〕把灭菌好的一切物品搬运至传送窗，翻开紫外灯杀菌，至少30分钟。检查时，按已验证的计数方法进展供试品的细菌、霉菌及酵母菌菌数的测定。取按验证的方法制备的均匀供试液，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释成1：10、1：10²、1：10³等稀释级。〔3．1〕、平皿法采用平皿法进展菌数测定时，应取适宜的衔接2~3个稀释级的供试液。取供试液1m1，置直径90mm的无菌平皿中，注入15~20ml温度不超越45℃的溶化的营养琼脂培育基或玫瑰红钠琼脂培育基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培育基〔含蜂蜜或王浆的液体制剂时〕，混匀，凝固，倒置培育。每稀释级每种培育基至少制备2个平板。〔3．1．1〕、阴性对照实验取实验用的稀释液1m1，置无菌平皿中，注入培育基，凝固，倒置培育。每种计数用的培育基各制备2个平板，均不得有菌生长。〔3．1．2〕、培育和计数除另有规定外，细菌培育48小时，逐日点计菌落数，普通以48小时的菌落数报告；霉菌、酵母菌培育72小时，逐日计点菌落数，普通以72小时的菌落数报告；必要时，可适当延伸培育时间至5~7进展菌落计数并报告；菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规那么报告菌数。假设用稀释级两个平板的菌落平均数不小于15，那么两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。普通营养琼脂培育基用于细菌计数；玫瑰红那琼脂培育基用于霉菌及酵母菌计数；酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培育基用于酵母菌计数。在特殊情况下，假设营养琼脂培育基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培育基上长有细菌，那么应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。然后将营养琼脂培育基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培育基上的细菌数，与玫瑰红钠琼脂培育基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培育基中的细菌数进展比较，以菌落数高的培育基中的菌数为计数结果。含蜂蜜、王浆的液体制剂，用玫瑰红钠琼脂培育基测定霉菌数，用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培育基测定酵母菌数，合并计数。

〔3．1．3〕、菌数报告规那么宜选取细菌、酵母菌平均菌落数在30~300之间、霉菌平均菌落数在30~100之间的稀释级，作为菌数报告〔取两位有效数字〕的根据。当仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。当同时有2个稀释级的菌落数符合上述规定时，视两者比值〔比值为高稀释级的菌数乘以稀释倍数的值除以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值〕而定。假设比值不大于2，以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌数；假设比值大于2但不超越5时，以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数；当出现比值大于5，或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌数等异常情况，应查明缘由再行检查，必要时，应进展方法的重新验证。当各稀释级的平均菌落数小于30，以最低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。如各稀释级的平板无菌落生长，或仅最低稀释级的平均菌落数生长，但平均菌落数小于1小时，以＜1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。菌落数报告举例序列各稀释级平板平均菌落数菌落数1：101：1001：1000135203502963729603不可计2003528000425422505000＜10（3．1．4）、操作的注意事项制备的供试液力求分散均匀，使之菌体能均匀分散，其次在每次吸取供试液注皿的时候，都要把供试液摇匀，这样能使两个平板上生长的菌落数比较接近。浇注培养基的温度不能高，浇注好的平板摇匀后即要求冷却，不要把平板垒起来，这样不利于冷却。