环境微生物实验南开大学环境科学与工程学院TheCol

环境微生物实验环境科学与工程学院实验一培育基的制备

培育基是用人工的方法将多种营养物质按微生物生长代谢的需求配制成的一种营养基质。培育基中均应含有满足微生物生长发育且比例适宜的水分、碳源、氮源、无机盐、生长要素以及某些特需的微量元素外还应具有适宜的酸碱度〔pH值〕、缓冲才干、氧化复原电位和浸透压。一、实验目的学习和掌握配制培育基的普通方法和步骤二、实验器材(1)药品和试剂：牛肉膏、蛋白陈、NaCl、10％NaOH溶液、l0％盐酸溶液。可溶性淀粉、K2HPO4、MgSO4·7H2O、KNO3、NaCl、FeSO4·7H2O、琼脂、10％NaOH溶液、10％盐酸。(2)器材：小烧杯、小铝锅、天平、牛角匙、1000mL刻度烧杯、玻棒、pH试纸、试管、分装漏斗、棉花。三、方法与步骤1、牛肉膏蛋白胨培育基的配制(1)培育基配方：牛肉膏5.0g蛋白胨10.0g、NaCl5.0g、琼脂20.0g、自来水1000mL、pH7.0。(2)操作步骤：1〕称药品按实践用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或外表皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放人热水中，牛肉膏便与称量纸分别，立刻取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。2〕加热溶解在烧杯中参与少于所需求的水量，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。假设配制固体培育基，那么将称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热融化，此过程中．需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。3〕调pH检测培育基的pH，假设pH偏酸，可滴加1滴1mol•L-1NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至到达所需pH范围。假设偏碱，那么用1mol•L-1HCl进展调理。pH的调理通常放在加琼脂之前。应留意pH值不要调过头，以免回调而影响培育基内各离子的浓度。4〕过滤液体培育基可用滤纸过滤，固体培育基可用4层纱布趁热过滤，以利结果的察看。但是供普通运用的培育基，该步可省略。5〕分装披实验要求，可将配制的培育基分装入试管或三角瓶内。分装时可用漏斗以免使培育基沾在管口或瓶口上面呵斥污染(见图4－1)。分装量：固体培育基约为试管高度的1／5，灭菌后制成斜面〔图4－2〕。分装入三角瓶内以不超越其容积的一半为宜。半固体培育基以试管高度的1/3为宜．灭菌后垂直待凝。6〕加棉塞试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制造的棉塞，棉塞制造方法如图4—3。棉塞的外形、大小和松紧度要适宜，周围紧贴管壁，不留缝隙，才干起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总长约3／5塞入试管口或瓶口内，以防棉塞零落。有些微生物需求更好的通气，那么可用8层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞替代棉塞。7〕包扎加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。8〕培育基的灭菌时间和温度，需按照各种培育基的规定进展，以保证灭菌效果和不损培育基的必要成份。培育基经灭菌后，必需放37℃温室培育24h，无菌生长者方可运用。图例图4－1培育基分装图4－2斜面制造图4－3棉塞制造方法2、高氏一号培育基的制备(1)培育基配方：可溶性淀粉20g、KNO31.0g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O0.5g、NaCl0.5g、FeSO4·7H2O0.01g、琼脂20g、蒸馏水1000mL、pH7.2~7.4。

(2)操作步骤：1〕称量和溶解先计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将其调成糊状，再加少于所需水量的沸水中，继续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解。再参与其他成分依次溶解。对微量成分FeSO4·7H2O可先配成高浓度的贮备液后再参与，方法是先在100mL水中参与1g的FeSO4·7H2O，配成浓度为0.01g•L-1的贮备液，再在1000mL培育基中参与以上贮备液1mL即可。待一切药品完全溶解后．补充水分到所需的总体积。如要配制固体培育基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培育基配制。2〕pH调理、分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白胨培育基配制。3．常用的真菌培育基配方〔1〕马铃薯培育基：用以分别培育霉菌、酵母菌马铃薯(去皮)200g葡萄糖(或蔗糖)20g琼脂20g水1000mLpH自然121℃灭菌30min上述培育基中参与1％的酵母粉或蛋白胨，那么能促进孢子的大量添加。〔2〕蔗糖硝酸钠培育基〔察氏培育基〕：适宜于鉴定多数霉菌蔗糖30gK2HPO41gKCl1gNaNO42gMgSO4·7H2O0.5gFeSO4·7H2O0.01g水1000mLpH6.7如用以分别霉菌时．可加乳酸调理成pH5.0～5.5，制成酸性培育基。〔3〕马丁(Martin)孟加拉红一链霉素培育基：葡萄糖10g蛋白胨7gK2HPO41.0gMgSO4·7H2O0.5g孟加拉水溶液(1／3000)100mL水800mL121℃灭菌30分钟运用时加链霉素：<1>取国产1g装链霉素一瓶．用无菌注射器注入无菌蒸馏水5mL。溶解后，汲取出0.5mL链霉素溶液，移注入330mL无菌蒸馏水即得0.03％链霉素。<2>上述根底培育基在沸水锅中融化后冷却至55~60℃，每10mL根底培育基加1mL0.03％链霉素溶液(含链霉素30μL•mL-1)〔4〕麦芽汁培育基：麦芽汁20g蛋白胨1g葡萄糖20g水1000mL琼脂20gpH5〔5〕豆芽汁培育基，适用于酵母和霉菌。黄豆芽〔或绿豆芽〕100g白糖〔或蔗糖〕10～30g琼脂20g水1000mL先将洗净的豆芽放在水中煮沸30min，用2层纱布滤去豆芽，将豆芽汁补足水分，加糖〔培育酵母时糖量要高〕pH自然。四、本卷须知称药品用的牛角匙不要混用；称完药品应及时盖紧瓶盖。调pH时要小心操作，防止回调，不同培育基各有配制特点，要留意详细操作。五、实验报告记录本实验配制培育第的称号、数量，并图讲解明其配制过程，指明要点。六、问题和思索1．配制培育基有哪几个步骤?在操作过程中应留意些什么问题?为什么?2．培育基配制完成后，为什么必需立刻灭菌?假设不能及时灭菌应如何处置？已灭菌的培养基进展无菌检查？3．牛肉膏蛋白胨培育基属何种培育基？它除了培育细菌外，能培育真菌和放线菌吗？高氏培育基属何种培育基?除培育放线菌外高氏培育基还能培育细菌和真菌吗?为什么?采用剧烈的理化要素使任何物体内外一切的微生物永远丧失其生长繁衍才干的措施称之为灭菌。灭菌是要进展微生物纯培育的需求。实验室最常用的灭菌方法是利用高温处置到达杀菌效果。高温主要是使微生物的蛋白质和核酸等重要生物大分子发生变性。高温灭菌分为干热灭菌和湿热灭菌两大类。湿热灭菌的效果比优于干热灭菌。湿热下热量易于传送，更容易破坏坚持蛋白质稳定性的氢键等构造，加速其变性。此外，过滤除菌、射线灭菌和消毒、化学药物灭菌和消毒等也是微生物学操作中不可短少的常用方法。实验二消毒和灭菌

