肠道菌群通过胆碱能抗炎通路对脓毒症相关性脑病的作用及机制研究

肠道菌群通过胆碱能抗炎通路对脓毒症相关性脑病的作用及机制研究脓毒症是由微生物感染导致宿主炎症反应失衡而造成的器官功能障碍。在我国随着人口老龄化加剧、慢性病增多,脓毒症的发病率不断上升。脓毒症相关性脑病(Sepsis-associatedencephalopathy,SAE)是脓毒症最常见的并发症,由脑以外其他部位感染引起的继发性脑功能损伤,其临床表现为急剧恶化的精神状态,如谵妄、抑郁、甚至昏迷。大量临床研究表明,SAE导致脓毒症患者死亡率增加,即使幸存的患者,因脑功能损伤,仍可长期存在认知功能和情感障碍等,使患者无法回归正常的生活及工作,增加家庭和社会的负担。因此研究如何预防、改善、治疗脓毒症相关性脑病有重要的社会意义。有研究表明,肠道菌群可通过调控神经系统的生长发育、凋亡、免疫、代谢、血脑屏障等影响脑功能。胆碱能抗炎通路是肠道菌群对脑功能产生影响的重要途径之一,即菌-肠-脑轴。胆碱能抗炎通路在外周组织及中枢神经系统中有重要的调节炎症反应的作用,中枢胆碱系统的功能与大脑觉醒、学习记忆、睡眠、感觉运动等高级功能密切相关。过度炎症反应是发生SAE的机制之一,现有研究表明电刺激胆碱能神经可通过抑制炎症反应,降低脓毒症相关性脑病的发生。肠道菌群是否通过迷走神经影响脓毒症相关性脑病,目前尚无相关研究。同时,迷走神经对脑功能产生影响的分子机制,目前亦不清楚。研究表明,SIRT6蛋白可通过对组蛋白和非组蛋白去乙酰化而发挥调控炎症反应的作用。SIRT6在人和鼠的多种组织中都有表达,尤其是在脑海马组织有较高表达。研究证实,阿兹海默症患者血液样本中SIRT6含量明显减少,炎症介质TNF-α等表达增加,影响患者的认知能力和身体机能。另有研究表明,在其它由慢性炎症反应引起的神经退化性疾病中,SIRT6蛋白含量也明显减少。胆碱能抗炎通路可能通过NF-κB信号通路影响炎症介质的释放。SIRT6与胆碱能抗炎通路均可通过NF-κB途径调控炎症反应,二者在由炎症反应引起的脑病中均发挥重要作用。而胆碱能抗炎通路是否可通过调节海马组织中SIRT6水平影响SAE,需要进一步研究。因此,了解脓毒症患者肠道菌群特征性改变,探讨肠道菌群对脓毒症相关性脑病的作用途径及机制,对脓毒症相关性脑病的研究具有重要的意义。本研究通过构建大鼠脓毒症相关性脑病动物模型,采用16SrDNA高通量测序技术、行为学评分、水迷宫实验、Westernblot、免疫组化等方法,了解脓毒症大鼠的肠道菌群特征及其对脑功能的影响,探讨胆碱能抗炎通路是否为肠道菌群影响脓毒症相关性脑病的主要通路,明确胆碱能抗炎通路是否可通过调节海马组织中SIRT6水平影响SAE,从而为SAE的诊疗提供理论依据。第一部分脓毒症患者及大鼠的肠道菌群特征及其对脑功能的影响目的探讨脓毒症患者及大鼠的肠道菌群变化及其对脓毒症相关性脑病的影响。方法1.采用前瞻性对照研究的方法,选取2016.6-2017.10就诊于河北省人民医院急诊科的72例脓毒症患者,根据有无脓毒症相关性脑病,分为脓毒症相关性脑病组(SAE组),脓毒症无脑病组(SEP组),健康10人为对照组(CON组),2组患者均于诊断后7d采集粪便标本,对照组随机留取粪便标本。采用16SrDNA高通量基因测序技术分析3组脓毒症患者肠道菌群的特点;记录并分析脑电图结果。2.将成年雄性SD大鼠随机分为对照组(CON组)、脓毒症模型组(LPS组)。根据大鼠的行为学、脑电图、体感诱发电位将模型组又分为单纯脓毒症组(SEP)和脓毒症相关性脑病组(SAE组)。3组(CON组、SEP组、SAE组)大鼠于制模后7d采集大鼠的粪便标本,采用16SrDNA高通量基因测序技术分析脓毒症大鼠肠道菌群的特点;记录并分析大鼠的脑电图及水迷宫实验结果;采用ELISA法检测大鼠海马组织中炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-10)的表达;HE染色观察海马组织结构。结果1.脓毒症患者结果:1.1肠道菌群的比较:(1)SAE组大鼠肠道菌群α多样性指数较CON组降低(P<0.05);(2)基于属水平比较:SAE患者肠道内另枝菌属(Alistipes)丰度[CON(2.9±1.3)%vsSEP(5.4±1.8)%vsSAE(3.3±1.7)%,P<0.05)显著升高,而普拉梭菌属(Faecalibacterium)丰度[(CON2.2±1.5)%vsSEP(5.2±1.6)%vsSAE(3.6±1.5)%,P>0.05]显著降低。