操作时间不能太长，一般要求从供试品稀释到注皿的时间不要超过1小时，因为有些活力较好的菌体在制备供试液的过程中就可行细胞分裂，这样测得的菌数就不能代表原始的污染程度。另外，供试液的平皿底部接触时间太长，会使菌液药渣附着不宜摇散。可以在培养基中加0.1‰的TTC。〔3．1．4〕、操作的本卷须知制备的供试液力求分散均匀，使之菌体能均匀分散，其次在每次汲取供试液注皿的时候，都要把供试液摇匀，这样能使两个平板上生长的菌落数比较接近。浇注培育基的温度不能高，浇注好的平板摇匀后即要求冷却，不要把平板垒起来，这样不利于冷却。操作时间不能太长，普通要求从供试品稀释到注皿的时间不要超越1小时，由于有些活力较好的菌体在制备供试液的过程中就可行细胞分裂，这样测得的菌数就不能代表原始的污染程度。另外，供试液的平皿底部接触时间太长，会使菌液药渣附着不宜摇散。可以在培育基中加0.1‰的TTC。〔3．2〕、薄膜过滤法采用薄膜过滤法，滤膜孔径应不大于0.45um，直径普通为50mm，假设采用其他直径的滤膜，冲洗量应进展相应的调整。选择滤膜材质时应保证供试品及其溶液不影响微生物的充分被截留。滤器及滤膜运用前应采用适宜的方法灭菌。运用时，应保证滤膜在过滤前后的完好性。水溶性供试液过滤前先少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在运用前应充分枯燥。为发扬滤膜的最大过滤效率，应留意坚持供试品溶液及冲洗覆盖整个滤膜外表。供试液经薄膜过滤后，假设需求用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml。每片滤膜的总过滤量不宜过大，以防止滤膜上的微生物受损伤。取相当于每张滤膜含lg或1m1供试品的供试液，加至适量的稀释剂中，混匀，过滤。假设供试品每1g或1m1所含的菌较多时，取适宜稀释级的供试液1m1，过滤。用ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗滤膜，冲洗方法和冲洗量同“计数方法的验证〞。冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培育基或玫瑰红钠琼脂培育或酵母渗出粉胨葡萄糖琼脂培育基平板上培育。每种培育基至少制备一张滤膜。〔3．2．1〕、阴性对照实验取实验用的稀释液1m1照上述薄膜过滤法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。〔3．2．2〕、培育和计数培育条件和计数方法用平皿法，每片滤膜上的菌落数应不超越100个。〔3，2．3〕、菌数报告规那么以相当于1g或1m1供试品的菌落数报告菌数；假设滤膜上无菌数生长，以＜1报告菌数〔每张滤膜过滤1g或1m1供试品〕，或＜1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。〔4〕控制菌检查方法的验证〔4．1〕菌种对实验菌种的要求同细菌、霉菌及酵母计数方法的验证。〔1〕大肠埃希菌〔CMCC(B)44102〕〔2〕金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26003)〔3〕乙型付伤寒沙门菌(CMCC(B)50094)〔4〕铜绿假单胞菌(CMCC(B)10104)〔5〕生孢梭菌(CMCC(B)64941)〔4．2〕菌液制备〔4．3〕验证方法〔4．3．1〕实验组〔4．3．2〕阴性菌对照组〔4．4〕结果判别〔5〕控制菌检查〔5．1〕阳性对照实验〔5．2〕阴性对照实验〔5．3〕大肠埃希菌取供试液10ml〔相当于供试品1g、1ml、10cm2〕,直接或处置后接种至适量〔不少于100ml〕的胆盐乳糖培育基中，培育18～24小时，必要时可延伸至48小时。取上述培育物0.2ml，接种至含5mlMUG培育基的试管内，培育，于5小时、24小时在366nm紫外线下察看，同时用未接种的MUG培育基作本底对照。假设管内培育物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。察看后，沿培育管的管壁参与数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本性，为靛基质阴性。本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。如MUG阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如MUG阴性、靛基质阴性判供试品未检出大肠埃希菌；如MUG阳性、靛基质阴性，或MUG阴性、靛基质阳性，那么应取胆盐乳糖培育基的培育物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培育基或麦康凯琼脂培育基的平板上，培育18～24小时。