发酵分析-凝胶电泳

课堂练习薄层层析用硅胶，有硅胶G、硅胶H、硅胶GF254、硅胶HF360等不同标号，它们分别表示什么含义？化合物A在薄层板上从原点迁移7.6cm，溶剂前沿距原点距离16.2cm：（1）计算化合物A的Rf值。（2）在相同的薄层系统中，溶剂前沿距原点距离14.3cm，化合物A的斑点应在此薄层板上的何处？现有两种性质相似的组分A和B，共存同一溶液中，用薄层色谱分离时，它们的比移值分别是0.45，0.63。欲使分离后两斑点中心间的距离为2cm，此薄板应为多长？0.476.72cm12/28/20231电泳带电粒子在电场力作用下向着所带电荷相反的方向泳动的现象叫电泳。凝胶电泳电泳的用途？12/28/20232聚丙烯酰胺凝胶电泳（PolyacrylamideGelElectrophoresis，PAGE）12/28/20233原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N,N-methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N

，N

—四甲基乙二胺(N，N，N

，N-tetramethyl

ethylenediamine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammoniumpersulfate(NH4)2S2O8，简称AP)或核黄素(ribofavin即vitaminB2，C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，简称PAGE)。12/28/20234丙烯酰胺N,N’-甲叉双丙烯酰胺12/28/20235凝胶的化学结构由丙烯酰胺单体聚合成长链，长链之间用N,N-甲叉双丙烯酰胺交联成多孔状结构。孔的大小可以用双丙烯酰胺的浓度来调节。浓度增大，网状结构的空隙（孔径）减小。形

成

凝

胶

的

反

应

式12/28/20236C=2.6%C=5%凝胶浓度/T%分子量范围/kDa凝胶浓度/T%分子量范围/kDa530~200560~7001015~1001022~2801510~501510~200202~15205~150聚丙烯酰胺凝胶浓度与蛋白质分子量的关系C：Bis占两者的百分含量（交联度）T：Acr和Bis在凝胶中的总浓度12/28/20237PAGE分离蛋白质的依据

不同的蛋白质分子，由于其侧链可解离基团的种类和数量、分子质量、空间三维结构都有所不同，所以：等电点（pI）不同，同一pH条件，所带电荷种类、数量不同大小、形状不同12/28/20238蛋白质分子在电场中的泳动速度常常用迁移率来表示定义：蛋白质分子在单位电场强度下的泳动速度

m==

V=迁移速度；E=电场强度；η=介质粘度在同一介质中电泳，m只与蛋白分子自身大小和形状（r）、所带电荷数量（Q）相关利用蛋白质混合物中各蛋白的迁移率不同（蛋白性质差异造成），而达到分离的效果V—E

6πrη_____

Q迁移率12/28/202396种蛋白质混合物的电泳结果图12/28/202310影响蛋白质电泳速度的外在因素溶液pH

决定蛋白质所带电荷的电性和电量

溶液的离子强度

越低，迁移越快；一般应在0.01~0.2mol/L之间电场强度电渗现象电泳支持介质温度12/28/202311影响蛋白质电泳速度的内在因素蛋白质分子所带电荷的电性和电量电性决定电泳方向；电量越大，迁移速度越快蛋白质分子的大小和形状分子质量越小、形状越接近球形，在电场中迁移速度越快12/28/202312SDS1967年由Shapiro建立。1969年由Weber和Osborn进一步完善。

他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂（SDS）以后,蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小,电荷因素可以忽视。12/28/20231312/28/202314--------------------------------------12/28/202315SDS是变性剂，它能破裂蛋白质分子中的氢键和疏水作用，去多肽折叠。巯基乙醇或DTT是还原剂，能打开二硫键，因此使蛋白质分子处于伸展状态。此时SDS以其烃链与蛋白质分子的侧链结合成复合物，大约每两个氨基酸残基结合一个SDS分子。基本原理12/28/20231612/28/202317

当蛋白质的分子量在15000～200000之间时，蛋白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对数呈线性关系，符合下列方程：常数斜率迁移率通过已知分子量的蛋白与未知蛋白的比较，就可以得出未知蛋白的分子量。12/28/202318

电泳过程中分子迁移的规律，小分子在前，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。

不同分子量的蛋白质在凝胶中运动示意图混合样品带孔胶

按分子大小分离电泳方向

电泳

小分子大分子12/28/20231912/28/202320SDS分类

SDS按照缓冲液pH值和凝胶孔径差异分为连续系统和不连续系统两大类：连续系统：由电极缓冲液和分离胶组成。电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统：由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度均不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。12/28/202321聚丙烯酰胺凝胶电泳常用的是平板电泳仪。装置见下图连续(a)与不连续(b)平板凝胶电泳示意图12/28/202322

电泳仪

12/28/202323垂直板式电泳槽平板式电泳槽转移电泳槽双向电泳槽12/28/202324垂直柱式电泳槽（盘状电泳槽）12/28/20232512/28/202326凝胶干燥器12/28/202327凝胶成像系统12/28/202328SDS－PAGE测定蛋白质相对分子质量12/28/202329实验过程凝胶制备样品处理与加样电泳剥胶与固定染色与脱色安装电泳槽12/28/202330实验过程流程图12/28/202331考马斯亮蓝G-250染料酸性溶液中与蛋白质疏水区结合465nm棕红色蓝色595nm考马斯亮蓝染色法在酸性条件下，蛋白质与考马斯亮兰R-250结合形成蓝色复合物（595nm处最大吸收峰），蓝色的深浅与蛋白质浓度成正比关系12/28/202332银染法原理：银染时蛋白条带上的AgNO3被还原成金属Ag，沉积在蛋白条带上而显色显色方法分为化学显色和光显色灵敏度达2ng/条带12/28/202333结果分析相对迁移率的计算