一、实验目的和内容目的：了解消毒和灭菌的原理并掌握各种灭菌方法的操作步骤。内容：1．高压蒸汽灭菌法。2．干热灭菌法。3．过滤除菌法。二、实验资料和器具待灭菌的培育基和链霉素溶液。高压蒸汽灭菌锅、电热烘箱、过滤除菌器、培育皿、试管三、操作步骤(—)高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法适用于培育基、无菌水、任务服等物品的灭菌。1．加水将内层灭菌桶取出，再向外层锅内参与适量的水，以水面与三角架相平为至。2．装料将装料桶放回锅内，装入待灭菌的物品。装有培育基的容器放置时要防止液体溢出，瓶塞不要紧贴桶壁，以防冷凝水沾湿棉塞。3．加盖将盖上与排气孔相衔接的排气软管插人内层灭菌桶的排气槽内，摆正锅盖，对齐螺口，然后以同时旋紧相对的两个螺栓的方式拧紧一切螺栓，并翻开排气阀；4．排气加热．待水煮沸后，水蒸汽和空气一同从排气孔排出。普通以为，当水沸后约5min，阐明锅内空气已排净。5．升压当锅内空气排净时，即可封锁排气阀，压力开场上升。6．保压当压力表指针到达所需压力刻度时，控制热源。开场计时并维持压力至所需时间。本实验用121℃，20min灭菌。7．降压到达所需灭菌时间后，封锁热源，让压力自然下降到零后，翻开排气阀。放净余下的蒸汽后，再翻开锅盖，取出灭菌物品，倒掉锅内剩水。8．无菌检查将已灭菌培育基于37℃培育24h，无杂菌生长，即可待用。(二)干热灭菌法干热灭菌法适用于玻璃器皿，如试管、培育皿、三角瓶、移液管等的灭菌；1．装入待灭菌物品预先将各种器皿用纸包好或装入金属制的培育皿筒、移液管筒内，然后放人电热烘箱中。2．升温关好电烘箱门，翻开电源开关，旋动恒温调理器至所需温度刻度(本实验所需为160～170℃)，此时烘箱红灯亮，阐明烘箱已开场加热，当温度上升至所设定温度后那么烘箱绿灯亮，表示已停顿加温。3．恒温当温度升到所需温度后，维持此温度2h。4．降温切断电源，自然降温。5.取出灭菌物品待电烘箱内温度降到70℃以下后，才干翻开箱门，取出灭菌物品。(三)过滤除菌法有些物质，如抗生素、血清、维生素等易受热分解，因此要采用过滤除菌法。1．过滤器的种类(1)滤膜过滤器：由醋酸纤维素、硝酸纤维素等制成，有孔径大小不同的多种规格(如0.1μm、0.22μm、0.3μm、0.45μm等)，过滤细菌常用0.45μm孔径。其优点是吸附性小，即溶液中的物质损耗少，滤速快，每张滤膜只运用1次，不用清洗。(2)蔡氏滤器：是一种金属制成的过滤漏斗，其过滤部分是一种用石棉纤维和其他填充物压制成的片状构造。溶液中的细菌经过石棉纤维的吸附和过滤而被去除，但对溶液中其他物质的吸附性也大。每张纤维板只能运用1次。(3)玻璃滤器：是一种由玻璃制成的过滤漏斗，其过滤部分是由细玻璃粉烧结成的板状构造。玻璃滤器规格很多，5号(孔径2—5μm)和6号(孔径小于2μm)适用于过滤细菌。其优点是吸附量少，但每次运用后要洗净再用。清洗方法是：用水充分冲洗，然后浸于含1％KNO3的浓硫酸中24h，再用蒸馏水抽洗数次。在抽洗液中加人数滴BaCl2，至不出现BaSO4沉淀时，即表示已洗净。2．过滤安装〔1〕按图4-4进展安装，为阻止空气中细菌进人滤瓶而在接纳处塞入棉花、外用纸包好进展121℃湿热灭菌20min。(2)为加快过滤速度，普通用负压抽气过滤，可接真空泵进展抽滤。四、本卷须知1．运用灭菌锅应严厉按照操作程序进展，防止发惹事故；灭菌时，操作者切勿擅自分开，务必待压力下降到零后，才可翻开锅盖。2．干热灭菌时电烘箱中物品不要摆得太拥堵，以免妨碍空气流通而影响灭菌效果；灭菌物品不要与电烘箱内壁的铁板接触．以免包装纸烤焦起火。3．过滤除菌时应留意检查过滤安装各衔接处能否漏气，以防污染。五、实验报告1．记录各种不同物品所用的灭菌方法及灭菌条件(温度、压力等)。2．试述高压蒸汽灭菌的操作过程及本卷须知。六、问题和思索1．比较各种灭菌方法的原理及适用范围。2．高压蒸汽灭菌中为什么要把冷空气排净，为什么在灭菌后不能骤然快速降压，并要再放尽锅内蒸汽才干翻开锅盖?微生物接种技术是进展微生物实验和相关研讨的根本操作技艺。无菌操作是微生物接种技术的关键。斜面接种、液体接种、固体接种和穿刺接种操作均以获得生长良好的纯种微生物为目的。由于接种方法不同，采用的接种工具也有区别，如固体斜面培育体转接时用接种环；穿刺接种时用接种针，液体转接用移液管等。实验三微生物的接种技术一、实验目的：了解各种微生物接种方法。二、实验资料和器具：已灭菌培育基、接种环、接种针、酒精灯、移液管、记号笔三、实验步骤：1、斜面接种技术斜面接种是从已生长好的菌种斜面上挑取少量菌种移植至另一新颖斜面培育基上的一种接种方法。详细操作如下：(1)贴标签接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名等。贴在距试管口约2～3cm的位置。(假设用记号笔标志那么不需标签)。。(2)点燃酒精灯。(3)接种用接种环将少许菌种移接到贴好标签的试管斜面上。操作必需按无菌操作法进展。简述如下：1)手持试管将菌种和待接斜面的两支试管用大姆指和其他四指握在左手中．使中指位于两试管之间部位。斜面面向操作者，并使它们位于程度位置。2)旋松管塞先用有于松动棉塞或塑料管盖，以便接种时拔出。3)取接种环右手拿接种环，在火焰上将环端灼烧灭菌．然后将有能够伸入试管中的其他部分均灼烧灭菌，反复此操作．再灼烧一次。4)拔管塞用右手的无名指、小指和手掌边先后取下菌种管和待接试管的管塞，然后让试管口渐渐过火灭菌(切勿烧得过烫)。见图4—6(a)所示。图4－6试管拔塞后过火灭菌和取菌8)塞管塞取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将管塞旋上。不要用试管去迎棉塞，以免试管在挪动时纳入不洁空气。9)将接种环灼烧灭菌。放下接种环，再将棉花塞旋紧。2、液体接种技术(1)用斜面菌种接种液体培育基时，有下面两种情况：如接种量小，可用接种环取少量菌体移入培育基容器(试管或三角瓶等)中，将接种环在液体外表振荡或在器壁上悄然摩擦把菌苔散开，抽出接种环，塞好棉塞，再将液体摇动，菌体即均匀分布在液体中。如接种量大，可先在斜面菌种管中注入定量无菌水．接种环把菌苔刮下研开，再把菌悬液倒入液体培育基中，倒前需将试管口在火焰上灭菌。(2)用液体培育物接种液体培育基时，可用无菌的吸管或移液管汲取菌液接种。3、固体接种技术固体接种最普遍的方式是接种固体菌制剂。因所用菌种或种子菌来源不同分为：1)用菌液接种固体料可用菌苔刮洗制成的悬液。