丙泊酚预处理对肝脏缺血再灌注损伤的作用及机制研究

丙泊酚预处理对肝脏缺血再灌注损伤的作用及机制研究[研究目的]探索丙泊酚用于预防肝脏缺血再灌注损伤的可行性及其机制,探索一种新型有效副作用小的肝脏缺血再灌注损伤保护药物。临床肝脏手术常需要暂时阻断肝脏供血,当供血恢复,大量自由基生成及脂质过氧化等病理过程导致的肝脏I/R损伤是肝脏外科手术和肝脏移植术中面临的一个亟待解决的问题。肝脏I/R损伤是导致肝移植失败及多器官衰竭的主要原因之一,它是由于肝脏短暂缺血后恢复血流供应,大量有毒代谢产物及炎性介质释放导致严重的代谢紊乱,从而加重肝脏损伤及功能障碍的过程。肝脏I/R损伤是多种机制共同作用的结果,与ROS产生、炎症反应及细胞凋亡等机制密切相关。因此,合理选择用药,干预自由基产生、抑制炎症反应及细胞凋亡或可减轻肝脏I/R损伤。丙泊酚是临床常用静脉麻醉药物,因其化学结构与维生素E相似,被报道具有广泛的抗氧化、抗炎及抗凋亡的效应。大量文献报道,丙泊酚预处理能通过多种分子机制,作用于多条信号通路而有效减轻1/R诱导的多器官损伤。然而,尽管有少数文献报道,丙泊酚在肝脏I/R损伤中的作用及其确切机制尚不明确,其保护效应尚缺乏临床试验佐证。基于此,本研究在前期文献报道的基础上,结合体外实验、动物及临床试验,系统性的研究丙泊酚肝脏I/R损伤的保护效应,并初步探讨其机制。[研究方法]1.丙泊酚预处理对缺氧/再灌注肝细胞的保护效应及机制研究人体外培养肝细胞HL-7702分为对照组、I/R组(缺氧8h后恢复供氧培养建立I/R损伤模型)、丙泊酚组(细胞缺氧操作前30min加入不同浓度丙泊酚5、10、20、40μmol/L);观测细胞恢复供氧后加入不同浓度丙泊酚及丙泊酚预处理后24h细胞变化情况:MTT法研究细胞增殖活性;Annexin-V/PI双染流式细胞技术测定细胞凋亡,WesternBlot检测凋亡相关蛋白Caspase-3及Bcl-2的表达;JC-1荧光探针及细胞ATP含量测定评价细胞线粒体结构及功能的损伤;采用试剂盒及生化分析仪检测细胞裂解产物氨基转移酶评价肝细胞功能;测定细胞裂解产物SOD、MDA、CAT水平评价细胞抗氧化水平。2.丙泊酚对大鼠肝脏缺血/再灌注损伤的作用及机制研究Wistar大鼠平均分为对照组(n=10)、假手术(n=10,行剖腹手术)、I/R组(n=10,腹腔手术,肝脏血管夹闭90min后恢复供血,建立肝脏I/R损伤模型)、丙泊酚组(n=10,I/R建模前30分钟给予50mg/kg丙泊酚腹腔内注射)。其中对照组大鼠不做任何处理。假手术组大鼠注射戊巴比妥麻醉后,在无菌条件下进行剖腹手术,而后常规关闭腹腔。I/R组大鼠麻醉后,无菌条件下行剖腹术,用无创动脉夹夹闭肝左叶与中叶血管,同时保留肝右叶与尾状叶的血管、门静脉及胆总管,造成约70%的血管阻塞,待缺血区肝叶颜色由鲜红色变为暗红色,表明肝脏缺血模型成功,持续夹闭约90min。而后取下无创动脉夹,恢复肝脏血流。6h后在无菌条件下进行大鼠腹部缝合。丙泊酚组大鼠则按照50mg/kg腹腔内注射丙泊酚,30分钟后立即进行无创动脉夹夹闭肝左叶与中叶血管,同时保留肝右叶与尾状叶的血管、门静脉及胆总管,其余操作同I/R组。24h后测定大鼠血清AST、ALT、ALB(白蛋白)及TBIL(总胆红素)水平,评价大鼠肝脏功能;肝组织切片H&E染色及电镜观察肝脏组织损伤程度;取大鼠肝脏组织匀浆,测定MDA、SOD、CAT浓度评价大鼠抗氧化水平;检测肝脏组织ATP含量,评价大鼠能量代谢水平;测定肝组织匀浆中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-10及TGF-β的浓度,研究大鼠肝脏炎症反应;TUNEL染色、WesternBlot测定凋亡相关蛋白的表达,检测肝脏组织细胞凋亡情况。3.丙泊酚对肝移植患者缺血再灌注损伤的影响研究选取山东大学山东省立医院肝胆外科2017年5月-2018年5月行肝脏移植术患者共42例,其中术中肝脏缺血前予以丙泊酚处理的患者18例(PPC),未进行丙泊酚处理的患者24例。