假设平板上无菌落生长、或生长的菌落与麦1所列的菌落形状特征不符，判供试品未检出大肠埃希菌。假设平板上无菌落生长、或生长的菌落与麦1所列的菌落形状特征相符或疑似，应进展分别、纯化、染色镜检查和适宜的生化实验，确认能否为大肠埃希菌。培养基菌落形态培养基菌落形态曙红亚甲蓝琼脂呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有金属光泽麦康凯琼脂鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润表1大肠埃希菌菌落形状特征〔5．4〕大肠菌群取含适量(不少于10ml)的胆盐乳糖培育基管3支，分别参与1：10的供试液1ml〔含供试品0.1g或0.1ml〕、1：100的供试液1ml〔含供试品0.01g或0.01ml〕、1：1000的供试液1ml〔含供试品0.001g或0.001ml〕，另取1支胆盐乳糖发酵培育基管参与稀释液1ml作为阴性对看管。培育18～24小时。胆盐乳糖发酵管假设无菌生长、或有菌生长但不产酸产气，判该管未检出大肠菌群；假设产酸产气，应将发酵管中的培育物分别划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培育基的平板上，培育18～24小时。假设平板上无菌生长，或生长的菌落与表2所列的菌落形状特征不符或为非革兰阴性无牙孢杆菌，判该管未检出大肠菌群；假设平板上生长的菌落与表2所列的菌落形状特征相符或疑似，且为革兰阴性无牙孢杆菌应进展确证实验。表2大肠菌菌落形状特征

培养基菌落形态曙红亚甲蓝琼脂呈紫黑色、紫红色、红色或粉红色，圆形，扁平或稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润麦康凯琼脂鲜桃红色或粉红色，圆形，扁平或稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润确证实验从上述分别平板上挑选4～5个疑似菌落，分别接种于乳糖发酵管中，培育24～48小时。假设产酸产气，判该胆盐乳糖发酵管检出大肠菌群，否那么判未检出大肠菌群。根据大肠菌群的检出管数，按表3报告1g或1ml供试品中的大肠菌群数。表3能够的大肠菌群数表

各供试品量的检出结果可能的大肠菌群数N(个/g或ml)0.1g或0.1ml0.01g或0.01ml0.001g或0.001ml+++_++__+___＞1000100＜N＜100010＜N＜100＜10注+代表检出大肠菌群；一代表未检出大肠菌群。〔5．5〕沙门菌〔5．6〕铜绿假单胞菌〔5．7〕金黄色葡萄球菌〔5．8〕梭菌〔6〕结果判别供试品检出控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再复试。供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数其中任何一项不符合该种类项下的规定，应从一批样品中随机抽样，独立复试两次，以3次结果的平均值报告菌数。眼用制剂检出霉菌和酵母菌数时，须以两次复试结果均不得长菌，方可判供试品的霉菌和酵母菌数符合该种类项下的规定。假设供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数、控制菌三项检验结果均符合该种类项下的规定，判供试品符合规定，假设其中任何一项不符合该种类项下的规定，判供试品不符合规定。〔7〕微生物限制规范〔一部有修正的部分〕〔7．1〕、含豆豉神曲等发酵原粉的制剂细菌数每1g不得过100000个。每1m1不得过1000个。霉菌和酵母菌数每1g不得过500个。每1m1不得过100个。大肠埃希菌每1g或1m1不得检出。大肠菌群每1g应小于100个。每1m1应小于10个。〔7．2〕、阴道、尿道给药制剂细菌数每1g、1m1或10cm²不得过100个。霉菌和酵母菌数每1g、1m1或10cm²应小于10个。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、梭菌每1g、1m1或10cm²不得检出〔7．3〕、含动物脏器〔包括提取物〕及动物类原药材粉〔蜂蜜、王浆、动物角、阿胶除外〕的口服给药制剂。每10g或10ml还不得检出沙门菌。二、药品包装资料微生物限制检查法