接种时可按无菌操作法将菌液直接例入固体培育基中，搅拌均匀。留意接种所用菌液量要计算在固体料总加水量之内，否那么往往在用液体种子菌接种后含水量加大，影响培育效果。2)用固体种子接种固体料包括用孢子粉、菌丝孢子混合种子菌或其他固体培育的种子菌，直接把接种资料混入灭菌的固体料。接种后必需充分搅拌．使之混合均匀。4、穿刺接种技术穿刺接种技术是一种用接种针从菌种斜面上挑取少量菌体并把它穿刺到固体或半固体的深层培育基中的接种方法。经穿刺接种后的菌种常作为保藏菌种的一种方式，同时也是检查细菌运动才干的一种方法，它只适宜于细菌和酵母的接种培育。详细操作如下．(1)贴标签。(2)点燃酒精灯。(3)穿刺接种，方法如下1)手持试管。2)旋松棉塞。3)右手拿接种针在火焰上将针端灼烧灭菌，接着把在穿刺中能够伸入试管的其他部位也灼烧灭菌；4)用右手的小指和手掌边拔出棉塞。接种针先在培育基部分冷却．再用接种针的针尖沾取少量菌种。5)接种有两种手持操作法。一种是程度法，它类似于斜面接种法。一种那么称垂直法，如图4—8所示。虽然穿刺时手持方法不同，但穿刺时所用接种针都必需挺直，将接种针自培育基中心垂直地刺入培育基中。穿刺时要做到手稳、动作轻巧快速，并且要将接种针穿刺到接近试管的底部，然后沿着接种线将针拔出。最后，塞上棉塞，再将接种针上残留的菌在火焰上烧掉。(4)将接种过的试管直立于试管架上，放在37℃或28℃恒温箱中培育。24h后察看结果(留意：假设具有运动才干的细菌，它能沿着接种线向外运动而弥散，故构成的穿刺线较粗而散、反之那么细而密)。图4－7斜面划线法〔a〕和不同细菌直线接种长出的菌苔形状〔b〕图4－8穿刺接种：〔a〕程度穿刺接种；〔b〕垂直穿刺接种四、实验报告列表比较各种接种方法及本卷须知。五、问题和讨论1、

斜面接种取菌前为什么要将灼烧过的接种针在无菌培育基上沾一下？穿刺接种时能否将接种针直接穿透培育基？微生物都是个体微小的生物，用肉眼不能看到它们的个体，所以察看它们的形状必需在显微镜下进展，另外微生物细胞具有较高的透明性，所以有些微生物〔尤其是细菌和放线菌〕需求经过染色后才干察看清楚，细菌个体很小，其大小以微米计，所以需求在油镜下察看。放线菌和霉菌的个体普通呈丝状，并且明显地分为基质菌丝和气生菌丝。成熟地个体还具有各种形状的孢子。实验四微生物形状的察看一、实验目的和内容目的：经过实验学习察看微生物形状的根本方法，了解细菌、放线菌和霉菌的形状特征。内容：1.察看细菌的根本形状和构造染色装片。2．察看放线菌形状装片。3．察看霉菌染色装片，仔细察看基质菌丝、气生菌丝和孢子形状。4．掌握细菌制片方法。二、实验资料和器具葡萄球菌、大肠杆菌、棒杆菌、螺菌的斜面菌种，放线菌平板培育物，霉菌平板培育物。香柏油、二甲苯、无菌水。显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片。三、操作步骤1、察看细菌的根本形状用低倍镜、高倍镜和油镜察看球菌、杆菌、螺菌，并分别在油镜下绘图。2、察看细菌的细胞构造用低倍镜、高倍镜和油镜察看宏大芽孢杆菌(示细胞壁)、宏大芽孢杆菌(示异染粒)、苏云金芽孢杆菌(示伴胞晶体)、普通变形菌(示鞭毛)、丙酮丁醇梭菌(示芽孢)、褐球固氮菌(示荚膜)等细菌，并绘图。3、察看放线菌、霉菌染色装片。用低倍镜察看放线菌、霉菌菌丝形状，包括基质菌丝、气生菌丝；放线菌孢子丝；根霉假根，孢子囊；曲霉、青霉分生孢子梗及分生孢子。4、察看枯草芽孢杆菌活菌常用压滴法。如图4-9所示。图4－9压滴法制片表示图1〕将干净无油腻的载片放于本人右边前方，在中央放—小滴无菌水。〔2〕将酒精灯放于本人正前方，点燃。〔3〕用无菌操作方法从枯草芽孢杆菌斜面中沾取少量菌体，与载片上的水滴充分混匀，把接种环上残留的菌体杀灭后，放回试管架。〔4〕用镊子夹一干净的盖玻片，使其一边先接触菌液．然后将整个盖玻片渐渐放下，留意不要产生气泡。如菌液过多，可用吸水纸适当吸去一部分。〔5〕先用低倍镜然后转用高倍镜观查，察看光阴线要适当调暗些。四、本卷须知1、留意擦镜头时，只能用擦镜纸。2、察看终了，必需将镜筒上升，才干取下装片．放入另一装片后，要按运用油镜要求，重新操作．不能在油镜下直接取下和交换装片，切记！3、无菌操作过程中，接种环灭菌后不能触及其他物品，挑菌不能过多。五、实验报告1、给出他所察看到的几种细菌的个体形状视野图。2、绘出他所察看到的细菌细胞构造视野图，并注明各部分。六、问题和讨论1、出在制备活菌装片时，应留意什么问题?2、用明视野显微镜察看细菌的形状时，他以为用染色装片好，还是用非染色的活体装片好？为什么？察看活体装片与染色装片，光线调理各有什么不同?3、无菌操作过程中，可否将棉塞放在桌面上?为什么?4、试设计一个预备本实验的任务方案。用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋电质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料(如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等)使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培育基pH值下降时，细菌所带正电荷添加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料．如伊红美蓝、伊红天青等。实验五细菌染色法及微生物的察看简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形状的方法难于区分细菌细胞的构造。革兰氏染色法法可将一切的细菌区分为革兰氏阳性菌(G－)和革兰氏阴性菌(G＋)两大类，是细菌学上是常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G－菌和G＋菌，是由这两类菌的细胞壁构造和成分的不同所决议的。G－菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，添加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G＋菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处置后反而使肽聚糖层的孔径减少，通透性降低，因此细菌仍保管初染时的颜色。细菌荚膜染色的原理是由于荚膜和染料间的亲和力弱，不易着色，通常采用负染色法染荚膜，即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色，从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜的含水量在90％以上，固染色时普通不加热固定，以免荚膜伸展变形。细菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，假设用普通染色法只能使菌体着色而芽胞不着色(芽胞呈无色透明状)。芽胞染色法就是根据芽胞既难以染色而一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。