1.2脑电图比较:与CON组相比,SAE组诊断后7d脑电图δ波百分比明显增加[(17.31±0.72)%vs(10.12±0.49)%],P<0.01。与SAE组比较,SEP组诊断后7d脑电图δ波百分比均明显减少[(12.25±0.14)%vs(17.31±0.72)%],P<0.01。2.脓毒症大鼠结果:2.1肠道菌群的比较:(1)SAE组大鼠肠道菌群α多样性指数较CON组降低(P<0.05);(2)SAE大鼠肠道菌群中有17个OTUs丰度增高;(3)SAE组与CON组相比:基于门水平,大鼠肠道菌群中厚壁菌门(Firmicutes)比例显著降低(P<0.05),Proteobacteria和Bacteroidetes比例明显升高(P<0.05);基于科水平,大鼠肠道菌群中Acidaminococcaceae、Fusobacteriaceae、Enterbacteriaceca、Porphymonadaceae、Streptococcaceae和Rikenellaceae细菌比例显著升高(P<0.05),而Bacteroidaceae、Erysipelotrichaceae、Lachnospiraceae、Prevotellaceae、Ruminococcaceae、Bifidobacteriaceae和Veillonellaceae显著降低(P<0.05);基于属水平,大鼠肠道内另枝菌属Alistipes比例显著升高(P<0.05),而梭菌属Faecalibacterium明显降低(P<0.05)。2.2SAE组海马组织中炎症介质TNF-α、IL-6的表达较CON组显著增加(P<0.05),IL-10显著降低(P<0.05)。2.3水迷宫实验结果表明,SAE组大鼠总泳程、时间、通过目的象限的频率均显著降低(P<0.05)。2.4光镜下海马组织HE染色中可见SAE组大鼠胶质细胞及神经元失去正常的形态和结构。小结1.随着脓毒症的发生,人群及大鼠肠道菌群的构成产生特异性改变;在属水平,另枝菌属Alistipes比例显著升高,而梭菌属Faecalibacterium明显降低;2.肠道菌群改变的脓毒症人群及大鼠脑功能减退。第二部分肠道菌群通过胆碱能抗炎通路对脓毒症相关性脑病的影响目的探讨胆碱能抗炎通路是否为肠道菌群影响脓毒症相关性脑病的主要通路。方法将成年雄性SD大鼠随机分为:对照组(SHAM)、脓毒症模型组(LPS)、脓毒症+肠道菌群移植组(LPS+FMT)、脓毒症+肠道菌群移植+迷走神经切断组(LPS+FMT+VGX)。于制模后7d采集大鼠粪便,采用16SrDNA高通量基因测序技术分析肠道菌群的特点;记录并分析脑电图及水迷宫实验结果,采用免疫组化法检测Iba-1的表达,ELISA法检测海马组织中炎症介质TNF-α、IL-6、IL-10的表达。结果1.肠道菌群的比较:(1)LPS组肠道菌群α多样性指数较SHAM组降低(P<0.05),而LPS+FMT、LPS+FMT+VGX组大鼠肠道菌群α多样性指数较SHAM组无显著差异(P>0.05);(2)与SHAM组比较:基于门水平,与SHAM组相比,LPS组肠道菌群构成发生了明显改变(P<0.05),表现为Proteobacteria的丰度显著增高(SHAM组10.5%,LPS组78.3%),Firmicutes的丰度显著降低(SHAM组85.4%,LPS组19.3%),Bacteroidetes数量下降(SHAM组2.7%,1.3%LPS组),而二者的Actinobacteria无明显差异。SHAM组与LPS+FMT组、LPS+FMT+VGX组相比,肠道菌群构成无明显差异(P>0.05)。Firmicutes(SHAM组85.4%,LPS+FM组80.5%,LPS+FMT+VGX组82.3%)。Bacteroidetes(SHAM组2.7%,LPS+FMT组2.6%,LPS+FMT+VGX组2.8%)。Proteobacteria(SHAM组10.5%,LPS+FMT组6.8%,LPS+FMT+VGX组15.6%)。