相对迁移率mR=蛋白质样品距加样端迁移距离(cm)溴酚蓝区带中心距加样端距离(cm)标准蛋白在SDS-凝胶上的示意图12/28/202334标准曲线的绘制

以每条Marker带的相对迁移率为横坐标，相应分子量的对数值为纵坐标，绘制标准曲线。分子量相对迁移率12/28/202335未知蛋白质样品分子量的测算

计算未知蛋白质样品的相对迁移率，在标准曲线上找到对应的纵坐标，即可得该样品的分子量。12/28/202336等电聚焦电泳IsoelectricFocusingElectrophoresis，IEF12/28/202337等电聚焦等电聚焦（IEF)

：利用一种特殊的缓冲液（两性电解质）在聚丙烯酰胺凝胶上制造一个pH梯度，电泳时，蛋白迁移到其等电点就不带电荷而停止电泳，通过该方法分离蛋白的方法。12/28/202338蛋白质分子在不同pH下的解离状态

NH3+NH3+NH2PPPCOOHCOO-COO-

pH＜pIpH＝pIpH＞pI

12/28/202339等电聚焦电泳（IEF）原理利用不同蛋白质的等电点的不同而使其在pH梯度中相互分离的一种电泳技术等电聚焦过程中，蛋白质分子在一个连续而稳定的线性pH梯度中电泳，结果导致每种蛋白质分子迁移到等于其pI的pH处（此时蛋白质分子的净电荷为零），最终聚集形成一个很窄的蛋白区带

12/28/202340+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH1012/28/20234112/28/202342pH梯度的形成

载体两性电解质是一系列不同分子的两性电解质的混合物,在通电后，它们各自迁移到适当位置形成一个连续的pH梯度。

12/28/202343Ampholyte化学结构式Pharmalyte化学结构式常用的两种载体两性电解质12/28/202344

没通电时的变化所有的载体两性电解质分子都荷电，只是溶液中荷正电和荷负电的基团数目相等，净电荷为零。12/28/202345引入电场时的变化12/28/202346电泳结束后的变化12/28/20234712/28/202348等点聚焦电泳的应用

1.分析分离制备蛋白质、多肽①区分人血清蛋白②测出异常免疫球蛋白③基因分型④csf中寡克隆区带的检测2.测定pI可鉴定蛋白质、多肽12/28/202349一、蛋白质组学产生背景1.20世纪中后期，生命科学研究进入了分子生物学时代。随着人类基因组全序列测定，生命科学跨入了后基因组时代。2.因mRNA的表达情况不能直接反应蛋白质的表达水平。3.蛋白质有自身特有的活动规律，如动态修饰、加工、转运定位、结构形成、代谢等，均无法从基因组水平上的研究获知。蛋白质构象更难于只靠DNA序列来解释。4.蛋白质才能动态反映生物系统所处的状态。20世纪90年代中期，国际上萌发了蛋白质组学。蛋白质组学和双向电泳技术12/28/202350HumanProteomeOrganization,HUPO蛋白质组：阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式，其内容包括鉴定蛋白质的存在方式（修饰形式），研究其结构、功能、定量和相互作用等12/28/202351蛋白质组研究策略蛋白质1蛋白质2蛋白质3。。。组织、细胞等蛋白质分离双向凝胶电泳分离色谱分离切取蛋白条带或蛋白点蛋白混合物多肽混合物MS/MS数据库比对酶解质谱鉴定12/28/202352目前唯一能分离上千种蛋白的技术蛋白质分离首选技术：

双向凝胶电泳技术小鼠肝细胞细胞系K562人肾脏细胞12/28/202353双向电泳（2-dimensionElectrophoresis，2-DE）是样品经第一向电泳后，再在垂直方向上进行第二向其他类型电泳的电泳方式。目前的双向电泳一般是：第一向为等电聚焦（IEF），第二向为SDS2-DE使得分离分辨率大大提高，获得的信息也明显增多，是目前电泳技术中分辨率最高、信息获得最多的技术，常用于分析复杂样品及绘制蛋白质组图谱，是蛋白质组学研究的核心技术12/28/20235412/28/202355二维电泳基本操作流程样品准备等电聚焦（IEF,第一维）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS,第二维)染色图像分析质谱分析数据库分析，鉴定蛋白12/28/202356考染法银染法荧光染料法放射自显影染色12/28/202357凝胶的图像处理分析和典型流程凝胶图像的扫描图像加工斑点检测和定量凝胶配比数据分析数据呈递和解释2-DE数据库的建立12/28/20235812/28/202359相对迁移率相对分子量对数12/28/2023606种蛋白质混合物的电泳结果图12/28/202361琼脂糖凝胶电泳带有电荷的DNA或RNA核苷酸链，依靠无反应活性的稳定的介质—琼脂糖凝胶和缓冲液，根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同，可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。负在电场中以一定的迁移率从负极移向正极12/28/20236212/28/202363天然琼脂（agar）:又名琼胶、菜燕、冻粉，从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。12/28/202364

琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。

D-半乳糖3，6-脱水-L-半乳糖12/28/20236512/28/202366琼脂糖凝胶的特点

（一）优点1.因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗2.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。3.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒等大分子物质。4.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