一切的芽胞染色法都基于同一个原那么：除了用着色力强的染料外，还需求加热，以促进芽胞着色。当染芽胞时，菌体也会着色，然后水洗，芽胞染上的颜色难以渗出，而菌领会脱色。然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽胞呈现出不同的颜色，因此能更明显地烘托出芽胞，便于察看。细菌的鞭毛极细，直径普通为10～20nm，只需用电子显微镜才干察看到。但是，如采用特殊的染色法，那么在普通光学显微镜下也能看到它。鞭毛染色的方法很多．但其根本原理一样，即在染色前充用媒染剂处置，让它堆积在鞭毛上．使鞭毛直径加粗。然后再进展染色。一、实验目的和内容目的：稳定无菌操作技求，掌握细菌及其构造的染色技术。内容：1、学习细菌单染色操作技术。2、学习革兰氏染色技术。3、学习细菌的荚膜、芽孢及鞭毛染色方法。二、实验资料和器具1、单染色法：〔1〕大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的斜面菌种。〔2〕吕氏美蓝染色液、石炭酸复红染色液、黑色素液或碳素墨水、香柏油、二甲苯、无菌水〔3〕显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸、无菌牙签。2、革兰氏染色：〔1〕

黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠杆菌〔E.coli〕菌液，待测菌菌液l～2种；〔2〕

革兰氏染色液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95％乙醇、石炭酸复红液等)、〔3〕

香柏油、二甲苯；显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯。3、荚膜染色：(l)在阿须贝(Ashby)无氮培育基上培育3—5天的团褐固氮菌(Azotobacterchroococcum)或者培育2—3天的硅酸盐细菌(Bacillusmucilaginosussubspsilicus)(2)李夫森氏染色液、硼酸钠美兰染色液、石炭酸复红染色液、黑色液。(3)载玻片、接种环、洗瓶。(4)显微镜。4、鞭毛染色：(1)在牛内膏蛋白胨斜面上培育19—24小时的假单孢菌(Pseudomonas.sp)，此培育体在取用前经过每日移植—代，延续移植5～7代。(2)新配制的费氏及康氏鞭毛染色液A和B。(3)无菌水、无菌空试管、凹玻片。盖玻片、干净载玻片、接种环、洗瓶。(4)显微镜．5、芽孢染色：(1)在牛肉膏蛋白胨斜面上培育24～36小时的枯草杆菌或者苏云金杆菌。(2)载玻片、接种环、酒精灯、洗瓶、镊子。(3)显微镜。(4)香柏油、二甲苯、擦镜纸．(5)孔雀绿染色液、蕃红染色液。三、操作步骤1、单染色法〔1〕涂片在干净无脂的载玻片中央滴一小滴无菌水〔图4－10a〕，用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜，涂布面积约1～1.5cm2〔图4－10b〕。〔2〕枯燥将涂片于室温中自然枯燥。〔3〕固定手执载片—端，使涂菌的一面向上，将载片经过微火2～3次。在火上固定时，用手摸涂片反面，以不烫手为宜。不能将载片在火上烤，否那么细菌形状毁坏(图4—10c)。〔4〕染色将涂片置于程度位置，滴加染色液覆盖于涂菌处，染色约2min(图4—10d)。〔5〕水洗倾去染色液，斜置载片，用自来水的细水流由载片上端流下，不得直接冲在涂菌处，直洗至从载片上流下的水中无染色液的颜色为止(图4—10e)。〔6〕枯燥自然晾干或用吸水纸悄然地吸干，留意不要擦掉菌体(图4—10f)。〔7〕待标本完全枯燥后，先用低倍镜和高倍镜察看，将典型部位移至视野中央，再用油镜察看。图4－10单染色方法〔二〕革兰氏染色法1、制片〔1〕涂菌用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环，用接种环在干净无脂的载玻片上做一薄而均匀、直径约1cm的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。〔2〕枯燥于空气中自然枯燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速枯燥(温度不宜过高)。〔3〕固定目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常用加热法，即将细菌涂片面向上，经过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。此制片可用于染色。2、染色〔1〕初染：于制片上滴加结晶紫染液，染1min后，用水洗去剩余染料。〔2〕滴加卢戈氏碘液，1min后水洗：〔3〕滴加95％乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止(根据涂片之厚薄需时30s至1min)。〔4〕复染滴加石炭酸复红液复染1min，水洗。〔5〕用滤纸吸干，油镜镜检。3、结果革兰氏阳性菌染成篮紫色，革兰氏阴性菌染成淡红色。4、检测未知菌用以上方法对未知面进展革兰氏染色，并绘图、记录染色结果。〔三〕荚膜染色法1．石炭酸复红染色(1)取培育了72h的褐球固氮菌制成涂片，自然枯燥(荚膜是多糖类物质，不可用火焰烘干)。(2)滴入1～2滴95％乙醇固定(不可加热固定)。(3)加石炭酸复红染液染色1～2min，水洗，自然枯燥。(4)在载玻片一端加一滴墨汁，另取一块边缘光滑的载玻片与墨汁接触，在以匀速推向另一端，涂成均匀的一薄层，自然枯燥。(5)枯燥后用油镜察看。菌体红色，荚膜无色，背景黑色。2．背景染色(1)先加1滴墨水于干净的玻片上，并挑少量褐球固氮菌与之充分混合均匀。(2)放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻压，吸收多余的菌液。(3)枯燥后用油镜察看。背景灰色，菌体较暗．在其周围呈现一亮堂的透明圈即荚膜。3．李夫森氏－硼酸钠美兰染色〔1〕取在阿须贝氏无氮培育基上培育3天的硅酸盐细菌少许，制成枯燥涂片(不要加热固定)。〔2〕加李夫森氏染色液染色l0min，倾之染液(勿用水洗)。〔3〕加硼酸钠美兰染色液染色5min，水洗，晾干。〔4〕油镜视察可见荚膜被染成红色，菌体处成蓝色。〔四〕鞭毛染色法1．方法一：〔1〕用接种环由培育18～20h的斜面上取假单胞菌菌体少许，用菌滴制片法检查细菌的运动性。假设菌体的运动性很强，那么可作鞭毛染色。〔2〕用3～4mL无菌水，将培育体洗下，移入另一无菌试管中，适温培育10min，再检查运动性。〔3〕用无菌吸管由悬液上部取一小滴，置于一清洁载玻片的一端，将玻片倾斜。使菌液由一端流向另外一端。于是在玻片上做成2～3条菌液带。待水膜自然枯燥〔切勿用火焰烘〕。〔4〕用刚刚过滤的鞭毛染色液A染色5min(不要加热)。〔5〕倾去A液，加鞭毛染色液B染色10min。用蒸馏水悄然冲洗，晾干。〔6〕用齐氏石炭酸复红染色2～3min。悄然冲洗，晾干(不能用吸水纸吸干)。