与SHAM组比较,LPS组Firmicutes与Proteobacteria的丰度比值明显降低(7.9vs0.8,P<0.05),而SHAM组与LPS+FMT、LPS+FMT+VGX组相比,Firmicutes与Proteobacteria的丰度比值没有明显差别;与SHAM组比较,LPS组Firmicutes与Bacteroidetes的比值明显降低(29.6vs11.7,P<0.05),而SHAM组与LPS+FMT组、LPS+FMT+VGX相比,厚壁菌门与拟杆菌门的比值没有明显差别;与SHAM组比较:基于属水平,LPS组有10个属丰度存在差异(P<0.05),Alistipes、Staphylococcusaureus及Pseudomonas属显著升高;Faecalibacterium、Bifidobacterium和Lactobacillus显著降低(P<0.05),其中Alistipes[(SHAM0.65±0.12)%vsLPS(1.48±0.76)%,P>0.05],Faecalibacterium[(SHAM4.45±0.96)%vsLPS(2.41±0.69)%,P>0.05]。而LPS+FMT、LPS+FMT+VGX组肠道菌群属水平丰度无显著差异(P>0.05)。2.水迷宫实验结果显示,LPS和LPS+FMT+VGX组分别与SHAM和LPS+FMT组相比,大鼠总泳程、总时间、通过目的象限的频率均显著降低(P<0.05),而LPS+FMT组较SHAM组无明显差异(P>0.05)。3.与LPS+FMT和SHAM组相比,LPS组和LPS+FMT+VGX组大鼠海马组织中Iba-1及a7nAchR含量显著升高(P<0.05),而LPS+FMT组较SHAM组Iba-1及a7nAchR含量无明显升高(P>0.05)。4.分别与LPS+FMT和SHAM组相比,LPS组和LPS+FMT+VGX组大鼠海马组织中TNF-α、IL-6、IL-1β表达均显著升高(P<0.05),而在LPS+FMT和SHAM组中表达无显著升高(P>0.05)。5.脑电图分析,LPS组与LPS+FMT+VGX组较SHAM组大鼠α波下降,δ波增加(P<0.05),而LPS+FMT组大鼠各脑电波形构成比均无显著差异(P>0.05)。小结1.LPS大鼠肠道菌群在属水平,另枝菌属Alistipes比例显著升高,而梭菌属Faecalibacterium明显降低;2.通过肠道菌群移植,可重建LPS大鼠肠道菌群的结构,减轻脓毒症相关性脑病的程度,脓毒症时发生改变的特异菌群,如另枝菌属(Alistipes)、梭菌属(Faecalibacterium),可能对脓毒症相关性脑病有特异调节作用,其对脑病的影响,需进一步研究。3.肠道菌群可通过胆碱能抗炎通路影响脓毒症相关性脑病的发生。第三部分胆碱能抗炎通路通过海马组织中SIRT6影响脓毒症相关性脑病发生的机制研究目的探讨胆碱能抗炎通路影响脓毒症相关性脑病发生的机制。方法将成年雄性SD大鼠随机分为:对照组(SHA)、脓毒症模型组(LPS)、脓毒症+迷走神经刺激组(LPS+VNS)、脓毒症+迷走神经切断组(LPS+VGX)、脓毒症+淫羊藿苷组(LPS+ICA)。于制模后7d观察大鼠一般情况,做行为学评分,采用免疫组化法检测海马中SIRT6的表达,Westernblot法检测大鼠海马组织Iba-1、SIRT6、α7nAChR表达,ELISA法检测海马组织中炎症介质TNF-α、IL-6、IL-10的表达。结果1.LPS组和LPS+VGX组分别与LPS+VNS、LPS+ICA和SHA组相比,大鼠海马组织中SIRT6、α7nAchR表达显著降低(P<0.05),而LPS+VNS、LPS+ICA和SHA组比较无显著差异(P>0.05)。2.LPS组与LPS+VGX组分别与LPS+VNS、LPS+ICA和SHA组相比,大鼠海马组织中Iba-1表达显著升高(P<0.05),而LPS+VNS、LPS+ICA和SHA组比较无显著差异(P>0.05)。3.LPS+VNS、LPS+ICA和SHA组分别与LPS组与LPS+VGX组比较,海马组织中炎症介质TNF-α、IL-6的表达显著增加(P<0.05),IL-10显著降低(P<0.05)。小结胆碱能抗炎通路调