再灌注后3h取移植肝组织,H&E染色观察肝脏病理;于术前及术后不同时间点检测患者血清氨基转移酶、总凝血酶原时间(PT)及总胆红素(TBIL)水平,评价患者肝功能;检测血清MDA及H202水平,评价患者氧化应激水平。[结果]1.观测丙泊酚预处理对细胞的影响,结果显示细胞缺氧8h再恢复供氧培养24h后,其增殖活性显著低于对照组(分别约降低17%),提示缺氧/再灌注能显著抑制体外培养肝细胞的增殖活性。不同浓度(5、10、20、40(μmol/L)的丙泊酚预处理也显著提高缺氧/再灌注诱导的HL-7702细胞增殖活性的降低(约提高10%-17%,p<0.05)。机制上发现,丙泊酚通过抑制促凋亡蛋白Caspase-3的表达并促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,一定程度减轻缺氧/再灌注诱导的细胞凋亡(细胞总凋亡率约降低3%,p>0.05)。丙泊酚预处理能显著逆转缺氧/再灌注诱导的肝细胞线粒体膜电位的下降(p<0.01),促进ATP生成(与I/R组比较提高2-3.5倍,p<0.05),呈现明显的剂量依赖性。短暂缺氧/再灌注能显著提高HL-7702细胞ALT(1.8倍)及AST水平(1.47倍,p<0.01),而不同浓度丙泊酚预处理能有效降低缺氧/再灌注细胞裂解液AST及ALT浓度,具有明显的剂量依赖性(p<0.05)。缺氧/再灌注能加重肝细胞脂质过氧化的程度(MDA水平约升高2.7倍,p<0.001),下调抗氧化酶SOD(2.1倍)及CAT(2.3倍)的水平,而不同浓度丙泊酚预处理能有效逆转缺氧/再灌注引起的细胞抗氧化水平的下降(p<0.05)。2.肝脏I/R处理能显著诱导大鼠血清ALT及AST水平的升高(分别约升高5.1倍及2.6倍,p<0.001),手术前腹腔注射丙泊酚能显著降低I/R诱导的血清ALT及AST水平的升高(与I/R组比较,分别约降低1.6倍及1.7倍,p<0.01),降低大鼠血清ALB水平(约降低30%,p<0.01)并促进大鼠血清TBIL水平的升高(约升高1.67倍,p<0.01),而丙泊酚能有效逆转肝脏I/R诱导的大鼠肝功能障碍(p<0.05)。H&E染色及电镜显示丙泊酚预处理可减轻由缺血再灌注导致的肝脏组织受损程度。I/R处理加重肝脏组织内部的脂质过氧化程度(MDA升高1.87倍,p<0.01),抑制SOD及CAT水平(分别约降低1.67及2.9倍,p<0.01),丙泊酚能有效逆转肝脏I/R诱导的大鼠抗氧化水平的降低(与I/R组比较,MDA水平降低28%,SOD及CAT水平分别升高1.52及1.95倍,p<0.01)。I/R组大鼠肝脏组织中TNF-α及IL-6含量显著高于对照组(分别约升高3.38及3.77倍,p<0.01),而IL-10及TGF-β的浓度显著低于对照组(分别约降低3.14及2.43倍,p<0.01),丙泊酚预处理能有效逆转上述炎症因子的分泌(p<0.01)。丙泊酚预处理能通过促进caspase-3蛋白表达同时抑制Bcl-2蛋白表达而减轻I/R诱导的大鼠肝脏组织细胞凋亡。3.丙泊酚预处理能显著减轻I/R诱导的肝移植患者肝脏的损伤(与NPC组比较,PPC组患者肝脏病理评分约降低19.2%,p<0.01)。手术结束、术后6h、24h、2dPPC组患者血清ALT及AST水平显著低于NPC组(p<0.05),术后24h内PPC组患者PT显著低于NPC组(p<0.05),术后6h、2d、3d、5dPPC组患者TBIL也显著低于NPC组(p<0.05)。灌注后3h、术后1天,PPC组患者血清MDA水平显著低于NPC组(p<0.01),灌注后3hPPC组患者血清H202水平也显著低于NPC组(p<0.01)。[结论]1.丙泊酚预处理能通过抑制肝脏I/R诱导的细胞线粒体损伤,促进能量代谢恢复,上调细胞抗氧化水平,减轻脂质过氧化反应,调节凋亡相关蛋白的表达,同时减轻肝脏炎症反应,从而促进肝细胞增殖,降低细胞凋亡,最终减轻肝脏损伤并促进肝脏功能恢复