〔7〕先用低倍镜，再用高倍镜，最后用油镜检查。2．方法二：〔1〕制涂片：先加少量无菌蒸馏水于凹载玻片的凹窝中．再从培育10h左右的斜面菌苔上取菌一环，轻放在凹窝水面上(不要搅动)，放30度温箱静置5～10min．取出，从凹窝水面上悄然取菌液一环，轻放在干净的载玻片上(不要涂抹)，放回温箱，让其自然枯燥(不要加热固定)。〔2〕染色：在自然枯燥的涂片上，滴加含石炭酸的鞭毛染色液一滴，染色5min，用水悄然冲洗，让其自然枯燥。〔3〕镜检：用油镜察看。五〕芽孢染色法1．方法一：(1)取37℃培育18～24h的枯草芽孢杆菌作涂片，并枯燥，固定。(2)于载片上滴人3～5滴5％孔雀绿水溶液。(3)用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开场计算时间约4～5min。加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。(4)倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。(5)用0.5％沙黄水溶液(或0.05％碱性复红)复染1min，水洗。(6)制片枯燥后用油镜察看。芽孢呈绿色，菌体红色。2．方法二：(1)加1～2滴自来水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2～3环培育18～24h的枯草芽孢杆菌菌苔于试管中，并充分均匀打散，制成浓稠的菌液。(2)加5％孔雀绿水溶液2～3滴于小试管中．用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。(3)将此试管浸干沸水浴(烧杯)中，加热15～20min。(4)用接种环从试管底部挑数环菌于干净的载玻片上，并涂成薄膜，将涂片经过微火3次固定。(5)水洗，至流出的水中无孔雀绿颜色为止。(6)加沙黄水溶液，染2～3min后，倾去染液，不用水洗。(7)枯燥后用油镜察看。芽孢绿色，菌体红色。四、本卷须知1．载玻片要干净无脂，否那么菌液涂不开。涂片时，滴水不要过多，挑菌量宜少，菌膜宜薄，切忌过厚。2．在染色过程中，不可使染液干涸。3．在革兰氏染色过程中脱色时间非常重要，过长，那么脱色过度，会使阳性菌被染成阴性菌，另外，老龄菌因体内核酸减少，会使阳性菌被染成阴性菌，故不能选用。3．

荚膜染色涂片不要用加热固定，以免荚膜伸展变形。4．

鞭毛染色液最好当日配置，次日运用那么鞭毛染色浅，察看效果差。染色时一定要充分洗净A液后再加B液，否那么背景不明晰。5．供芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使大部分芽孢仍保管在菌体上为宜。五、实验报告(一)绘图1．单染色后察看到的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形状图。2．大肠杆菌革兰氏染色视野图。3．金黄色葡萄球菌革兰氏染色视野图。4．褐球固氮菌菌体及荚膜的形状。4．绘出他所察看到的细菌的形状及鞭毛着生情况。6．枯草芽孢杆菌及宏大芽孢杆菌的菌体及芽孢形状，芽孢的着生位置。(二)单染色法操作要点。(三)记录革兰氏染色法法步骤，并进展结果分析。六、问题和思索1．涂片在染色前为什么要先进展固定?固定时应留意什么问题?2．制备染色装片时应留意哪些事项，为什么?制片为什么要完全枯燥后才干用油镜察看？3．什么是革兰氏染色法?染色过程应留意什么?4．试分析革兰氏染色法在细菌分类中的意义。5．组成荚膜的成分是什么?涂片普通用什么固定方法，为什么?6．鞭毛染色的菌种为什么要先延续传几代，并且要采用幼龄菌种?7．根据他的实验领会，哪些要素影响鞭毛染色的效果?如何控制?水中细菌总数往往同水体受有机物污染的程度呈正相关。因此，它是评价水质污染程度的—个重要目的之一。由于重金属及某些其它的有毒物质对细菌有杀灭或抑制造用，在总细菌数少的水样中并不能排除这些物质的污染。实验六水中细菌总数的检测本实验采用规范平皿法对水样中细菌作计数，这是测定水中好氧和兼性厌氧异养细菌密度的方法。由于细菌在水体个能以单独个体、成对、链状、成簇或成团的方式存在，此外没有单独的一种培育基或其一环境条件能满足—个水样中一切细菌的生理要求，所以由此法所得的菌落数实践上要低于被测水样中真正存在的活细菌的数目。细菌总数是指1mL水样在营养琼脂培育基中，37℃24h培育后所生长的菌落数。普通规定，1mL自来水的总菌数不得超越100个。一、目的和内容了解水中细菌总数的测定方法。二、资料和器皿(—)以下固体培育基1、营养琼脂培育基2．2216E培育基蛋白胨50g酵母膏1.0gFePO40.01g琼脂18.0g蒸馏水1000mLpH7.6~7.8(二)无菌采样瓶，灭菌移液管，灭菌培育皿，盛有4.5mL灭菌蒸馏水的试管。三、方法和步骤(一)采集水样，留意采集水样的代表性和数量，详见第2.9节。(二)汲取0.5mL水样(河水、污水、游泳池水或港湾水等)，注入盛有4.5mL无菌水的试管中，混匀成10-1稀释液，留意在吸水样前，水样及稀释水应彻底搅动均匀。(三)吸稀释液0.5ml按10倍稀释法稀释成10-2、10-3、10-4等延续的稀释度〔图4－11〕。(四)根据水样的干净程度，污染严重者选取10-2、10-3、10-4三个延续稀释度，中等的选取10-1、10-2、10-3三个延续稀释度。稀释度的选择是本实验准确度的关键，选择适宜者，平皿上菌落总数介于30和300之间。(五)汲取由高倍至低倍的稀释液，每个稀释液分别注入两个培育皿，每皿1mL。(六)注入彻底融化，然后冷却到45℃的营养琼脂培育基〔用于河水样〕或2216E培育基(用于海水、港湾水样)约15mL，立刻旋摇培育皿，充分混匀。方法是握住平皿，先往一个方向画圆，再朝相反方向回转；或一面画圆，一面适当倾斜。小心勿使这个混合液体溅到培育皿的边缘。让平皿培育基于程度位置放置至固化。(七)接种河水样的培育皿，倒置于37℃培育24h，接种海水样、港湾水样的培育皿，应倒置后于18~20℃下培育到长出明显菌落(5天左右)。四、结果与分析取同—稀释度的平板培育物，依菌落计算原那么进展计算。(一)菌落计算原那么平皿菌落的计算．可用肉眼察看，必要时用放大镜检查，防止脱漏，也可借助于菌落计数器计数。对那些看来类似，并且长得相当接近，但并不相触的菌落，只需它们之间的间隔至少相当于最小菌落的直径，便应该—一予以计数。对链状菌落．看来似乎是由于一团细菌在琼脂培育基和水样的混合中被崩解所致，应把这样的一条链当做一个菌落来计数，不可去数链上各个单—的菌链。假设同—个稀释度中一个平皿有较大片状菌落生长时，那么不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿计数该稀释度的平均菌落数。假设片状菌落少于平皿的一半时，而另—半中菌落分布又均匀，那么可将其菌落数的2倍作为全皿的数目。在记下各平皿菌落数后，应算出同一稀释度的平均菌数，供下—步计算时用。(二)计算方法l、首先选择平均菌落效在30～300者进展计算，当只需一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即可用它作为平均值乘其稀释倍数。