1.口服固体药用聚丙稀瓶和口服固体药用高密度聚乙稀瓶取数个试瓶，参与标示容量1/3量的氯化钠注射液,将盖旋紧,振摇1分钟,取提取液照微生物限制检查法(中华人民共和国药典2000年版二部附录XIJ)测定。细菌数每瓶不得超越1000个，霉菌、酵母菌数每瓶不得超越100个，大肠杆菌每瓶不得检出。2、口服固体聚酯瓶取本品适量，参与标示容量1/2量的0.9%无菌氯化钠溶液，将盖旋紧，振摇1分钟，提取液进展薄膜过滤，照微生物限制检查法〔中华人民共和国药典2000年版二部附录XIJ)测定。细菌数每瓶不得超越1000个，霉菌、酵母菌数每瓶不得超越100个，大肠杆菌每瓶不得检出。3、口服液体瓶取数个试瓶，参与1/2标示容量的氯化钠注射液,将盖旋紧,振摇1分钟,提取液进展薄膜过滤，照微生物限制检查法〔中华人民共和国药典2000年版二部附录XIJ)测定。细菌数每瓶不得超越100个，霉菌、酵母菌数每瓶不得超越100个，大肠杆菌每瓶不得检出。4、药用滴眼剂瓶〔烧伤及手术用滴眼剂瓶除外〕取数个试瓶，参与1/2标示容量的氯化钠注射液,将盖旋紧,振摇1分钟,提取液进展薄膜过滤，照微生物限制检查法〔中华人民共和国药典2000年版二部附录XIJ)测定。细菌数每瓶不得超越100个，霉菌、酵母菌不得检出，金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌每瓶不得检出。

5、外用液体瓶取数个试瓶，参与1/2标示容量的氯化钠注射液,将盖旋紧,振摇1分钟,提取液进展薄膜过滤，照微生物限制法〔中华人民共和国药典2000年版二部附录XIJ)测定。细菌数每瓶不得超越100个，霉菌、酵母菌数每瓶不得超越100个，金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌每瓶不得检出。6、药用软膏管〔大面积烧伤及严重损伤皮肤用除外〕取本品10支，向每支参与标示容量2/3量的0.9%无菌氯化钠溶液，振荡1分钟后，合并提取液备用。照微生物限制检查法〔中华人民共和国药典2000年版二部附录XIJ)测定。细菌数每支不得超越100个，霉菌、酵母菌数每支不得超越100个，金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌每支均不得检出。7、药用复合硬片、药用复合膜和袋、药用铝箔、药用复合垫片取本品用开孔面积20㎝２的消毒过的金属模版压在内层面上，将无菌棉签用0.9%无菌氯化钠溶液，稍沾湿，在板孔内擦抹5次，换1支棉签再擦抹5次，每个位置用两支棉签共擦抹10次，共擦抹5个位置100㎝２。每支棉签抹完后立刻剪断〔或烧断〕，投入盛有30ml0.9%无菌氯化钠溶液的锥型瓶〔或大试管〕中。全部擦抹棉签投入瓶中后，将瓶迅速摇摆1分钟，即得供试液。取提取液，照微生物限制法〔中华人民共和国药典2000年版二部附录XIJ)测定。细菌数不得超越1000个/100㎝２,霉菌、酵母菌数不得过100个/100㎝２,大肠杆菌不得检出。三、问题解答1、微生物限制验证可否用供试品原液做。没用到稀释剂能否要做稀释剂对照组，算回收率。〔检验的时候用到稀释剂，验证时候用原液不用稀释剂？答：微生物限制验证可以用供试品原液。没有用到稀释剂不用做稀释剂对照组。2、微生物检验时，由-1级稀释到-2级，是用pH7.0氯化钠蛋白胨水溶液还是可用生理盐水，还是均可用？答：微生物限制检验稀释剂都要用ph7.0氯化钠蛋白胨水溶液，除非有特殊情况。3、同一样品中汲取1

ml结果超越平板最大差值，如何控制？答：同稀释液两个平板的菌落平均数不小于15，那么两个平板的菌落数不能相差1倍以上。操作时尽量用微量移液管，尽量使供试液充分混匀。4、个别产品微生物方法学验证做不出怎样办？答：假设没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用，那么验证实验中微生物回收的失败可看成是因供试品的抗菌活性引起的，同时阐明该供试品不能被实验菌污染。但是，供试品也能够仅对实验用菌株具有抑制造用，而对其他菌株没有抑制造用。因此，根据供试品须符合的微生物限制规范和菌数报告规那么，在不影响检验结果判别的前提下，应采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进展方法验证实验。假设验证实验符合要求，应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进展供试品检验。计数方法验证时，采用上述方法假设还存在一株或多株实验菌的回收率达不到要求，那么选择回收情况最接近要求的方法和实验条件进展供试品的检验。5、对YBB00072005微生物限制的详细检验方法的留意点能否讲解？答：YBB0072005微生物限制检验方法的留意点：〔1〕严厉无菌操作。〔2〕在内层面上操作。〔3〕最后的报告结果要乘以30。6、延续消费的不同批号同个种类的废品大肠埃希菌检查，每批次都要做阳性对照吗？答：同一天实验的话，只需做一个阳性对照就可以；不是同一次实验的话，每次都要做阳性对照。7、细菌、霉菌和酵母菌计数方法验证中的3次独立的平行实验，是指同批次3次还是不同批次3次独立平行实验？答：指同种类不同批次3次独立平行实验。8、要求检查沙