2、假设有两个稀释度的平均菌落数都在30～300之间，那么应按两者的比值来决议。假设其比值小于2，应报告两者的平均数；假设大于2，那么报告其中较小的数字(见表4—l例2和例3)。3、假设一切稀释度的平均菌落数均大于300，那么应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表4—1例4)。4、假设一切稀释度的平均菌落数均小于30，那么应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表4—1例5)。5、假设全部稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，那么以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表4—l例6)。6、菌落计数的报告，菌落在100以内时按实有数报告；大于100时，采用二位有效数字；在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数也可用10的指数来表示，〔见表4—1的“报告方式〞栏〕。在所需报告的菌落数多至无法计算时，应注明水样的稀释倍数。表4－1稀释度选择及菌落报告方式例次不同稀释度的平均菌落数两个稀释度菌落数之比菌落总数〔个/mL〕报告方式〔个/mL〕10-110-210-31016420－1640016000或1.6×10422760295461.63775038000或3.8×10432890271602.22710027000或2.7×1044无法计数4651513－513000510000或5.1×105527115－270270或2.7×1026无法计数30512－3050031000或3.1×104图4－11菌液逐级稀释过程表示图五、实验报告1、论述细菌计数原那么。2、报告样品中细菌总数。六、问题与讨论微生物应思索哪些原那么？培育时，为什么要把已接种的培育基倒置保温培育？实验七水中大肠菌群(Coliformgroup)细菌的检测一、实验目的了解大肠菌群的检测方法。二、资料与器皿(—)培育基1、普通乳糖蛋白胨培育液蛋白胨10g牛肉膏3g乳糖5g氯化钠5g1.6％溴甲酚紫乙醇液1.0mL蒸馏水1000mLpH7.2~7.4将蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调理pH为7.2~7.4，再参与1.6％溴甲酚紫乙醇液1.0mL，充分混匀，分装于有杜汉氏小管的试管中，每管10mL，115℃灭菌20min。2、三倍浓缩乳糖蛋白胨培育液按上述普通乳糖蛋白胨培育液浓缩三倍配制，分装于有杜汉氏小管的试管中，每管5mL。3、品红亚硫酸钠培育基〔供平板分别用〕蛋白胨10g乳糖10gK2HPO43.5g琼脂15～20g蒸馏水1000mL无水亚硫酸钠5g左右5％的碱性品红乙醇溶液20mLpH7.2~7.44、伊红美蓝培育基〔EMB培育基〕〔供发酵法平板分别用，3和4可任选一种〕蛋白胨10g乳糖10gK2HPO42.0g琼脂20g蒸馏水1000mL2％伊红〔曙红〕水溶液20mL5％美蓝〔亚甲蓝〕水溶液13mLpH7.2~7.4(二)灭菌移液管、灭菌稀释水、试管、杜汉氏小管、革兰氏染色液、灭菌培育皿。三、方法与步骤(一)水样的采集供细菌学检验的水样，必需按普通无菌操作的根本要求采集，并保证再运送、储存过程中不受污染。水样从采集到检验不应超越4小时，在0～4℃下保管不应超越24小时，如不能在4小时内分析，应在检验报告上注明保管时间和条件。〔1〕自来水取样：应在水龙头翻开放水5分钟，再用无菌容器接取水样，待分析。如水样内含有余氯，那么采样瓶灭菌后按每500mL水样加3％Na2S2O3.5H2O溶液1mL。江、河、湖、池自然水体取样：可用采样器，采样瓶应先灭菌。采样后，瓶内应留有空隙。假设与其他化验工程结合取样，细菌学分析水样应采在其他样品之前。〔二〕初发酵实验水样稀释：制备水样10-1、10-2的稀释液，方法为用无菌移液管汲取水样10mL放于盛有90mL无菌水和假设干玻璃珠的锥形瓶中，充分振荡使混合均匀，并使其中的细菌尽量呈单个存在，即为10-1稀释液；再从10-1制备10-2稀释液。以此类推，稀释到所需倍数。

〔2〕接种和培育：以无菌操作于5支三倍浓缩培育基〔接种前一定应先检查杜汉氏小管内有无气泡〕中各参与水样10mL，5支普通培育基试管中参与水样1mL，5支普通培育基试管中参与10-1稀释液1mL，小心混匀放入37℃培育箱中培育24小时。此即5管法。〔3〕结果察看：37℃中培育24h后取出察看，察看有无气体〔杜汉氏小管内有无气体〕和酸产生〔培育基有无变色〕。在48h之间，培育管内倒置的杜汉氏小管内有任何量的气体积累，或培育基颜色从紫色变为黄色，便可初步断定为阳性反响。假设实验所测定的15支管中均为阳性反响，阐明浓水样污染严重，可将样品进一步稀释后，再按上述方法接种、培育和察看。(三)平板培育实验将初发酵实验中产酸产气的后只产酸或只产气的试管中的培育物用接种环取少许，划线接种在品红亚硫酸钠培育基或伊红美蓝培育基平板上，为了确保获得分别的单菌落，须留意以下事项：〔1〕划线间距至少相隔0.5厘米；〔2〕接种钉尖端要稍弯；〔3〕先对试管轻击并使之倾斜，以免接种针挑取到任何膜状物或浮渣；〔4〕划线时要用针尖的弯曲部分接触琼脂培育基平面．以免刮伤或戳破培育基。划线后培育皿倒置，于37℃培育18～24h。24h后，察看在平板上出现的单个菌落，其中心有深绿色金属光泽者为较典型的大肠菌群菌落。尽能够挑取典型的或接近典型的大肠菌群菌落，在营养琼脂斜面上划线，置37℃培育24h。挑取斜面培育物制成涂片，进展革兰氏染色，凡属革兰氏阴性杆菌，即确认了大肠菌群细菌的存在．(四)复发酵验证明验经上述经染色为革兰氏阴性的典型菌落，用接种环刮取部分接种于盛有乳糖培育基的试管中，在37℃培育24h，阳性反响者即确以为大肠菌群细菌。四、结果计算在初发酵实验中，能够有极少数能发酵乳糖产气的非大肠菌群细菌混在阳性可疑反响管中，经过对初发酵中的阳性可疑管进展平板和复发酵实验，并进展革兰氏染色和细菌形状的察看，可将那些少量的非大肠菌群细菌(“假阳性管〞)删除去，故在记录时只能把三步实验都呈阳性的试管计入阳性反响管。假设初发酵接种水样量为10mL、1mL、0.1mL，可直接查表4－2求出原水样100mL中大肠菌群指数〔MPN〕。假设接种水样量低于上述水样量，那么经下面的换算式计算。目前我国系以1L水样中的菌数为报告值，即为MPN×10。目前我国系以1L水样中的菌数为报告值，即为MPN×10。表4－2水样的总大肠菌群检索表出现阳性反响的试管数每100ml中的细菌的MPN出现阳性反响的试管数每100ml中的细菌的MPN10ml管中1ml管中0.1ml管中10ml管中1ml管中0.1ml管中000000000000012345024579000000222222012345467911130000001111110123452467911000000333333012345679111315000000444444012345891113151711111133333301234581012151719下略五、实验报告1、简述实验过程。2、计算实验结果。六、问题与思索实验过程中有什么问题，他以为缘由何在，如何抑制？实验八土壤及空气中微生物的检测土壤是微生物生活最适宜的环境、它具有微生物所需求为一切营养物质和微生物进展生长繁衍及生存的各种条件．所以土壤中微生物的数量和种类都很多。它们参与土壤的氮、碳、硫、磷等元素的循环作用。此外，土壤中微生物的活动对土壤构成、土壤肥力和作物消费都有非常重要的作用。因此，查明土壤中微生物的数量和组成情况，对开掘土壤微生物资源和对土壤微生物实行定向控制无疑是非常必要的。空气中没有可为微生物直接利用的营养物质和足够的水分，它不是微生物生长繁衍的天然环境，因此空气中没有固定的微生物种类。它主要经过土壤尘埃、小水滴、人和动物体表的于燥零落物、呼吸道的排泄物等方式被带人空气。由于微生物能产生各种休眠体，故可在空气中存活相当长的时期而不至死亡。空气中微生物的种类，主要为真菌和细菌。其数量那么取决于所处的环境和飞扬的尖埃量。实验目的学会土壤微生物的检测方法，了解土壤中微生物的数量和组成。了解一定环境空气中微生物的分布情况，学习并掌握检定和计数空气微生物的根本方法。二、资料和仪器(—)培育基〔详细配方见实验一〕肉膏蛋白胨琼脂培育基〔培育细菌〕高氏一号琼脂培育基〔培育放线菌〕查氏培育基〔培育霉菌〕(二)灭菌稀释水、灭菌吸管、灭菌培育皿。(三)土壤样品、天平、称旦纸。〔四〕恒温箱、气体流量计三、方法和步骤土壤微生物检测(1)土壤样品的延续稀释取新颖土壤样品1g，在酒精灯火焰旁加到一个装有99mL无菌水的锥形瓶中〔锥形瓶内装有几个玻璃珠〕，将锥形瓶依左右方向振荡数十次使土与水充分混合，将菌分散，即为10-2菌液。然后再按实验六的方法将菌悬液进一步稀释。不断稀释到适宜的稀释倍数〔使接种1mL菌液的培育皿平板上出现30～300个菌落。(2)根据样品中各种微生物的数量选择适宜的稀释度，每种选择三个稀释度，每个稀释度设两个反复。选择出适宜的稀释度后，用移液管将悬液1mL转移到培育皿中。〔3〕将已灭菌的培育基融化后冷却至45℃〔温度过高，培育皿盖上凝结水太多，菌易被冲掉；温度过低，那么培育基凝固，不易倒出〕。右手拿培育基，左手把皿盖翻开一小缝倾入培育基15～20mL，迅速盖皿盖，平放桌上，悄然旋转，使培育基和土壤悬浮液充分混匀，凝固后，制成平板，将培育皿倒置于培育箱中培育。〔4〕分别放线菌时，在制备平板前在培育基中参与5％的酚溶液2滴，以抑制细菌生长，于25～30℃培育箱中培育7～10天察看。霉菌分别，在制备平板前在培育基中参与80％的乳酸数滴，于25～30℃培育箱中培育3～4天察看。细菌在37℃培育24小时察看〔见图4－12〕图4－12细菌菌落形状。〔a〕肉眼察看的细菌菌落形状的多变性。菌落总体外形和边缘情况可由菌落上方俯视察看。而菌落高度那么由平板边缘程度察看。〔二〕空气中微生物的检测1、沉降法(1)将肉膏蛋白胨琼脂培育基、查氏琼脂培育基、高氏一号琼脂培育基溶化后，各倒四个平板。〔2〕将上述三种培育皿各取二个，在室外翻开皿盖，分别暴露于空气中5分钟、10分钟。另二个培育皿在实验室空气中分别暴露5分钟、10分钟。〔3〕肉膏蛋白胨平板于37℃，倒置培育1天；查氏琼脂平板和高氏一号琼脂平板倒置于28℃培营养别培育3～4天和7～10天后各自计算其菌落数，察看菌落形状、颜色。〔4〕计算每m3空气中微生物的数量。奥梅梁斯基曾建议：面积为100cm2的平板培育基，暴露在空气中5分钟相当于10升空气中的细菌数。计算公式如下：

2、筛孔采样法将四个细菌培育基平板和采样仪器带到受试环境，开启采样仪，调好空气流量，根据流量确定采样时间，关上电源。将细菌培育基平板放入采样器中，调好采样时间后立刻接通电源。到时后，取出平皿，并立刻盖好皿盖。将平板放于培育箱内37℃培育1天，察看计数平皿中的菌落数。根据下式计算1m3空气中细菌数。式中X为1m3空气中的细菌数；N为平皿上的平均菌落数；L为采样空气体积〔升〕。四、结果与分析土壤1、根据平皿上菌落数与平皿内土壤悬液的稀释倍数算得每g土壤中微生物的数量，本卷须知请参阅“水中细菌总数的检测〞实验。2、选择刚好能把细菌分开，而稀释倍数最低的平板〔普通含菌落30～300个〕计算每克土样中微生物的数量：按实验六表6－1报告样品微生物数量。3、填写表4-3。〔二〕空气根据沉降法，记录空气中微生物的种类和相对数量，填写表4-4，推算出1m3空气中细菌数。五、问题与讨论用稀释法进展微生物计数时，怎样保证准确并防止污染？为什么在霉菌计数时要参与几滴80％的乳酸？加在什么地方？为什么在放线菌计数时要参与5％的酚？加在什么地方？比较空气微生物检测两种方法的优缺陷。实验九微生物在自然界氮素循环中的作用在自然界中，生物所需求的各种化学元素，经过生物的生命活动，—方面被合成为有机物组成生物体；另一方面这些有机物质又被分解成无机物而前往自然界。如此组成了地球上物质的循环，微生物在自然界的物质循环中具有非常重要的作用。一、实验目的调查微生物在自然界氮素循环中的作用。二、资料与器皿(一)菌种：蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)普通变形菌(Proteusvulgaris)铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)(二)菜园土壤样品(三)培育基4％蛋白胨液体培育基亚硝酸盐生成培育基硝酸盐生成培育基硝酸盐培育基固氮菌培育基(四)试剂：萘氏试剂查氏试剂二苯胺试剂a－萘胺试剂对氨基苯磺酸试剂(五)器皿：培育皿、试管、锥形瓶、比色板三、方法与步骤(一)氨化作用以下述方式在5支4％的蛋白胨液体培育基试管中接种：接一环菜园土壤；接种蜡状芽孢杆菌；荧光假单孢菌；普通变形菌；不接种(对看管)。2、在30℃培育48h。3、检查各管中有无氨存在，方法为：在比色板的凹坑中加一滴萘氏试剂。然后用吸管吸一滴待测试管中的液体，假设呈黄色表示有氨存在。(二)硝化作用1、亚硝酸盐的生成①在亚硝酸生成培育基中接种0.1g土样(中性至微碱性)，在25℃培育。②培育一周后测试有无亚硝酸盐存在，方法是加三滴查氏试剂和一滴硫酸〔浓硫酸：水＝1：3〕至比色板凹坑中，再以吸管加一滴培育物，呈蓝黑色示有亚硝酸盐存在；③用萘氏试剂测试培育物中能否存在氨，假设有氨存在那么再培育一段时期，直至萘氏试剂反响呈阴性．亦即氨全部氧化成亚硝酸盐。2、硝酸盐生成①在硝酸盐生成培育基中接种0.1g土样，30℃培育。②每隔一周用查氏试剂测试培育物，直至亚硝酸盐实验反响是阴性(由于二苯胺试剂对硝酸盐和亚硝酸盐都呈阳性反响)。③在比色板凹坑中加一滴二苯胺试剂和二滴浓硫酸，然后再加一滴培育物，深蓝黑色表示硝酸盐的存在。(三)反硝化作用l、在一支放有杜汉氏小管的硝酸盐液体培育基中接种0.1g土样。另一管接种铜绿假单胞菌。2、在30℃培育15d以上。3、察看气体的产生。4、加1mlLa—萘胺试剂和1mL对氨基苯磺酸试剂至培育管中〔留意勿用口吸〕。在30s内呈红色示有硝酸盐存在。(四)自生固氮作用1、在—个含有一薄层自生固氮菌培育基的锥形瓶中，接种1g菜园土。在30℃培育数天。2、在外表有生长物产生时，对其进展染色，并在显微镜下检查粘性物质中能否有杆状或椭园形细胞。四、培育基及试剂的配制(一)亚硝酸盐生成培育基(NH4)2S042.0gK2HPO41.0gMgS040.5gFeS040.4gCaCO35.0~10.0g蒸馏水1000mL培育基不需灭菌(二)硝酸盐生成培育基NaNO31.0gK2HPO41.0gMgS040.3gNaCO31.0gNaCl0.4gFeS040.4g蒸馏水1000mL培育基可不灭菌〔三〕硝酸盐培育基蛋白胨5.0g牛肉膏3.0gKNO3，(或NaNO3)5.0g蒸馏水1000mLpH7.0(四)固氮菌培育基甘露糖醇15.0gK2HPO40.5gMgS040.2gCaSO40.1gNaCl0.2gCaCO35.0g琼脂18gpH8.3(五)萘氏试剂称45.5gHgI2和34．9gKI溶于500mL无氨蒸馏水中。(六)查氏试剂l、在含有4.0g淀粉的150mL水溶液中，不断搅拌并渐渐参与100mL煮沸的20％ZnCl2水溶液。继续加热使淀粉尽能够多地溶解．溶液应廓清。2、用水稀释并加2gKI。3、稀释至1L，过滤，盛于带塞的棕色瓶中备用。(七)二苯胺试剂二苯胺0.7g浓硫酸60.0mL水28.8mL浓盐酸11.3mL配制：将二苯胺溶于硫酸中，然后加水。缓慢冷却，再参与盐酸，放置过夜后备用。(八)a-萘胺试剂溶解0.6ga-萘胺于含1mL浓盐酸的蒸馏水中，然后稀释至100mL。贮于棕色瓶中放于冷处，备用。(九)对氨基苯磺酸试剂溶解0.6g对氨基苯磺酸于70mL沸蒸馏水中。冷却后加20mL浓盐酸。然后用水稀释至100mL，贮于棕色瓶中，保管于冷处，备用。五、结果与实验报告记录并解释结果。根据实验绘出氮循环图。六、问题与思索从实验结果论述微生物在自然界氮循环中的作用。实验十光合细菌的培育及其对高浓度有机废水的净化作用光合细菌是一大类具有光合色素，能在厌氧、光照条件下进展光协作用的原核生物的总称。光合细菌中的红螺菌科细菌，在光照厌氧或黑暗好氧条件下，都具有降解高浓度有机物的才干，它们既不象好氧的活性污泥微生物那样受污水中溶解氧浓度的限制，又不象严厉厌氧的甲烷细菌等对氧的存在非常敏感，即使生境中氧量添加，其降解有机物的活性也不受抑制，产生的菌体又可作为重要的资源加以利用。因此，这种适宜于处置高浓度有机废水的光合细菌处期法(简称PSB处置法)正引起人们的高度注重。目前PSB法已用于处置豆制品废水、浓质粪便水、羊毛洗涤废水、淀粉废水及抗生素发酵工业废水。实验目的进一步了解光合细菌的培育及其对高浓度有机废水的净化作用。二、资料与器皿(一)菌种球形红假单胞菌(Rhodopseudomonassphaeroides)沼泽红假单胞菌(R.palustris)(二)培育基M琼脂培育基(Molisch琼脂培育基)范尼尔氏液体培育基(vanNiel培育基)(三)厌氧培育缸(四)灭菌的具塞100mL锥形瓶、灭菌的具塞250mL锥形瓶、200mL烧杯、100mL量筒。(五)真空泵(六)焦性没食子酸、碳酸钠、石蜡三．方法与步骤(一)光合细菌的菌种培育1取球形红假单胞菌和沼泽红假单胞菌原种培育物，分别再M琼脂培育基琼脂柱中进展穿刺接种，每种接二支。2．把经过穿刺接种的试管，每种取一支，参与混合石蜡液〔由液体石蜡和固体石蜡1：1比例，加热后混合配制而成〕于试管顶部，作为与氧隔离的封盖，置于28℃下，在2000～5000lx的光照进展培育。3．另二支接种的试管．放入厌氧缸内，用焦性没食子酸和碳酸钠反响来吸氧，普通1g焦性没食子酸一个大气压下，具有吸收100mL空气中的氧气的才干，据此可推算出不同大小厌氧缸中吸氧剂的加量。立刻将厌氧缸缸盖紧闭，用真空泵抽气5min左右．使厌氧缸内空气减压至1／3左右。有条件的还可将过滤除菌的氮气或氩气充入厌氧缸内，使厌氧缸内呵斥个理想的厌氧坏境。4与石蜡封盖试管一样，置于28℃，光照培育4~5天，察看在沿穿刺线上长出鲜紫红色或桔红色的菌苔，即为己生长胜利，对两种方法的结果加以比较。5．在厌氧缸中的培育管琼脂顶部，参与1~2mL灭菌的液体石蜡．进展保种。(二)光合细菌的增殖培育1．用范尼尔液体培育基加至已灭菌的磨口具塞250mL锥形瓶内，使之接近瓶颈部。2．取上述穿刺培育的光合细菌菌种管，用接种环挑取部分培育物，转接入瓶内。每种菌各接一瓶，然后再用液体培育基加满至瓶颈口，小心用瓶盖悄然盖紧，使多余培育液溢出。留意加塞时不要使瓶内留有气泡。3将上述锥形瓶，在28℃、2000~5000lx光照下培育，逐日察看瓶内光合细菌生长情况和出现的颜色变化。4挑取菌种管中部分剩余的培育物，制成涂片，在简单染色后视察，比较两种菌株形状上的差别，并结合穿刺培育和液体培育上的特征，列表记录。(三)光合细菌对高浓度有机废水的降解作用1．取豆制品厂黄泔水〔或淀粉废水、抗生素发酵废水、羊毛洗涤废水等类高浓度有机废水〕80mL放入200mL烧杯内。2．把上述增殖培育好的球形红假单胞菌菌液(或沼泽红假单胞菌菌液)汲取80mL参与烧杯内，与废水充分搅匀相混、调整pH至7.2~7.5。3．取出混合液50mL测定其CODCr，BOD5，作为实验起始时的水质。4．将剩下的混合液加到灭菌的100mL具塞锥形瓶内，加至瓶颈口．盖上瓶塞，使余液溢出，留意勿使瓶内留有气泡。5.在28℃，光照培育至24h(或48h)后取出，测定瓶内混合液的CODCr和BOD5值，对照0h的CODCr和BOD5值．算得有机物的去除率。四、结果与分析将二株光合细菌菌株的形状、穿刺培育物和液体培育物特征以及对各种高浓度有机废水的净化效果列表比较。五、培育基配制(一)M琼脂培育基(Molisch琼脂培育)蛋白胨10g甘油(或糊精)5gMgSO40.5gKH2PO40.5gFeSO4痕量琼脂18gpH7.20.11Kpa灭菌15min(二)范尼尔氏液体培育基(vanNiel培育基)酵母膏1～2gNH4Cl1gMgCl20.2gK2HPO40.5gNaCl1gNaHCO35g蒸馏水1000mLpH中性如要高压灭菌，NaHCO3应另作抽滤除菌后添加。六、问题与思索光合细菌对高浓度有机废水的净化作用和其它细菌相比有什么优势？实验十一酚降解菌的分别及其性能的测定在工业废水的生物处置中，对污染成分单一的有毒废水常可选育特定的高效菌种进展处置。这些高效菌具有处置效率高、耐受毒性强等优点。本实验经过挑选酚分解微生物来掌握特定高效菌种的常规分别方法。挑选所得高效酚分解菌种除了具有较强的分解酚才干外．还必需能构成菌胶团，才干在活性污泥成生物膜中保管下来．实验目的1、了解菌胶团构成才干的鉴定方法。2、分别高效酚降解菌。二、资料和器皿(—)培育基营养肉汤液体培育基营养肉汤琼脂培育基尿素培育基蛋白胨培育基(二)测酚试剂及需用的仪器(三)摇床、恒温培育箱(四)250mL锥形瓶、玻璃珠及石英砂三、方法与步骤(一)采样为了获得酚分解才干较强的菌种，可在高浓度含酚废水流经的场所采样，如排放含酚废水下水道的污泥、沉渣等，在这些地方分得的微生物往往降解酚才干较强。为了获得既能降解酚、又有良好的构成菌胶团才干的微生物，也可在处置含酚废水的构筑物中取活性污泥或生物膜进展分别。(二)单菌株分别1．将上述采得样品，分别置于装有玻璃珠及石英砂的250mL无菌锥形瓶中，在摇床上振荡片刻．使样品分散、细化。2．分别以稀释平